胰岛素样生长因子-1拮抗高浓度葡萄糖对人腹膜间皮细胞的毒性作用
作者：唐子勇 范敏华 邹万忠
单位：北京医科大学第三医院肾内科，北京 100083 邹万忠：北京医科大学病理学系
关键词：胰岛素样生长因子-1；药理学；腹膜间皮细胞☆；葡萄糖；毒性
北京医科大学学报990115 摘 要 目的：比较胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)和表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)对高浓度葡萄糖的腹膜间皮细胞毒性作用的影响。方法：体外培养人腹膜间皮细胞，在上清中加入83.3 mmol.L-1葡萄糖和不同浓度IGF-1或EGF，培养24、48和72 h后，测定3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入率和上清中乳酸脱氢酶(LDH)水平。结果：50μg.L-1的IGF-1作用72 h后，83.3 mmol.L-1葡萄糖溶液中培养间皮细胞的3H-TdR掺入率较高糖抑制组增加(75±15)%(P<0.01)，作用24h，上清中LDH水平较高糖抑制组减少(34±8)% (P<0.01)；EGF对高糖细胞毒性无明显影响(P>0.05)。结论：IGF-1能拮抗高浓度葡萄糖对人腹膜间皮细胞的毒性作用。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R587
The effect of insulin-like growth factor-1 on the cytotoxicity of high concentration glucose to human peritoneal mesothelial cells
TANG Zi-Yong#, FAN Min-Hua, ZOU Wan-Zhong
(#Department of Nephrology , the Third Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100083)
MeSH Insulin-like growth factor-1/pharmacol Peritoneal mesothelial cells☆ Glucose/tox
, 百拇医药
ABSTRACT Objective: To compare the effect of insulin-like growth factor-1(IGF-1) and epidermal growth factor (EGF) on the cytotoxicity of high concentration glucose to human peritoneal mesothelial cells (HPMCs). Methods: Human peritoneal mesothelial cells were cultured in vitro, and different concentration of IGF-1 or EGF was added to HPMCs that was cultured in RPMI 1640 medium containing 83.3 mmol.L-1 glucose. After 24, 48 and 72 hours, the incorporation of3H-thymidine (3H-TdR) and the concentration of lactate dehydrogenase(LDH) in supernatants were detected. Results: The addition of 50μg.L-1 of IGF-1 to 83.3 mmol.L-1 glucose caused a (75±15)% increase in 3H-TdR incorporation for 72 hours (P<0.01), and a (34±8)% decrease in release of LDH for 24 hours (P<0.01). EGF had no significant influence on the cytotoxicity of high glucose to HPMCs. Conclusion: IGF-1 can reverse the cytotoxicity of high glucose to HPMCs.
, http://www.100md.com
(J Beijing Med Univ, 1999,31:51-54)
腹膜间皮细胞是构成腹膜的重要细胞群体，在保持腹膜结构完整和功能正常中起着重要作用。研究表明，腹膜透析液中的高浓度葡萄糖是非生物相容性的主要因素，对腹膜间皮细胞有明显毒性作用，通过抑制间皮细胞的增殖而干扰其脱落后的再修复过程，间皮细胞丧失是腹膜硬化发生和发展的始动环节。因此， 寻找拮抗高浓度葡萄糖对腹膜间皮细胞毒性作用的方法，对预防腹膜硬化、延长腹膜透析寿命具有重要意义。
胰岛素样生长因子及其受体在细胞生长、分化和损伤后的再修复过程中发挥着重要作用。有人发现，人腹膜间皮细胞上存在胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor, IGF-1)受体，IGF-1在体外能促进腹膜间皮细胞的增殖[1]。人腹膜间皮细胞上也存在表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)受体[2]。本实验建立了人腹膜间皮细胞体外培养模型，比较IGF-1和EGF对间皮细胞的生长促进作用以及两种生长因子对高浓度葡萄糖细胞毒性作用的影响。
, 百拇医药
1 材料与方法
取择期腹部手术病人的大网膜切除标本(n=6)，体外培养人腹膜间皮细胞，同文献[3]方法。大网膜在含1.25g.L-1胰蛋白酶、0.1g.L-1EDTA、1 g.L-1葡萄糖的消化液中，37℃消化20 min，细胞沉淀以含10%(体积分数)胎牛血清的RPMI 1640培养液(Sigma) RPMI重悬，接种入30 cm2、明胶包被的培养瓶，于细胞培养箱中培养，每3天换一次培养液。传代时用含0.5g.L-1胰蛋白酶、0.2g.L-1EDTA的消化液。以倒置显微镜、透射电镜检查,免疫组织化学染色鉴定，免疫组织化学染色采用LSAB法，分别作抗人cytokeratin 和抗人vimentin两种染色。体外培养传代的第3代细胞用于实验。
, 百拇医药
1.1 间皮细胞增殖试验
用10%(体积分数)胎牛血清培养液制成1×105ml-1细胞悬液，加入96孔细胞培养板，每孔100μl。分组：正常对照组；高糖抑制组，含不同质量浓度的葡萄糖；IGF-1刺激组和EGF刺激组，含不同质量浓度的IGF-1或EGF；IGF-1拮抗组和EGF拮抗组，在83.3 mmol.L-1葡萄糖溶液中分别加入不同质量浓度的IGF-1或EGF[1，2]。分别培养24、48、72 h，培养结束前6h，每孔加入1.85×104 Bq的
3 H-TdR。收集细胞，液体闪烁yf 数仪测弱β放射性。
1.2 间皮细胞损伤试验
同上的1×105 ml-1细胞悬液，加入24孔细胞培养板中，每孔500 μl。分组：高糖抑制组，含不同浓度葡萄糖；IGF-1拮抗组和EGF拮抗组，在83.3 mmol.L-1葡萄糖溶液中加入不同质量浓度IGF-1或EGF；对照组为无血清培养。分别培养24、48和72h后，培养结束时收集上清，于全自动生化分析仪上速度法测LDH水平。
, http://www.100md.com
1.3 统计学方法
以上实验均作4个平行孔，取平均值，计算实验值占正常对照的百分数，计对照为100%。同一实验重复6次，结果以
±s表示。先作单因素方差分析，再作非配对组间t检验。
2 实验结果
2.1 人腹膜间皮细胞体外培养的鉴定
倒置显微镜下，细胞汇合后呈密集的铺路卵石样生长。透射电镜下：细胞表面存在大量多少不等、较长的微绒毛。符合腹膜间皮细胞的形态及超微结构特点。免疫组织化学染色结果显示，培养细胞对人cytokeratin和vimentin的反应均为阳性，细胞纯度大于97%。这种双阳性信号只见于间皮细胞，排除了纤维母细胞和上皮细胞污染的可能。另外，可能污染的细胞还有红细胞、白细胞、肥大细胞等，但都不能在体外长时间生存。因此，所培养细胞为高纯度的人腹膜间皮细胞。
, 百拇医药
2.2 高浓度葡萄糖对人腹膜间皮细胞的毒性作用
浓度大于55.6 mmol*L-1的葡萄糖溶液作用48 h以上可明显抑制腹膜间皮细胞的增殖能力。随着葡萄糖浓度的增加和培养时间的延长，3H-TdR掺入量减少(表1)。浓度大于55.6 mmol*L-1的葡萄糖溶液即可使腹膜间皮细胞培养上清中LDH水平明显增加(表2)。
表1 不同浓度葡萄糖对间皮细胞3H-TdR掺入量的影响
Table 1 Influence of different concentration glucose
on 3H-TdR incorporation of normal HPMCs
, http://www.100md.com
/%▲ c(glucose)/
mmol.L-1
t/h
24
48
72
27.8
100±11
101±12
96±12
55.6
95±9
, 百拇医药
76±9*
68±8**
83.3
68±6**
50±8**
40±5**
138.9
33±5**
21±4**
6.7±1.2**
, 百拇医药
236.1
12.5±2.1**
6.9±0.9**
2.43±0.24**
▲percentage of normal control; *P<0.05， **P<0.01 vs normal control (100%).
表2 不同浓度葡萄糖对间皮细胞培养上清中LDH水平的影响
Table 2 Influence of different concentration glucose
on LDH level in HPMCs' supernatant
, 百拇医药
/%▲ c(glucose)/
mmol.L-1
t/h
24
48
72
27.8
30±7
92±6
86±12
55.6
154±16*
, http://www.100md.com
226±11**
260±14**
83.3
285±25**
408±16**
577±48**
138.9
373±20**
726±29**
905±62**
, 百拇医药
236.1
508±33**
898±42**
1086±74**
▲percentage of normal contronl; *P<0.05， **P<0.01 vs normal control (100%).
2.3 IGF-1和EGF对人腹膜间皮细胞的生长刺激作用
随着培养时间和IGF-1，EGF质量浓度的增加，细胞3H-TdR掺入率明显增加(表3、4)。
表3 IGF-1对间皮细胞3H-TdR掺入量的影响
, 百拇医药
Table 3 Influence of IGF-1 on 3H-TdR incorporation of HPMCs
/%▲ ρ(IGF-1)/
μg.L-1
t/h
24
48
72
10
205±10*
236±13*
, 百拇医药
268±18*
20
284±12*
298±16*
354±22*
50
386±18*
402±14*
483±21*
100
412±18*
, 百拇医药
434±22*
516±31*
▲percentage of normal control; *P<0.01 vs normal control (100%).
表4 EGF对间皮细胞3H-TdR掺入量的影响
Table 4 Influence of EGF on 3H-TdR incorporation of HPMCs
/%▲ ρ(EGF)/
μg.L-1
, 百拇医药 t/h
24
48
72
10
163±9*
172±9*
202±12*
20
206±11*
211±9*
266±13*
, 百拇医药
50
249±14*
286±13*
366±17*
100
270±16*
305±17*
409±20*
▲percentage of normal control; *P<0.01 vs normal control (100%).
, 百拇医药 2.4 IGF-1拮抗高浓度葡萄糖对腹膜间皮细胞的毒性作用
质量浓度大于20μg.L-1的IGF-1即能明显拮抗83.3 mmol.L-1葡萄糖对腹膜间皮细胞的毒性作用，其中，50μg.L-1的IGF-1作用72 h，使细胞3H-TdR掺入量较高糖抑制组增加最明显，增加(75±15)% (P<0.01，表5)；50μg.L-1的IGF-1作用24h，使培养上清中LDH水平较高糖抑制组减少最明显，减少(34±8)% (P<0.01，表6)。而EGF对高浓度葡萄糖的细胞毒性作用无明显影响(P>0.05，表7、8)。
表5 IGF-1对在83.3 mmol*L-1葡萄糖中生长的
, 百拇医药 间皮细胞3H-TdR掺入量的影响
Table 5 Influence of IGF-1 on 3H-TdR incorporation
of HPMCs cultured in 83.3 mmol.L-1 glucose
/%▲ ρ(IGF-1)/
μg.L-1
t/h
24
48
72
, http://www.100md.com
10
102±10
107±9
112±11*
20
114±9**
123±9**
127±9**
50
131±8**
161±12**
, http://www.100md.com
175±15**
100
124±8**
148±17**
167±13**
▲percentage of 83.3 mmol.L-1 glucose group; *P<0.05， **P<0.01 vs 83.3 mmol.L-1 glucose group (100%).
表6 IGF-1对在83.3 mmol.L-1葡萄糖中培养
, http://www.100md.com
间皮细胞上清中LDH水平的影响
Table 6 Influence of IGF-1 on LDH in supernatant
of HPMCs cultured in 83.3 mmol.L-1 glucose
/%▲ ρ(IGF-1)/
μg.L-1
t/h
24 h
48 h
72 h
, 百拇医药
10
94±9
92±9
94±10
20
79±9*
88±8*
83±9*
50
66±8*
68±7*
69±8*
, http://www.100md.com
100
69±7*
70±8*
75±8*
▲percentage of 83.3 mmol.L-1 glucose group; *P<0.01 vs 83.3
mmol.L-1 glucose group (100%).
表7 EGF 对在83.3 mmol.L-1葡萄糖中培养
间皮细胞3H-TdR掺入量的影响
, 百拇医药
Table 7 Influence of EGF on 3H-TdR incorporation
of HPMCs cultured in 83.3 mmol.L-1 glucose
/%▲ ρ(EGF)/
μg.L-1
t/h
24
48
72
10
, 百拇医药
96±7
101±7
100±8
20
101±8
104±8
94±7
50
101±9
95±6
99±8
100
104±7
, 百拇医药
102±7
104±7
▲percentage of 83.3 mmol.L-1 glucose group; P>0.05 vs 83.3
mmol.L-1 glucose group (100%).
表8 EGF对在83.3 mmol.L-1葡萄糖中培养
间皮细胞上清中LDH水平的影响
Table 8 Influence of EGF on LDH in supernatant
, 百拇医药 of HPMCs cultured in 83.3 mmol.L-1 glucose
/%▲ ρ(EGF)/
μg.L-1
t/h
24
48
72
10
96±5
91±5
98±8
, 百拇医药
20
99±8
101±10
101±9
50
98±9
99±8
106±9
100
104±8
102±10
96±7
▲percentage of 83.3 mmol.L-1 glucose group; P>0.05 vs 83.3
, http://www.100md.com
mmol.L-1 glucose group (100%).
3 讨论
本实验证实，IGF-1和EGF在体外都能促进腹膜间皮细胞的增殖，使细胞摄取3H-TdR增加，并呈时间和剂量依赖性，与文献相符。本实验发现IGF-1使高糖培养的间皮细胞的增殖能力增加，并使其上清中的LDH水平减少，即IGF-1能拮抗高浓度葡萄糖对腹膜间皮细胞的增殖抑制和对其胞膜完整性的破坏，而EGF对高糖的细胞毒性作用无明显影响。
IGF-1和EGF均属肽类生长因子，可经ras通路刺激细胞增殖。但Sell等[4]发现，用基因打靶技术使小鼠纤维母细胞缺少IGF-1受体，在无血清培养基中加入多种生长因子都不能使这种细胞增殖，在这种细胞中导入活性ras蛋白也不能使其增殖能力恢复，而导入IGF-1受体质粒后，细胞增殖能力恢复。说明IGF-1受体可经过一条非ras依赖的通路刺激细胞增殖，这条通路对细胞活力是不可缺少的。最近，Baserga[5]对这条未知的信号传导通路进行了综述，认为这条通路为IGF-1受体所特有，不被其他肽类生长因子所共享，是非ras依赖性的，它在细胞生长分化和恶性变的过程中起着重要作用。本实验发现，IGF-1能拮抗高糖的毒性作用，而EGF不能，也支持IGF-1和EGF的胞内信号传导途径不同的假说。
, 百拇医药
IGF-1拮抗高糖毒性作用的机制还不清楚。有研究证实高浓度葡萄糖可使间皮细胞合成TGF-β增加，TGF-β经自分泌作用而抑制间皮细胞[6]，有研究表明TGF-β的作用可通过对局部IGF-1的抑制作用而实现[7]。因此推测，外源性的IGF-1可能是通过拮抗TGF-β的作用而拮抗高糖的细胞毒性。其具体机制还有待进一步探讨。
本实验的结果提示，可应用IGF-1增加间皮细胞对高糖腹膜透析液的抵抗能力，维持腹膜功能，从而延长腹膜透析的使用寿命。
☆ 自由词。
参考文献
1 Douvdevani A, Kleinman D, Chaimovitz C. IGF-1 modulates growth of peritoneal mesothelial cells. J Am Soc Nephrol, 1996,7(9):1656
, http://www.100md.com
2 臧 燕，侯凡凡，张 训.表皮生长因子对腹膜间皮细胞增殖的影响.中华肾脏病杂志， 1996，35(2)：92-94
3 Stylianou E, Jenner LA, Davies M, et al. Isolation, culture and characterization of human peritoneal mesothelial cells. Kidney Int， 1990,37:1563-1570
4 Sell C, Dumenil G, Deveavd C， et al. Effect of a null mutation of the type 1 IGF receptor gene on growth and transformation of mouse embryofibroblasts. Mol Cell Biol， 1994,14:3604-3612
, 百拇医药 5 Baserga R. The path less traveled by. Endocrinology， 1997,138(6):2217-2218
6 Kumano K, Shimoda M. The role of TGF-β in growth inhibition of peritoneal mesothelial cells in high-glucose dialysate. Perit Dial Int， 1995,15(suppl 7):s93-95
7 Besset V, Collette J, Chauvin MA, et al. Effect of transforming growth factor-β on the insulin-like growth factor system in cultured porcine Leydig cells. Mol Cell Endocrinol， 1994,99:251-257
(1998-04-27收稿), 百拇医药
单位：北京医科大学第三医院肾内科，北京 100083 邹万忠：北京医科大学病理学系
关键词：胰岛素样生长因子-1；药理学；腹膜间皮细胞☆；葡萄糖；毒性
北京医科大学学报990115 摘 要 目的：比较胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)和表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)对高浓度葡萄糖的腹膜间皮细胞毒性作用的影响。方法：体外培养人腹膜间皮细胞，在上清中加入83.3 mmol.L-1葡萄糖和不同浓度IGF-1或EGF，培养24、48和72 h后，测定3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入率和上清中乳酸脱氢酶(LDH)水平。结果：50μg.L-1的IGF-1作用72 h后，83.3 mmol.L-1葡萄糖溶液中培养间皮细胞的3H-TdR掺入率较高糖抑制组增加(75±15)%(P<0.01)，作用24h，上清中LDH水平较高糖抑制组减少(34±8)% (P<0.01)；EGF对高糖细胞毒性无明显影响(P>0.05)。结论：IGF-1能拮抗高浓度葡萄糖对人腹膜间皮细胞的毒性作用。
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中国图书资料分类法分类号 R587
The effect of insulin-like growth factor-1 on the cytotoxicity of high concentration glucose to human peritoneal mesothelial cells
TANG Zi-Yong#, FAN Min-Hua, ZOU Wan-Zhong
(#Department of Nephrology , the Third Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100083)
MeSH Insulin-like growth factor-1/pharmacol Peritoneal mesothelial cells☆ Glucose/tox
, 百拇医药
ABSTRACT Objective: To compare the effect of insulin-like growth factor-1(IGF-1) and epidermal growth factor (EGF) on the cytotoxicity of high concentration glucose to human peritoneal mesothelial cells (HPMCs). Methods: Human peritoneal mesothelial cells were cultured in vitro, and different concentration of IGF-1 or EGF was added to HPMCs that was cultured in RPMI 1640 medium containing 83.3 mmol.L-1 glucose. After 24, 48 and 72 hours, the incorporation of3H-thymidine (3H-TdR) and the concentration of lactate dehydrogenase(LDH) in supernatants were detected. Results: The addition of 50μg.L-1 of IGF-1 to 83.3 mmol.L-1 glucose caused a (75±15)% increase in 3H-TdR incorporation for 72 hours (P<0.01), and a (34±8)% decrease in release of LDH for 24 hours (P<0.01). EGF had no significant influence on the cytotoxicity of high glucose to HPMCs. Conclusion: IGF-1 can reverse the cytotoxicity of high glucose to HPMCs.
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(J Beijing Med Univ, 1999,31:51-54)
腹膜间皮细胞是构成腹膜的重要细胞群体，在保持腹膜结构完整和功能正常中起着重要作用。研究表明，腹膜透析液中的高浓度葡萄糖是非生物相容性的主要因素，对腹膜间皮细胞有明显毒性作用，通过抑制间皮细胞的增殖而干扰其脱落后的再修复过程，间皮细胞丧失是腹膜硬化发生和发展的始动环节。因此， 寻找拮抗高浓度葡萄糖对腹膜间皮细胞毒性作用的方法，对预防腹膜硬化、延长腹膜透析寿命具有重要意义。
胰岛素样生长因子及其受体在细胞生长、分化和损伤后的再修复过程中发挥着重要作用。有人发现，人腹膜间皮细胞上存在胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor, IGF-1)受体，IGF-1在体外能促进腹膜间皮细胞的增殖[1]。人腹膜间皮细胞上也存在表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)受体[2]。本实验建立了人腹膜间皮细胞体外培养模型，比较IGF-1和EGF对间皮细胞的生长促进作用以及两种生长因子对高浓度葡萄糖细胞毒性作用的影响。
, 百拇医药
1 材料与方法
取择期腹部手术病人的大网膜切除标本(n=6)，体外培养人腹膜间皮细胞，同文献[3]方法。大网膜在含1.25g.L-1胰蛋白酶、0.1g.L-1EDTA、1 g.L-1葡萄糖的消化液中，37℃消化20 min，细胞沉淀以含10%(体积分数)胎牛血清的RPMI 1640培养液(Sigma) RPMI重悬，接种入30 cm2、明胶包被的培养瓶，于细胞培养箱中培养，每3天换一次培养液。传代时用含0.5g.L-1胰蛋白酶、0.2g.L-1EDTA的消化液。以倒置显微镜、透射电镜检查,免疫组织化学染色鉴定，免疫组织化学染色采用LSAB法，分别作抗人cytokeratin 和抗人vimentin两种染色。体外培养传代的第3代细胞用于实验。
, 百拇医药
1.1 间皮细胞增殖试验
用10%(体积分数)胎牛血清培养液制成1×105ml-1细胞悬液，加入96孔细胞培养板，每孔100μl。分组：正常对照组；高糖抑制组，含不同质量浓度的葡萄糖；IGF-1刺激组和EGF刺激组，含不同质量浓度的IGF-1或EGF；IGF-1拮抗组和EGF拮抗组，在83.3 mmol.L-1葡萄糖溶液中分别加入不同质量浓度的IGF-1或EGF[1，2]。分别培养24、48、72 h，培养结束前6h，每孔加入1.85×104 Bq的
3 H-TdR。收集细胞，液体闪烁yf 数仪测弱β放射性。
1.2 间皮细胞损伤试验
同上的1×105 ml-1细胞悬液，加入24孔细胞培养板中，每孔500 μl。分组：高糖抑制组，含不同浓度葡萄糖；IGF-1拮抗组和EGF拮抗组，在83.3 mmol.L-1葡萄糖溶液中加入不同质量浓度IGF-1或EGF；对照组为无血清培养。分别培养24、48和72h后，培养结束时收集上清，于全自动生化分析仪上速度法测LDH水平。
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1.3 统计学方法
以上实验均作4个平行孔，取平均值，计算实验值占正常对照的百分数，计对照为100%。同一实验重复6次，结果以
±s表示。先作单因素方差分析，再作非配对组间t检验。2 实验结果
2.1 人腹膜间皮细胞体外培养的鉴定
倒置显微镜下，细胞汇合后呈密集的铺路卵石样生长。透射电镜下：细胞表面存在大量多少不等、较长的微绒毛。符合腹膜间皮细胞的形态及超微结构特点。免疫组织化学染色结果显示，培养细胞对人cytokeratin和vimentin的反应均为阳性，细胞纯度大于97%。这种双阳性信号只见于间皮细胞，排除了纤维母细胞和上皮细胞污染的可能。另外，可能污染的细胞还有红细胞、白细胞、肥大细胞等，但都不能在体外长时间生存。因此，所培养细胞为高纯度的人腹膜间皮细胞。
, 百拇医药
2.2 高浓度葡萄糖对人腹膜间皮细胞的毒性作用
浓度大于55.6 mmol*L-1的葡萄糖溶液作用48 h以上可明显抑制腹膜间皮细胞的增殖能力。随着葡萄糖浓度的增加和培养时间的延长，3H-TdR掺入量减少(表1)。浓度大于55.6 mmol*L-1的葡萄糖溶液即可使腹膜间皮细胞培养上清中LDH水平明显增加(表2)。
表1 不同浓度葡萄糖对间皮细胞3H-TdR掺入量的影响
Table 1 Influence of different concentration glucose
on 3H-TdR incorporation of normal HPMCs
, http://www.100md.com
/%▲ c(glucose)/
mmol.L-1
t/h
24
48
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27.8
100±11
101±12
96±12
55.6
95±9
, 百拇医药
76±9*
68±8**
83.3
68±6**
50±8**
40±5**
138.9
33±5**
21±4**
6.7±1.2**
, 百拇医药
236.1
12.5±2.1**
6.9±0.9**
2.43±0.24**
▲percentage of normal control; *P<0.05， **P<0.01 vs normal control (100%).
表2 不同浓度葡萄糖对间皮细胞培养上清中LDH水平的影响
Table 2 Influence of different concentration glucose
on LDH level in HPMCs' supernatant
, 百拇医药
/%▲ c(glucose)/
mmol.L-1
t/h
24
48
72
27.8
30±7
92±6
86±12
55.6
154±16*
, http://www.100md.com
226±11**
260±14**
83.3
285±25**
408±16**
577±48**
138.9
373±20**
726±29**
905±62**
, 百拇医药
236.1
508±33**
898±42**
1086±74**
▲percentage of normal contronl; *P<0.05， **P<0.01 vs normal control (100%).
2.3 IGF-1和EGF对人腹膜间皮细胞的生长刺激作用
随着培养时间和IGF-1，EGF质量浓度的增加，细胞3H-TdR掺入率明显增加(表3、4)。
表3 IGF-1对间皮细胞3H-TdR掺入量的影响
, 百拇医药
Table 3 Influence of IGF-1 on 3H-TdR incorporation of HPMCs
/%▲ ρ(IGF-1)/
μg.L-1
t/h
24
48
72
10
205±10*
236±13*
, 百拇医药
268±18*
20
284±12*
298±16*
354±22*
50
386±18*
402±14*
483±21*
100
412±18*
, 百拇医药
434±22*
516±31*
▲percentage of normal control; *P<0.01 vs normal control (100%).
表4 EGF对间皮细胞3H-TdR掺入量的影响
Table 4 Influence of EGF on 3H-TdR incorporation of HPMCs
/%▲ ρ(EGF)/
μg.L-1
, 百拇医药 t/h
24
48
72
10
163±9*
172±9*
202±12*
20
206±11*
211±9*
266±13*
, 百拇医药
50
249±14*
286±13*
366±17*
100
270±16*
305±17*
409±20*
▲percentage of normal control; *P<0.01 vs normal control (100%).
, 百拇医药 2.4 IGF-1拮抗高浓度葡萄糖对腹膜间皮细胞的毒性作用
质量浓度大于20μg.L-1的IGF-1即能明显拮抗83.3 mmol.L-1葡萄糖对腹膜间皮细胞的毒性作用，其中，50μg.L-1的IGF-1作用72 h，使细胞3H-TdR掺入量较高糖抑制组增加最明显，增加(75±15)% (P<0.01，表5)；50μg.L-1的IGF-1作用24h，使培养上清中LDH水平较高糖抑制组减少最明显，减少(34±8)% (P<0.01，表6)。而EGF对高浓度葡萄糖的细胞毒性作用无明显影响(P>0.05，表7、8)。
表5 IGF-1对在83.3 mmol*L-1葡萄糖中生长的
, 百拇医药 间皮细胞3H-TdR掺入量的影响
Table 5 Influence of IGF-1 on 3H-TdR incorporation
of HPMCs cultured in 83.3 mmol.L-1 glucose
/%▲ ρ(IGF-1)/
μg.L-1
t/h
24
48
72
, http://www.100md.com
10
102±10
107±9
112±11*
20
114±9**
123±9**
127±9**
50
131±8**
161±12**
, http://www.100md.com
175±15**
100
124±8**
148±17**
167±13**
▲percentage of 83.3 mmol.L-1 glucose group; *P<0.05， **P<0.01 vs 83.3 mmol.L-1 glucose group (100%).
表6 IGF-1对在83.3 mmol.L-1葡萄糖中培养
, http://www.100md.com
间皮细胞上清中LDH水平的影响
Table 6 Influence of IGF-1 on LDH in supernatant
of HPMCs cultured in 83.3 mmol.L-1 glucose
/%▲ ρ(IGF-1)/
μg.L-1
t/h
24 h
48 h
72 h
, 百拇医药
10
94±9
92±9
94±10
20
79±9*
88±8*
83±9*
50
66±8*
68±7*
69±8*
, http://www.100md.com
100
69±7*
70±8*
75±8*
▲percentage of 83.3 mmol.L-1 glucose group; *P<0.01 vs 83.3
mmol.L-1 glucose group (100%).
表7 EGF 对在83.3 mmol.L-1葡萄糖中培养
间皮细胞3H-TdR掺入量的影响
, 百拇医药
Table 7 Influence of EGF on 3H-TdR incorporation
of HPMCs cultured in 83.3 mmol.L-1 glucose
/%▲ ρ(EGF)/
μg.L-1
t/h
24
48
72
10
, 百拇医药
96±7
101±7
100±8
20
101±8
104±8
94±7
50
101±9
95±6
99±8
100
104±7
, 百拇医药
102±7
104±7
▲percentage of 83.3 mmol.L-1 glucose group; P>0.05 vs 83.3
mmol.L-1 glucose group (100%).
表8 EGF对在83.3 mmol.L-1葡萄糖中培养
间皮细胞上清中LDH水平的影响
Table 8 Influence of EGF on LDH in supernatant
, 百拇医药 of HPMCs cultured in 83.3 mmol.L-1 glucose
/%▲ ρ(EGF)/
μg.L-1
t/h
24
48
72
10
96±5
91±5
98±8
, 百拇医药
20
99±8
101±10
101±9
50
98±9
99±8
106±9
100
104±8
102±10
96±7
▲percentage of 83.3 mmol.L-1 glucose group; P>0.05 vs 83.3
, http://www.100md.com
mmol.L-1 glucose group (100%).
3 讨论
本实验证实，IGF-1和EGF在体外都能促进腹膜间皮细胞的增殖，使细胞摄取3H-TdR增加，并呈时间和剂量依赖性，与文献相符。本实验发现IGF-1使高糖培养的间皮细胞的增殖能力增加，并使其上清中的LDH水平减少，即IGF-1能拮抗高浓度葡萄糖对腹膜间皮细胞的增殖抑制和对其胞膜完整性的破坏，而EGF对高糖的细胞毒性作用无明显影响。
IGF-1和EGF均属肽类生长因子，可经ras通路刺激细胞增殖。但Sell等[4]发现，用基因打靶技术使小鼠纤维母细胞缺少IGF-1受体，在无血清培养基中加入多种生长因子都不能使这种细胞增殖，在这种细胞中导入活性ras蛋白也不能使其增殖能力恢复，而导入IGF-1受体质粒后，细胞增殖能力恢复。说明IGF-1受体可经过一条非ras依赖的通路刺激细胞增殖，这条通路对细胞活力是不可缺少的。最近，Baserga[5]对这条未知的信号传导通路进行了综述，认为这条通路为IGF-1受体所特有，不被其他肽类生长因子所共享，是非ras依赖性的，它在细胞生长分化和恶性变的过程中起着重要作用。本实验发现，IGF-1能拮抗高糖的毒性作用，而EGF不能，也支持IGF-1和EGF的胞内信号传导途径不同的假说。
, 百拇医药
IGF-1拮抗高糖毒性作用的机制还不清楚。有研究证实高浓度葡萄糖可使间皮细胞合成TGF-β增加，TGF-β经自分泌作用而抑制间皮细胞[6]，有研究表明TGF-β的作用可通过对局部IGF-1的抑制作用而实现[7]。因此推测，外源性的IGF-1可能是通过拮抗TGF-β的作用而拮抗高糖的细胞毒性。其具体机制还有待进一步探讨。
本实验的结果提示，可应用IGF-1增加间皮细胞对高糖腹膜透析液的抵抗能力，维持腹膜功能，从而延长腹膜透析的使用寿命。
☆ 自由词。
参考文献
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, 百拇医药 5 Baserga R. The path less traveled by. Endocrinology， 1997,138(6):2217-2218
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7 Besset V, Collette J, Chauvin MA, et al. Effect of transforming growth factor-β on the insulin-like growth factor system in cultured porcine Leydig cells. Mol Cell Endocrinol， 1994,99:251-257
(1998-04-27收稿), 百拇医药