聚合酶链反应和原位杂交检测成人肾炎肾组织HBV DNA*
作者：黄朝兴 俞康 吴淑珍
单位：黄朝兴 温州医学院附属第一医院肾内科(325000)；俞康 温州医学院附属第一医院血液研究室；吴淑珍 温州医学院分子生物中心(325003)
关键词：乙型肝炎病毒DNA；聚合酶链反应；原位杂交；肾小球肾炎
温州医学院学报/990404 摘 要 目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)感染与成人肾小球肾炎(肾炎)之间的联系，及研究HBV对肾脏的致病作用。方法 应用聚合酶链反应(PCR)和原位杂交(ISH)技术检测39例血清HBV标志物阳性的成人肾炎患者肾活检组织HBV DNA的存在状态。结果 用PCR法测定肾活检组织抽提物HBV DNA 17/39例阳性(43.6%)，其中5例PCR阳性者再用地高辛素标记的HBV DNA探针原位杂交，测定肾活检石腊包埋切片HBV DNA阳性3例(60%)。HBV DNA阳性信号最常见于肾小管上皮细胞和肾小球系膜细胞，呈核型或胞浆型。结论 部分血清HBV标志物阳性的成人肾炎患者肾组织存在HBV DNA，提示HBV感染与其肾炎发病有关，HBV可能对肾脏有直接致病作用。
, http://www.100md.com
Detection of HBV DNA in kidney by using
polymerase chain reaction and in situ hybridization
Huang Zhaoxing,Yu Kang,Wu Shuzhen.
Department of nephrlogy,1st affiliated hospital,Wenzhou Medical College,325027
Abstract Objective To clarify the relationships between hepatitis B virus (HBV) infection and glomerulonephritis(GN) in adults,and explore the pathogenic role HBV DNA plays in kidney tissue.Methods To detect HBV DNA in renal biopsy tissue from 41 GN adults with positive serum HBV marker by polymerase chain reaction (PCR) and by using in situ hybridization (ISH) with digoxigenin labelled probes.Results By PCR,17 out of 41 patients (41.5%) were positive,and 5 out of these patients were detected by ISH with positive rate of 60%(3 cases).By ISH,HBV DNA positive particles were most widely distributed in epithelial cell of renal tubule and glomerular mesangial cell in the form of nucleus and cytoplasm.Conclusion HBV DNA existed in renal tissue in GN adults with positive serum HBV marker,suggesting etiological relation to HBV infection in these patients,and renal lesions due to HBV may be the direct outcome of HBV invasion.
, 百拇医药
Key words Hepatitis B virus DNA Polymerase chain reaction In situ hybridization Glomerulonephritis
成人乙型肝炎病毒相关性肾炎是否存在这一问题人们至今尚未达成一致意见，HBV是否对肾脏有直接作用也存在争议。我们应用原位杂交(ISH)技术检测肾组织HBV DNA，以往国内均获阴性结果[1]，近期已有一些阳性结果[2～5]。也有人应用聚合酶链反应(PCR)技术检测乙型肝炎或小儿肾病患者肾组织HBV DNA获得阳性结果[2,6]。后一种方法尚缺乏对成人肾炎患者的小样本研究。本文采用PCR技术作为筛选方法，检测39例血清HBV标志物阳性的成人肾炎患者肾活检组织抽提物HBV DNA，再对其中阳性病例用地高辛素(Dig)标记的HBV DNA全长段探针或X+C段探针做ISH，检测肾活检石腊包埋切片HBV DNA，探讨HBV感染在成人肾炎发病中的的致病作用。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 研究对象 血清HBV标志物阳性的成人肾小球肾炎患者39例，取自1987年至1996年8月我院肾活检资料。其中男24例，女15例。年龄15～63岁，平均31.4岁。病理类型分布：IgA肾炎(IgNA)10例，膜性肾病(MN)7例，系膜增生性肾炎(MsPGN)5例，局灶节段性肾小球硬化(FSGS)4例，IgM肾病(IgMN)4例，局灶增殖性肾炎(FPGN)3例，微小病变(MCD)5例，硬化性肾炎(SGN)1例。
1.2 血清HBV标志物检测 微量免疫吸附法检测血清HBsAg、HBeAg、抗-HBs、抗-HBe和抗-HBc，其中任何一项阳性即可判断为血清HBV标志物阳性。所有病例已排除乙肝疫苗注射史。
1.3 肾活检 ①石腊包埋切片厚度为2～4μm，HE、PAS、PASM和Masson染色。②冰冻切片厚度为5μm，直接免疫荧光法检测IgG、IgA、IgM和补体C3。肾小球肾炎病理分型诊断参照MHO1982分类法。
, 百拇医药
1.4 PCR检测肾组织抽提物HBV DNA 从肾活检石腊包埋组织或新鲜冰冻组织切块取20μm厚的薄片数张，经二甲苯脱腊(新鲜冰冻组织跳过此步)，无水乙醇漂洗，沉淀晾干后加入100μl消化液，phenol抽取，CHCL-IAA提取，乙醇沉淀，溶于100μl TE溶液中，取10μl用于PCR。HBV引物为：5’-GCTTTG-GGCATGGACATTGACCCGTATAA-3’；5’-CTGACTACTAAT5TCCCTGGATGCTGGGTCT
-3’。
4例血清HBV标志物阴性的肾炎肾活检标本(MCD 2例、MN 1例、MsPGN 1例)用于阴性对照。
1.5 ISH检测肾组织HBV DNA ①试剂：随机引物法标记的Dig-HBV DNA全长段(3.2kb)探针购自北京病毒学研究所肝炎室。PCR法标记的Dig-HBV DNA X+C段(364bp)探针购自北京市肝炎研究所，核苷酸序列：X-C区1878 1856位，X-前C区1514 1534位。Dig核酸检测试剂盒购自德国宝灵曼公司。②方法：在肾活检石腊包埋切片上行ISH法。ISH步骤见文献[7]。试验设乙肝肝组织为阳性对照片和血液HBV标记物阴性的肾移植供肾组织为阴性对照片，以不含探针和预杂交液或Dig-PBR 328 DNA探针或未标记的HBV DNA探针代替目的探针杂交作为试验阴性对照。
, 百拇医药
2 结果
2.1 PCR检测肾组织抽提物HBV DNA 39例血清HBV标志物阳性的肾炎患者肾活检抽提物PCR检查HBV DNA阳性17例(43.6%)，4例阴性对照均阴性。17例阳性中，标本来自石腊包埋组织12例，新鲜冰冻组织5例。病理类型分布：MsPGN 5例，IgAN 5例，FSGS 2例，FRGN 2例，IgMN 1例，MN 1例，SGN 1例(见表1及图1)。
图1 PCR检测肾活检组织抽提物HBV DNA
2.2 ISH检测肾组织HBV DNA 肾组织抽提物PCR检查HBV DNA阳性中的5例，用Dig-HBV DNA X+CN段探针或全长段探针原位杂交，测定肾组织石腊包埋切片HBV DNA阳性3例(60%)。肾组织HBV DNA阳性信号呈弥漫性分布于肾小管上皮细胞和肾小球系膜细胞，呈核型或胞浆型，见图2、3及附表。ISH阳性对照片均阳性，阴性对照片均阴性。所有试验阴性对照均阴性。
, 百拇医药
附表 PCR和ISH检测成人肾组织HBV DNA的存在状态 性
别
年
龄
病理
类型
血清HBV
HB-Ag
s e
标志物
抗-HB
s e c
肾组织HBV
, 百拇医药
PCR
DNA检测
ISH
女
22
IgAN
+ +
- - +
+ △△
+*
女
16
IgAN
, 百拇医药
- -
+ - -
+ △△
+*
男
37
MN
+ -
- - +
+ △
-*
男
17
, http://www.100md.com
IgAN
+ -
- - +
+ △
-*
男
47
MsPGN
+ -
- - +
+ △
+**
男
, 百拇医药
18
FPGN
+ ND
ND ND ND
+ △
男
18
MsPGN
+ ND
ND ND ND
+ △
男
43
, 百拇医药
FSGS
- -
+ - -
+ △
男
44
FPGN
+ -
- - +
+ △
男
50
MCD
, http://www.100md.com
+ ND
ND ND ND
+ △
男
27
MsPGN
+ ND
ND ND ND
+ △
男
30
MsPGN
+ -
, http://www.100md.com
- - +
+ △
女
28
MsPGN
+ -
- - +
+ △△
女
41
IgAN
+ +
- - +
, 百拇医药
+ △△
女
18
IgAN
+ +
- - +
+ △△
女
17
IgMN
+ +
- - -
+ △
, 百拇医药
男
17
SGN
+ ND
ND ND ND
+ △
合计
15 4
2 9
17
3
注：+：阳性，-：阳性，ND：未检；△：石腊包埋组织，△△：新鲜冰冻组织；*：x+c段探针；**：全长段探针。
, 百拇医药
图2 HBV-GN，用Dig-HBV DNAx+c段探针ISH，显示HBV DNA阳性信号位于肾小管上皮细胞核(40×10)
图3 乙型肝炎，用Dig-HBV DNAx+c段探针ISH，显示HBV
DNA阳性信号呈多灶性分布于肝细胞核(20×10)
3 讨论
动物试验已证实HBV可以在包括肾脏在内的多种肝外组织复制。在关于携带HBV的肾炎患者肾组织HBV DNA检测的临床研究中，较多地采用ISH法，而PCR技术应用较少。ISH的优点是可明确HBV DNA的组织和细胞学定位，缺点是重复性差，有时可出现假阳性结果，并且无法说明HBV DNA的存在状态。我们通常在ISH之前先做斑点杂交或Southern印迹杂交等筛选检查。PCR方法的优点是灵敏，但无法定位，也无法了解病毒DNA属整合型还是游离型，故较少用于肾组织HBV DNA检测的研究。我们考虑到ISH和PCR的优点具有互补性，故将二者结合应用。结果证实携带HBV的成人肾炎部分患者肾组织中确有HBV DNA存在，说明部分成人肾炎发病与HBV感染有关，支持HBV可能对肾脏有直接致病作用的观点。同时，也提示PCR技术能反映肾组织HBV DNA的存在状态，可代替斑点杂交和Southern印迹杂交作为一种筛选检查。
, 百拇医药
至今，国内诊断乙肝病毒相关性肾炎(HBV-GN)尚依赖于免疫病理技术检测肾组织HBV抗原，特别是对成人患者更是如此。用分子生物学技术检测肾组织HBV DNA的研究，已为临床诊断HBV-GN提供了新的依据。本文表明应用PCR和ISH检测肾组织HBV DNA可获得较好结果。鉴于PCR技术的应用已在基层单位普及，ISH也不需要特殊仪器，因此，该方法便于推广应用，具有一定的实用价值。
*浙江省卫生厅1996年科研基金资助课题
参考文献
1 中华内科杂志编委会.乙型肝炎病毒相关性肾炎座谈会纪要.中华内科杂志，1990，29∶519
2 郎振为，肖桂兰，阎惠平等.应用聚合酶链反应检测乙肝患者肾组织中的HBV DNA.中华肾脏病杂志，1995，11∶2
3 冯江敏，周希静，任青等.用原位核酸杂交技术探讨乙型肝炎病毒对肾组织的致病作用.中华肾脏病杂志，1995，11∶107
, 百拇医药
4 Y-E Zhang,X ma,L Fang,et al.The existence and significance of hepatitis B virus DNA in glomerulonephritis.Nephrology,1996,2∶119
5 张爱平，张训，侯凡凡等.原位杂交和原位聚合酶链反应检测肾脏HBV DNA的存在.中华肾脏病学杂志，1996，12∶273
6 马路，周柱亮，杨琪等.聚合酶链反应检测小儿肾病患者肾组织中相关病毒基因的表达.中华肾脏病杂志，1998，15∶114
7 马学玲，杜卫东，阎惠平等.地高辛标记HBV DNA探针原位分子杂交技术.临床与实验病理杂志，1996，12∶84～86
(收稿：1999-06-01，修回：1999-09-03), 百拇医药
单位：黄朝兴 温州医学院附属第一医院肾内科(325000)；俞康 温州医学院附属第一医院血液研究室；吴淑珍 温州医学院分子生物中心(325003)
关键词：乙型肝炎病毒DNA；聚合酶链反应；原位杂交；肾小球肾炎
温州医学院学报/990404 摘 要 目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)感染与成人肾小球肾炎(肾炎)之间的联系，及研究HBV对肾脏的致病作用。方法 应用聚合酶链反应(PCR)和原位杂交(ISH)技术检测39例血清HBV标志物阳性的成人肾炎患者肾活检组织HBV DNA的存在状态。结果 用PCR法测定肾活检组织抽提物HBV DNA 17/39例阳性(43.6%)，其中5例PCR阳性者再用地高辛素标记的HBV DNA探针原位杂交，测定肾活检石腊包埋切片HBV DNA阳性3例(60%)。HBV DNA阳性信号最常见于肾小管上皮细胞和肾小球系膜细胞，呈核型或胞浆型。结论 部分血清HBV标志物阳性的成人肾炎患者肾组织存在HBV DNA，提示HBV感染与其肾炎发病有关，HBV可能对肾脏有直接致病作用。
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Detection of HBV DNA in kidney by using
polymerase chain reaction and in situ hybridization
Huang Zhaoxing,Yu Kang,Wu Shuzhen.
Department of nephrlogy,1st affiliated hospital,Wenzhou Medical College,325027
Abstract Objective To clarify the relationships between hepatitis B virus (HBV) infection and glomerulonephritis(GN) in adults,and explore the pathogenic role HBV DNA plays in kidney tissue.Methods To detect HBV DNA in renal biopsy tissue from 41 GN adults with positive serum HBV marker by polymerase chain reaction (PCR) and by using in situ hybridization (ISH) with digoxigenin labelled probes.Results By PCR,17 out of 41 patients (41.5%) were positive,and 5 out of these patients were detected by ISH with positive rate of 60%(3 cases).By ISH,HBV DNA positive particles were most widely distributed in epithelial cell of renal tubule and glomerular mesangial cell in the form of nucleus and cytoplasm.Conclusion HBV DNA existed in renal tissue in GN adults with positive serum HBV marker,suggesting etiological relation to HBV infection in these patients,and renal lesions due to HBV may be the direct outcome of HBV invasion.
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Key words Hepatitis B virus DNA Polymerase chain reaction In situ hybridization Glomerulonephritis
成人乙型肝炎病毒相关性肾炎是否存在这一问题人们至今尚未达成一致意见，HBV是否对肾脏有直接作用也存在争议。我们应用原位杂交(ISH)技术检测肾组织HBV DNA，以往国内均获阴性结果[1]，近期已有一些阳性结果[2～5]。也有人应用聚合酶链反应(PCR)技术检测乙型肝炎或小儿肾病患者肾组织HBV DNA获得阳性结果[2,6]。后一种方法尚缺乏对成人肾炎患者的小样本研究。本文采用PCR技术作为筛选方法，检测39例血清HBV标志物阳性的成人肾炎患者肾活检组织抽提物HBV DNA，再对其中阳性病例用地高辛素(Dig)标记的HBV DNA全长段探针或X+C段探针做ISH，检测肾活检石腊包埋切片HBV DNA，探讨HBV感染在成人肾炎发病中的的致病作用。
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1 材料和方法
1.1 研究对象 血清HBV标志物阳性的成人肾小球肾炎患者39例，取自1987年至1996年8月我院肾活检资料。其中男24例，女15例。年龄15～63岁，平均31.4岁。病理类型分布：IgA肾炎(IgNA)10例，膜性肾病(MN)7例，系膜增生性肾炎(MsPGN)5例，局灶节段性肾小球硬化(FSGS)4例，IgM肾病(IgMN)4例，局灶增殖性肾炎(FPGN)3例，微小病变(MCD)5例，硬化性肾炎(SGN)1例。
1.2 血清HBV标志物检测 微量免疫吸附法检测血清HBsAg、HBeAg、抗-HBs、抗-HBe和抗-HBc，其中任何一项阳性即可判断为血清HBV标志物阳性。所有病例已排除乙肝疫苗注射史。
1.3 肾活检 ①石腊包埋切片厚度为2～4μm，HE、PAS、PASM和Masson染色。②冰冻切片厚度为5μm，直接免疫荧光法检测IgG、IgA、IgM和补体C3。肾小球肾炎病理分型诊断参照MHO1982分类法。
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1.4 PCR检测肾组织抽提物HBV DNA 从肾活检石腊包埋组织或新鲜冰冻组织切块取20μm厚的薄片数张，经二甲苯脱腊(新鲜冰冻组织跳过此步)，无水乙醇漂洗，沉淀晾干后加入100μl消化液，phenol抽取，CHCL-IAA提取，乙醇沉淀，溶于100μl TE溶液中，取10μl用于PCR。HBV引物为：5’-GCTTTG-GGCATGGACATTGACCCGTATAA-3’；5’-CTGACTACTAAT5TCCCTGGATGCTGGGTCT
-3’。
4例血清HBV标志物阴性的肾炎肾活检标本(MCD 2例、MN 1例、MsPGN 1例)用于阴性对照。
1.5 ISH检测肾组织HBV DNA ①试剂：随机引物法标记的Dig-HBV DNA全长段(3.2kb)探针购自北京病毒学研究所肝炎室。PCR法标记的Dig-HBV DNA X+C段(364bp)探针购自北京市肝炎研究所，核苷酸序列：X-C区1878 1856位，X-前C区1514 1534位。Dig核酸检测试剂盒购自德国宝灵曼公司。②方法：在肾活检石腊包埋切片上行ISH法。ISH步骤见文献[7]。试验设乙肝肝组织为阳性对照片和血液HBV标记物阴性的肾移植供肾组织为阴性对照片，以不含探针和预杂交液或Dig-PBR 328 DNA探针或未标记的HBV DNA探针代替目的探针杂交作为试验阴性对照。
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2 结果
2.1 PCR检测肾组织抽提物HBV DNA 39例血清HBV标志物阳性的肾炎患者肾活检抽提物PCR检查HBV DNA阳性17例(43.6%)，4例阴性对照均阴性。17例阳性中，标本来自石腊包埋组织12例，新鲜冰冻组织5例。病理类型分布：MsPGN 5例，IgAN 5例，FSGS 2例，FRGN 2例，IgMN 1例，MN 1例，SGN 1例(见表1及图1)。
图1 PCR检测肾活检组织抽提物HBV DNA
2.2 ISH检测肾组织HBV DNA 肾组织抽提物PCR检查HBV DNA阳性中的5例，用Dig-HBV DNA X+CN段探针或全长段探针原位杂交，测定肾组织石腊包埋切片HBV DNA阳性3例(60%)。肾组织HBV DNA阳性信号呈弥漫性分布于肾小管上皮细胞和肾小球系膜细胞，呈核型或胞浆型，见图2、3及附表。ISH阳性对照片均阳性，阴性对照片均阴性。所有试验阴性对照均阴性。
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附表 PCR和ISH检测成人肾组织HBV DNA的存在状态 性
别
年
龄
病理
类型
血清HBV
HB-Ag
s e
标志物
抗-HB
s e c
肾组织HBV
, 百拇医药
PCR
DNA检测
ISH
女
22
IgAN
+ +
- - +
+ △△
+*
女
16
IgAN
, 百拇医药
- -
+ - -
+ △△
+*
男
37
MN
+ -
- - +
+ △
-*
男
17
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IgAN
+ -
- - +
+ △
-*
男
47
MsPGN
+ -
- - +
+ △
+**
男
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18
FPGN
+ ND
ND ND ND
+ △
男
18
MsPGN
+ ND
ND ND ND
+ △
男
43
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FSGS
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+ △
男
44
FPGN
+ -
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+ △
男
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MCD
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+ ND
ND ND ND
+ △
男
27
MsPGN
+ ND
ND ND ND
+ △
男
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MsPGN
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女
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IgAN
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+ △△
女
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IgMN
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+ △
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17
SGN
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ND ND ND
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合计
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注：+：阳性，-：阳性，ND：未检；△：石腊包埋组织，△△：新鲜冰冻组织；*：x+c段探针；**：全长段探针。
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图2 HBV-GN，用Dig-HBV DNAx+c段探针ISH，显示HBV DNA阳性信号位于肾小管上皮细胞核(40×10)
图3 乙型肝炎，用Dig-HBV DNAx+c段探针ISH，显示HBV
DNA阳性信号呈多灶性分布于肝细胞核(20×10)
3 讨论
动物试验已证实HBV可以在包括肾脏在内的多种肝外组织复制。在关于携带HBV的肾炎患者肾组织HBV DNA检测的临床研究中，较多地采用ISH法，而PCR技术应用较少。ISH的优点是可明确HBV DNA的组织和细胞学定位，缺点是重复性差，有时可出现假阳性结果，并且无法说明HBV DNA的存在状态。我们通常在ISH之前先做斑点杂交或Southern印迹杂交等筛选检查。PCR方法的优点是灵敏，但无法定位，也无法了解病毒DNA属整合型还是游离型，故较少用于肾组织HBV DNA检测的研究。我们考虑到ISH和PCR的优点具有互补性，故将二者结合应用。结果证实携带HBV的成人肾炎部分患者肾组织中确有HBV DNA存在，说明部分成人肾炎发病与HBV感染有关，支持HBV可能对肾脏有直接致病作用的观点。同时，也提示PCR技术能反映肾组织HBV DNA的存在状态，可代替斑点杂交和Southern印迹杂交作为一种筛选检查。
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至今，国内诊断乙肝病毒相关性肾炎(HBV-GN)尚依赖于免疫病理技术检测肾组织HBV抗原，特别是对成人患者更是如此。用分子生物学技术检测肾组织HBV DNA的研究，已为临床诊断HBV-GN提供了新的依据。本文表明应用PCR和ISH检测肾组织HBV DNA可获得较好结果。鉴于PCR技术的应用已在基层单位普及，ISH也不需要特殊仪器，因此，该方法便于推广应用，具有一定的实用价值。
*浙江省卫生厅1996年科研基金资助课题
参考文献
1 中华内科杂志编委会.乙型肝炎病毒相关性肾炎座谈会纪要.中华内科杂志，1990，29∶519
2 郎振为，肖桂兰，阎惠平等.应用聚合酶链反应检测乙肝患者肾组织中的HBV DNA.中华肾脏病杂志，1995，11∶2
3 冯江敏，周希静，任青等.用原位核酸杂交技术探讨乙型肝炎病毒对肾组织的致病作用.中华肾脏病杂志，1995，11∶107
, 百拇医药
4 Y-E Zhang,X ma,L Fang,et al.The existence and significance of hepatitis B virus DNA in glomerulonephritis.Nephrology,1996,2∶119
5 张爱平，张训，侯凡凡等.原位杂交和原位聚合酶链反应检测肾脏HBV DNA的存在.中华肾脏病学杂志，1996，12∶273
6 马路，周柱亮，杨琪等.聚合酶链反应检测小儿肾病患者肾组织中相关病毒基因的表达.中华肾脏病杂志，1998，15∶114
7 马学玲，杜卫东，阎惠平等.地高辛标记HBV DNA探针原位分子杂交技术.临床与实验病理杂志，1996，12∶84～86
(收稿：1999-06-01，修回：1999-09-03), 百拇医药