癫痫患儿PBMC分泌IL-10、IFN-γ的研究
作者：何大可 胡鸿文
单位：温州医学院附属育英儿童医院神经科(325027)
关键词：癫痫；白细胞介素-10；干扰素-γ
温州医学院学报/990402 摘要 目的 探讨癫痫与细胞因子之间的关系。方法 应用ELISA方法测定了53例癫痫患儿(其中20例服用PB，13例服用CBZ，20例未服药)及16例对照的外周血单个核细胞分泌的白细胞介素-10(IL-10)及干扰素-γ(IFN-γ)。结果 IL-10、IFN-γ显著高于对照组(P<0.01)，并且两者呈正相关(rs=0.6202，P<0.001)，IL-10/IFN-γ的比值降低，上述各项指标与患儿是否服药无关。结论 癫痫患儿处于免疫调节网络失衡状态，IFN-γ可能参与了惊厥的发生，而IL-10起负反馈调节的作用。
The study of the IL-10、IFN-γ production in peripheral
, 百拇医药
blood mononuclear cells from children with epilepsy
He Dake,Hu Hongwen.
Department of Neurology,Children's Hospital Affiliated to Wenzhou Medical College，Wenzhou,Zhejiang,China ，325027.E-mail:hedake @ 188.net
Abstract Objective To explore the relation between epilepsy and cytokines.Methods Interlukin-10(IL-10)、interferon-γ(IFN-γ)secreted by peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from 53 children with epilepsy (20 with PB,13 with CBZ,20 without medication)and 16 controls were examined.Results IL-10、IFN-γ increased respectively(P<0.01) as compared with those of the control group,irrelevant to anticonvulsant treatment.The patients had lower ratio to IL-10/IFN-γ.Furthermore,IFN-γ was positively related to IL-10(rs=0.6202,P<0.001).Conclusion The network of epilepsy immuno-regulation was in a status of imbalance,and cytokines may play a role in pathogensis of epilepsy.
, 百拇医药
Key words Epilepsy Interlukin-10 Interferon-γ
自Walker[1]1969年提出癫痫(epilepsy,Ep)的免疫学发病机制以来，国内外学者进行了大量的研究。近年来随着对细胞因子的进一步研究，发现细胞因子网络的研究有助于更深入了解癫痫的发病机制。本研究全部选择特发性全身性强直和(或)阵挛性发作Ep患儿作为研究对象，分为服用苯巴比妥(PB)、CBZ及未服药三组，测定其PBMC在植物血凝素(PHA)作用下分泌IL-10和IFN-γ，其中对Ep患儿服药前后PBMC产生的IL-10的测定，国内外尚未见报道，且关于Ep患儿IFN-γ的研究也未见报道。
1 材料和方法
1.1 研究对象
1.1.1 患儿组：53例Ep患儿均来自1998年6月至1998年12月间本院附属育英儿童医院神经内科专科门诊。根据临床表现，脑电图记录确诊为Ep，均为特发性全身性强直和(或)阵挛性发作。其中男30例，女23例，年龄2～16岁，平均8.5±3.2岁。病程3天～11年。服药组为单药治疗，服用PB 20例，服用CBZ 13例，血药浓度均在治疗范围内。20例从未服用任何抗癫痫药(antiepileptic drugs,AEDs)。
, 百拇医药
1.1.2 对照组：16例来自本院附属儿童医院外科的腹股沟斜疝、唇裂等非感染性、肿瘤性或神经系统疾病的住院患儿，均未服用AEDs。男8例，女8例，年龄4～13岁，平均8.1±3.5岁。
所有Ep患儿及对照组均无影响免疫功能的其他疾病，血常规检查白细胞计数均不超过10×109/L。
1.2 标本采集 所有标本均于门诊或入院次晨空腹取静脉血3ml以12.5u/ml无菌肝素按9∶1(V/V)抗凝于无菌管中待用。
1.3 试剂来源及主要仪器设备
1.3.1 IL-10、IFN-γ试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司。批号分别为：010817，010930。
1.3.2 淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypaque)购自上海细胞生物技术研究所，r=1.077。
, 百拇医药
1.3.3 RPM1640培养基：美国GIBC公司产品。
1.3.4 PHA购自中科院生化所(上海东风生化技术公司)。
1.3.5 系列低温冰箱及3111系列CO2培养箱：美国FORMA公司生产。
1.3.6 ELX808酶标仪：美国BIO-TEK公司产品。
1.4 试验方法
1.4.1 PBMC分离和培养：取患儿外周静脉血3ml，肝素抗凝(12.5u/ml)，缓慢加入淋巴细胞分离液表面，2000r/min离心20分钟，小心吸取PBMC层于另一试管中，用RPMI-1640培养液(含10%小牛血清)洗3次，调整细胞为2×105/ml，加入PHA，终浓度为100μg/ml，于24孔培养板在37℃，5% CO2下培养24小时，离心，取上清液贮存于-70℃冰箱，待标本收齐后一次性测定。
, 百拇医药
1.4.2 IL-10、IFN-γ的测定(PBMC上清液)用ELISA法：严格按照试剂盒说明书的步骤进行。
1.5 统计学处理 (应用统计软件SPSS9.0)采用单因素方差分析和Dunnett检验。相关分析采用Spearman等级相关法。
2 实验结果
2.1 PBMC释放IL-10、IFN-γ测定结果(见附表)
附表 Ep患儿PBMC释放IL-10、IFN-γ、IL-10/IFN-γ测定结果(pg/ml)(
±s) 组 别
n
IL-10
, 百拇医药
IFN-γ
IL-10/IFN-γ
对 照
16
60.81±1.90
1.82±1.62
33.42±5.59
未治疗
20
87.10±2.45**
6.98±2.37**
, 百拇医药
12.48±3.86**
PB
20
93.97±3.30**
7.40±2.03**
13.35±3.09**
CBZ
13
99.77±2.91**
5.84±2.94**
, 百拇医药
17.08±4.89**
与对照组比：**P<0.01
患儿组PBMC分泌的IL-10、IFN-γ显著高于对照组，IL-10/IFN-γ比值显著降低(P<0.01)，上述各项指标于各组癫痫患儿之间差异不明显。
2.2 Ep患儿PBMC释放IL-10与IFN-γ相关性分析 结果显示，Ep患儿PBMC培养上清液中IL-10与IFN-γ水平呈正相关，n=53,rs=0.6202,P<0.001。
3 讨论
中枢神经系统(central nervous system,CNS)和免疫系统之间通过细胞因子和神经递质存在着广泛联系。细胞因子是神经—内分泌—免疫网络信息交流的关键分子。一方面CNS各类组织细胞可产生多种细胞因子，并表达多种细胞因子受体，作为免疫性神经介质直接影响脑细胞功能，并参与某些CNS疾病的发生发展。另一方面，CNS疾病也可通过不同机制影响各类细胞因子的表达[2]。
, 百拇医药
干扰素因具有诱导抗病毒免疫反应的能力而被发现，它分为两种类型。IFN-γ是Ⅱ型干扰素，又称免疫干扰素。它由Th细胞中的Th1亚型产生。在病理情况下，免疫活性细胞产生或诱生IFN-γ的功能异常，往往伴随着机体免疫功能紊乱[3]。本研究结果显示，Ep患者T淋巴细胞产生IFN-γ的能力明显增强，表明患者外周血中几种细胞群被活化或处于分化阶段，而IFN-γ可通过自分泌或旁分泌的方式进一步促进细胞因子调节网络失衡[3]。Ep患者分泌的高水平的IFN-γ可能是Ep发生发展的重要因素之一，因为IFN-γ可以促进血管内皮细胞HLA-DR抗原的表达，参与免疫介导的病理过程，损伤血脑屏障，使局部神经元易受血液中兴奋性物质的影响[4]。而且IFN-γ可使海马CA3锥体细胞发生痫性放电，IFN-γ减少突触前抑制，降低γ-氨基丁酸的合成或锥体细胞对GABA的突触敏感性，因此认为IFN-γ参与了惊厥的发生[5]。
1989年，美国DNAX研究所Fiorentino等发现Th2细胞能产生一种细胞因子合成抑制因子[6]，后被命名为IL-10，它能有效地抑制Th1细胞株的一系列后期合成的细胞因子在mRNA水平的合成，如IFN-γ、IL-2等；IL-10还可通过负反馈调节单核细胞的MHC-Ⅱ类抗原，抑制单核细胞的抗原呈递能力，从而阻止抗原特异性T细胞的增殖[7]。本实验发现IL-10在Ep患儿中有显著性升高，且与IFN-γ呈正相关，IL-10与IFN-γ两者比值降低，说明患儿体内以IFN-γ增高为主，IL-10的升高是机体负反馈调节的结果。
, http://www.100md.com
综上所述，Ep患儿PBMC释放IL-10、IFN-γ水平升高，两者呈正相关，且IL-10/IFN-γ比值降低，且与是否服药无关，说明Ep患儿存在细胞因子免疫调节网络失衡的内在因素，IFN-γ可能参与了惊厥的发生，而IL-10起负反馈调节的作用。
E-mail:hedake @ 188.net
参考文献
1 Walker AE.Allergic phenomenon as basic mechanisms in epilepsy.London：Churchill,1969.812
2 Plata-Salam CR.Immunoregulators in the nervous system.Neurosci Biobehabv Rev,1991.15∶185
, 百拇医药
3 Vyakrnam A,Materr P,Meager A,et al.Altered production of tumor necrosis factors alpha and beta and interferon-gamma by HIV-infected individuals.J Exp Immunol,1991,84(1)∶109
4 Mccarron RM,Mang L,Cowan EP,et al.Class Ⅱ MHC antigen expression by cultured human cerebral vascular endothelial cells.Brain Res,1991,566(1～2)∶325
5 Muller M,Fontana A,Zbinden G,et al.Effects of interferons and hydrogen peroxide on CD3 pyramidal cells in rat hippocampal slice cultures.Brain Res,1993,619(1～2)∶325
6 Fiorentino DF,Bond MW,Mosmann TR.Two types of mouse T helper cell,Ⅳ：Th2 clones secrete a factor that inhibits cytokine production by Th1 clones.J Exp Med,1989,170∶2081
7 Mosmann TR.Properties and functions of interleukin-10.Adv Immunol,1994,56∶1
(收稿：1999-07-13，修回：1999-09-16), 百拇医药
单位：温州医学院附属育英儿童医院神经科(325027)
关键词：癫痫；白细胞介素-10；干扰素-γ
温州医学院学报/990402 摘要 目的 探讨癫痫与细胞因子之间的关系。方法 应用ELISA方法测定了53例癫痫患儿(其中20例服用PB，13例服用CBZ，20例未服药)及16例对照的外周血单个核细胞分泌的白细胞介素-10(IL-10)及干扰素-γ(IFN-γ)。结果 IL-10、IFN-γ显著高于对照组(P<0.01)，并且两者呈正相关(rs=0.6202，P<0.001)，IL-10/IFN-γ的比值降低，上述各项指标与患儿是否服药无关。结论 癫痫患儿处于免疫调节网络失衡状态，IFN-γ可能参与了惊厥的发生，而IL-10起负反馈调节的作用。
The study of the IL-10、IFN-γ production in peripheral
, 百拇医药
blood mononuclear cells from children with epilepsy
He Dake,Hu Hongwen.
Department of Neurology,Children's Hospital Affiliated to Wenzhou Medical College，Wenzhou,Zhejiang,China ，325027.E-mail:hedake @ 188.net
Abstract Objective To explore the relation between epilepsy and cytokines.Methods Interlukin-10(IL-10)、interferon-γ(IFN-γ)secreted by peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from 53 children with epilepsy (20 with PB,13 with CBZ,20 without medication)and 16 controls were examined.Results IL-10、IFN-γ increased respectively(P<0.01) as compared with those of the control group,irrelevant to anticonvulsant treatment.The patients had lower ratio to IL-10/IFN-γ.Furthermore,IFN-γ was positively related to IL-10(rs=0.6202,P<0.001).Conclusion The network of epilepsy immuno-regulation was in a status of imbalance,and cytokines may play a role in pathogensis of epilepsy.
, 百拇医药
Key words Epilepsy Interlukin-10 Interferon-γ
自Walker[1]1969年提出癫痫(epilepsy,Ep)的免疫学发病机制以来，国内外学者进行了大量的研究。近年来随着对细胞因子的进一步研究，发现细胞因子网络的研究有助于更深入了解癫痫的发病机制。本研究全部选择特发性全身性强直和(或)阵挛性发作Ep患儿作为研究对象，分为服用苯巴比妥(PB)、CBZ及未服药三组，测定其PBMC在植物血凝素(PHA)作用下分泌IL-10和IFN-γ，其中对Ep患儿服药前后PBMC产生的IL-10的测定，国内外尚未见报道，且关于Ep患儿IFN-γ的研究也未见报道。
1 材料和方法
1.1 研究对象
1.1.1 患儿组：53例Ep患儿均来自1998年6月至1998年12月间本院附属育英儿童医院神经内科专科门诊。根据临床表现，脑电图记录确诊为Ep，均为特发性全身性强直和(或)阵挛性发作。其中男30例，女23例，年龄2～16岁，平均8.5±3.2岁。病程3天～11年。服药组为单药治疗，服用PB 20例，服用CBZ 13例，血药浓度均在治疗范围内。20例从未服用任何抗癫痫药(antiepileptic drugs,AEDs)。
, 百拇医药
1.1.2 对照组：16例来自本院附属儿童医院外科的腹股沟斜疝、唇裂等非感染性、肿瘤性或神经系统疾病的住院患儿，均未服用AEDs。男8例，女8例，年龄4～13岁，平均8.1±3.5岁。
所有Ep患儿及对照组均无影响免疫功能的其他疾病，血常规检查白细胞计数均不超过10×109/L。
1.2 标本采集 所有标本均于门诊或入院次晨空腹取静脉血3ml以12.5u/ml无菌肝素按9∶1(V/V)抗凝于无菌管中待用。
1.3 试剂来源及主要仪器设备
1.3.1 IL-10、IFN-γ试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司。批号分别为：010817，010930。
1.3.2 淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypaque)购自上海细胞生物技术研究所，r=1.077。
, 百拇医药
1.3.3 RPM1640培养基：美国GIBC公司产品。
1.3.4 PHA购自中科院生化所(上海东风生化技术公司)。
1.3.5 系列低温冰箱及3111系列CO2培养箱：美国FORMA公司生产。
1.3.6 ELX808酶标仪：美国BIO-TEK公司产品。
1.4 试验方法
1.4.1 PBMC分离和培养：取患儿外周静脉血3ml，肝素抗凝(12.5u/ml)，缓慢加入淋巴细胞分离液表面，2000r/min离心20分钟，小心吸取PBMC层于另一试管中，用RPMI-1640培养液(含10%小牛血清)洗3次，调整细胞为2×105/ml，加入PHA，终浓度为100μg/ml，于24孔培养板在37℃，5% CO2下培养24小时，离心，取上清液贮存于-70℃冰箱，待标本收齐后一次性测定。
, 百拇医药
1.4.2 IL-10、IFN-γ的测定(PBMC上清液)用ELISA法：严格按照试剂盒说明书的步骤进行。
1.5 统计学处理 (应用统计软件SPSS9.0)采用单因素方差分析和Dunnett检验。相关分析采用Spearman等级相关法。
2 实验结果
2.1 PBMC释放IL-10、IFN-γ测定结果(见附表)
附表 Ep患儿PBMC释放IL-10、IFN-γ、IL-10/IFN-γ测定结果(pg/ml)(
±s) 组 别n
IL-10
, 百拇医药
IFN-γ
IL-10/IFN-γ
对 照
16
60.81±1.90
1.82±1.62
33.42±5.59
未治疗
20
87.10±2.45**
6.98±2.37**
, 百拇医药
12.48±3.86**
PB
20
93.97±3.30**
7.40±2.03**
13.35±3.09**
CBZ
13
99.77±2.91**
5.84±2.94**
, 百拇医药
17.08±4.89**
与对照组比：**P<0.01
患儿组PBMC分泌的IL-10、IFN-γ显著高于对照组，IL-10/IFN-γ比值显著降低(P<0.01)，上述各项指标于各组癫痫患儿之间差异不明显。
2.2 Ep患儿PBMC释放IL-10与IFN-γ相关性分析 结果显示，Ep患儿PBMC培养上清液中IL-10与IFN-γ水平呈正相关，n=53,rs=0.6202,P<0.001。
3 讨论
中枢神经系统(central nervous system,CNS)和免疫系统之间通过细胞因子和神经递质存在着广泛联系。细胞因子是神经—内分泌—免疫网络信息交流的关键分子。一方面CNS各类组织细胞可产生多种细胞因子，并表达多种细胞因子受体，作为免疫性神经介质直接影响脑细胞功能，并参与某些CNS疾病的发生发展。另一方面，CNS疾病也可通过不同机制影响各类细胞因子的表达[2]。
, 百拇医药
干扰素因具有诱导抗病毒免疫反应的能力而被发现，它分为两种类型。IFN-γ是Ⅱ型干扰素，又称免疫干扰素。它由Th细胞中的Th1亚型产生。在病理情况下，免疫活性细胞产生或诱生IFN-γ的功能异常，往往伴随着机体免疫功能紊乱[3]。本研究结果显示，Ep患者T淋巴细胞产生IFN-γ的能力明显增强，表明患者外周血中几种细胞群被活化或处于分化阶段，而IFN-γ可通过自分泌或旁分泌的方式进一步促进细胞因子调节网络失衡[3]。Ep患者分泌的高水平的IFN-γ可能是Ep发生发展的重要因素之一，因为IFN-γ可以促进血管内皮细胞HLA-DR抗原的表达，参与免疫介导的病理过程，损伤血脑屏障，使局部神经元易受血液中兴奋性物质的影响[4]。而且IFN-γ可使海马CA3锥体细胞发生痫性放电，IFN-γ减少突触前抑制，降低γ-氨基丁酸的合成或锥体细胞对GABA的突触敏感性，因此认为IFN-γ参与了惊厥的发生[5]。
1989年，美国DNAX研究所Fiorentino等发现Th2细胞能产生一种细胞因子合成抑制因子[6]，后被命名为IL-10，它能有效地抑制Th1细胞株的一系列后期合成的细胞因子在mRNA水平的合成，如IFN-γ、IL-2等；IL-10还可通过负反馈调节单核细胞的MHC-Ⅱ类抗原，抑制单核细胞的抗原呈递能力，从而阻止抗原特异性T细胞的增殖[7]。本实验发现IL-10在Ep患儿中有显著性升高，且与IFN-γ呈正相关，IL-10与IFN-γ两者比值降低，说明患儿体内以IFN-γ增高为主，IL-10的升高是机体负反馈调节的结果。
, http://www.100md.com
综上所述，Ep患儿PBMC释放IL-10、IFN-γ水平升高，两者呈正相关，且IL-10/IFN-γ比值降低，且与是否服药无关，说明Ep患儿存在细胞因子免疫调节网络失衡的内在因素，IFN-γ可能参与了惊厥的发生，而IL-10起负反馈调节的作用。
E-mail:hedake @ 188.net
参考文献
1 Walker AE.Allergic phenomenon as basic mechanisms in epilepsy.London：Churchill,1969.812
2 Plata-Salam CR.Immunoregulators in the nervous system.Neurosci Biobehabv Rev,1991.15∶185
, 百拇医药
3 Vyakrnam A,Materr P,Meager A,et al.Altered production of tumor necrosis factors alpha and beta and interferon-gamma by HIV-infected individuals.J Exp Immunol,1991,84(1)∶109
4 Mccarron RM,Mang L,Cowan EP,et al.Class Ⅱ MHC antigen expression by cultured human cerebral vascular endothelial cells.Brain Res,1991,566(1～2)∶325
5 Muller M,Fontana A,Zbinden G,et al.Effects of interferons and hydrogen peroxide on CD3 pyramidal cells in rat hippocampal slice cultures.Brain Res,1993,619(1～2)∶325
6 Fiorentino DF,Bond MW,Mosmann TR.Two types of mouse T helper cell,Ⅳ：Th2 clones secrete a factor that inhibits cytokine production by Th1 clones.J Exp Med,1989,170∶2081
7 Mosmann TR.Properties and functions of interleukin-10.Adv Immunol,1994,56∶1
(收稿：1999-07-13，修回：1999-09-16), 百拇医药