降钙素基因相关肽基因体外转染人脐静脉内皮细胞
作者：崔俊峰 徐成斌 王申五 霍玉庆 金晓峰
单位：北京医科大学人民医院心内科 王申五:中心实验室，北京 100044
关键词：转染；内皮；血管；降钙素基因相关肽；脐静脉
北京医科大学学报990112 摘 要 目的:观察逆转录病毒载体介导的降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)基因对人脐静脉内皮细胞的作用，探讨其应用于动脉粥样硬化和经皮腔内冠状动脉成形术后再狭窄基因治疗的可行性。方法:构建含有CGRP cDNA的逆转录病毒载体，体外转染人脐静脉内皮细胞。用RT-PCR及放射免疫法分析检测基因表达水平。应用细胞计数及流式细胞仪观察CGRP基因对内皮细胞生长的影响。结果:逆转录病毒载体能有效地将外源性基因导入血管内皮细胞并稳定表达。导入CGRP基因可以促进内皮细胞的分裂增殖，从而加速损伤内皮的修复。结论:CGRP基因有可能作为动脉粥样硬化及再狭窄基因治疗的有效候选基因。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 Q343.11
Expression of calcitonin gene-related peptide in human umbilical veinendothelial cells transfected with retroviral vectors in vitro
CUI Jun-Feng＃, XU Cheng-Bin, WANG Shen-Wu, HUO Yu-Qin, JIN Xiao-Feng
(#Department of Cardiology, People's Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100044)
MeSH Transfection Endothelium, vascular Calcitonin gene-related peptide Umbilical veins
, 百拇医药
ABSTRACT Objective: To investigate the effect of calcitonin gene-related peptide (CGRP) gene mediated by recombinant retroviral vector on human umbilical vein endothelial cells(HUVEC) and explore the possibility of using CGRP gene for gene therapy in atherosclerosis and restenosis. Methods: CGRP gene recombinant retroviral vector was constructed to transfect into HUVEC in vitro. The gene expression was detected by radioimmunoassay and RT-PCR. The role of CGRP gene on HUVEC proliferation, viability and cell cycle were observed by cell-counting and flow cytometry, respectively. Results: The CGRP gene could be effectively transferred into HUVEC and stably expressed. The expressed CGRP gene promoted the proliferation of HUVEC and might enhance the recovery of injured endothelium. Conclusion: CGRP gene can serve as one of the promising candidate gene for gene therapy in atherosclerosis and restenosis. Retroviral mediated CGRP gene transfer may be used to treat atherosclerosis and restenosis.
, 百拇医药
(J Beijing Med Univ, 1999,31:41-44)
降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)是迄今发现的人体内舒血管活性最强的一种多肽[1]。它还能抑制平滑肌细胞的增生，促进内皮细胞的修复。而血管内皮细胞损伤被认为是动脉粥样硬化和经皮腔内冠状动脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)后再狭窄等血管增殖性疾病的始发因素，因此，局部导入具有促进血管再生特性的CGRP是防治血管损伤和动脉粥样硬化引起的内膜增殖的一个很有希望的途径。本文选用重组逆转录病毒载体转染培养的人脐静脉内皮细胞，观察CGRP基因的表达及CGRP对内皮细胞表型的影响，以探索一种可能用于防治PTCA后再狭窄的治疗手段。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
, 百拇医药
脐带取自北京医科大学人民医院产房，产后立即切取脐带置PBS液中4℃保存,3h内使用，按文献[2]介绍的方法操作。取1～2代细胞用于实验。内皮细胞鉴定采用von Willebrand's factor antigen,培养液用M199+20%(体积分数)胎牛血清。传代培养时加10μg.L-1 ECGF(endothelial cell growth factor)和肝素5000U.L-1，为减少细胞代次本身的影响，每次尽可能选用相同代次的细胞进行实验。PA317及NIH3T3细胞由北京医科大学人民医院王申五研究员惠赠，培养液用DMEM+10%(体积分数)胎牛血清(简称D10,以下同)。
1.2 逆转录病毒载体的构建
质粒pTT42由美国霍普金斯大学肿瘤学中心Barry Nelkin教授惠赠，含人α-CGRP cDNA 2、3、5和6外显子序列，逆转录病毒载体pLXSN由北京医科大学人民医院王申五研究员惠赠，限制性内切酶和T4 DNA连接酶为Promega公司产品，E.Coli DH5α为人民医院中心实验室保存菌种。pTT42经PstⅠ消化获得cDNA片段，亚克隆至Bluscript SK质粒的PstⅠ位点，转化大肠杆菌后挑取白色菌斑并用BstⅪ筛选正向重组子，由酶切后DNA片段大小即可判定正、反向重组体。正向重组子再经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切，最后将回收的目的片段定向克隆至pLXSN的EcoRⅠ和BamHⅠ多克隆位点，扩增、纯化后进行包装。
, 百拇医药
1.3 重组病毒的包装及筛选
取对数生长期的包装细胞PA317在直径60 mm培养皿中传代培养12～24 h，达50%～60%汇合。用脂质体转染试剂DOTAP(Boehringer Mannheim)将纯化后的DNA分别导入包装细胞，以含有400 mg.L-1 G418(Sigma) 的D10 按1∶5～1∶10(体积比)稀释，培养10～15 d，G418浓度加至600～800mg.L-1，约3周长出细胞集落，分别转种扩大培养，收集上清，加10%(体积分数)甘油，-70℃保存。收集的上清分别以1∶102，1∶103，1∶104(体积比)稀释，感染传代后生长24 h的NIH3T3细胞，按1∶10(体积比)稀释传代，并在含G418(400～600mg.L-1)的D10中筛选培养，2～3周后出现细胞克隆，计数并算出病毒滴度(克隆形成单位/毫升,cfu.ml-1)。
, 百拇医药
1.4 HUVEC(human umbilical vein endothelial cells)的基因转导
在6孔板中每孔接种2×105 HUVEC, M199+20%(体积分数)胎牛血清培养24h后移出培养液，加1ml病毒上清及polybrene 6 mg.L-1，转染24 h后加入G418100 mg.L-1继续培养12d，每3～4d换液1次，以不加病毒上清及加入空载体病毒上清的细胞作为对照。
1.5 基因表达的分析
取正常细胞及转导病毒的细胞各约3×105，提取细胞RNA,建立反转录体系，设计的目的基因引物分别位于第5和第6外显子之间，扩增片段长度189 bp,引物序列为5′GTGACACTGCCACCTGT3′和5′CACATTAAAAGGAGTTCAGC3′，由美国Cybersyn公司合成。PCR反应条件94℃ 30s,56℃ 30 s,72℃ 30s，共30个循环，20g.L-1琼脂糖凝胶电泳分析结果。
, 百拇医药
1.6 CGRP蛋白的放射免疫分析
转导病毒载体的内皮细胞经G418筛选两周(100 mg.L-1)并维持培养，测量前一天换新鲜无血清培养基,取培养上清2 ml，按文献[3]报道的方法测定，兔抗人CGRP(hCGRP)血清为 美国Peninsula Lab产品，125I-hCGRP(1×104～1.5×104 min-1)为Amersham公司产品。
1.7 生长曲线的观察
分别将转导病毒载体的细胞和未转导外源基因的正常细胞按每孔3×104的密度接种至24孔板，每组接种3孔，孵育24h以使细胞贴壁生长。然后用血球计数板每天计数各组细胞，每次数3孔，每孔数3次，最后取3孔的总平均数作为当日的细胞数，共计数5d。
, 百拇医药
1.8 流式细胞术对细胞周期各时相DNA定量分析
取1×106正常对照组细胞及转导病毒的细胞各1瓶，胰酶消化，PBS清洗，75%(体积分数)乙醇固定，RNase A(1g.L-1)消化，加碘化丙啶(PI,50mg.L-1)染色后上流式细胞仪进行DNA分析。
1.9 统计分析
实验结果以
±s表示,组与组之间比较采用F检验和q检验。
2 结果
2.1 质粒的构建及酶切鉴定
pTT42经PstⅠ消化获得约850 bp cDNA片段，正向重组子pRCGRP经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后应得到约900 bp和5.822 bp 2个片段,从图1可见酶切结果符合预期片段大小。
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1, λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ marker; 2，CGRP cDNA band;
3, pTT42 digested by PstⅠ, producing two fragments of about 900 bp and 4.36 kb(the first one is too faint to be seen);4, pRCGRP digested by EcoRⅠ and BamHⅠ, producing two fragments of about 900 bp and 5 822 bp; 5, pLXSN digested by EcoRⅠ and BamHⅠ.
图1 重组质粒的酶切鉴定
Figure 1 Electrophoresis map of the restriction products
, http://www.100md.com
of the recombinant plasmids
2.2 分泌重组逆转录病毒的包装细胞的建立及滴度测定
重组质粒转染包装细胞并经G418筛选，共挑出5个抗性克隆，扩大培养后分别收集其培养上清感染NIH3T3细胞,测定滴度，最高每毫升约(1～2)×105克隆形成单位。
2.3 RT-PCR
我们用RT-PCR的方法分析了CGRP基因在靶细胞内的表达。由于GAPDH的表达较为恒定，不大受各种因素的影响，其mRNA的量在一定程度上可以反映总RNA的量，故选用它作为内对照。从RT-PCR结果看，实验组和对照组的GAPDH表达水平差别不大，说明RNA总量基本一致。转染pRCGRP的HUVEC扩增后获得189 bp 的片段，而未转染和转染空载体的HUVEC PCR结果为阴性(图2),说明CGRP已成功地转入HUVEC，同时也说明HUVEC中无 CGRP的内源性表达。
, 百拇医药
1,×174 DNA/Hinf I marker; 2,positive control of plasmid pTT42; 3,pRCGRP transfected HUVEC excluding RT reaction;
4,nontransfected HUVEC; 5, product of 189 bp from pRCGRP transfected HUVEC.
图2 RT-PCR扩增产物电泳图谱
Figure 2 Results of CGRP gene expression obtained by RT-PCR
2.4 分泌型CGRP的放射免疫测定
重组病毒转染内皮细胞后培养上清中CGRP的放射免疫定量测定结果表明，转染pRCGRP的内皮细胞培养液中CGRP的浓度最高约(12.4±0.5) pmol.L-1,而单纯用pLXSN转染组和未转染组细胞培养液中未能检测到CGRP(cCGRP<0.7 pmol.L-1)。
, 百拇医药
2.5 CGRP对HUVEC生长的影响
细胞生长曲线:pRCGRP能明显促进HUVEC的生长，正常及空载体pLXSN转导的细胞生长缓慢，细胞倍增时间在5 d以上;而转导pRCGRP载体的细胞2～3 d即呈对数生长，培养中发现细胞对血清的依赖性降低,倍增时间约为2.5～3.5 d，说明细胞分裂、增殖加强,5 d后增殖率达到169%(P<0.05)。
细胞周期分析:正常内皮细胞体外培养时，大多处于G1期，只有少数细胞处于S期(16±4)%，而重组逆转录病毒转导后的细胞很多进入了S期(43±5)%,P<0.01，说明CGRP转导细胞后能促进内皮细胞从G1进入S期。
3 讨论
尽管国内、外学者多年来进行了大量的临床和实验研究，PTCA术后再狭窄的防治仍未获得成功，高达40%的再狭窄发生率是PTCA应用和发展的严重障碍。基因疗法的研究与应用范围正在迅速扩展至获得性疾病，基因转移可能是血管再狭窄的一种很有希望的治疗手段。再狭窄发生的原因复杂,但似乎主要是再狭窄局部有关因素控制不力,特别是与冠状动脉内皮损伤和修复不佳以及未能有效控制平滑肌细胞的增生有关。目前再狭窄研究主要是利用药物或生物制剂直接控制平滑肌细胞的增殖，然而，如果球囊损伤后局部内皮能迅速再生便可以间接地抑制内皮下平滑肌的增生。多种动物体内进行的研究表明[4]，血管壁广泛的内皮剥脱可导致内膜增厚，内皮损伤可能是动脉粥样硬化和再狭窄等血管增殖性疾病的始发因素。完整的内皮细胞层还可以防止受损血管内膜纤维化病变的发展。内皮细胞功能障碍是平滑肌细胞增生的原因之一。因此，保护移植血管内膜的完整性，通过某种机制加速内皮细胞的分裂、再生，尽快恢复内皮功能，则可间接地阻抑内膜的增殖。有人利用导管将携带人内皮细胞生长因子的真核表达质粒直接导入兔的髂动脉，7 d后发现球囊损伤后的髂动脉20mm的血管段内膜大部分被新生内皮覆盖，对照组则不到50%，随后血管造影证实，有新生内皮细胞覆盖的血管段管腔狭窄程度明显减轻[5]。
, 百拇医药
CGRP 在体内分布广泛，并具有强大的心血管效应，它不仅能通过平滑肌细胞强烈扩张冠状动脉，而且还可以刺激内皮细胞的增殖[6]，抑制平滑肌细胞的增生[7]。本研究中我们选用逆转录病毒载体体外转染人脐静脉内皮细胞，结果表明，逆转录病毒载体可以有效地将CGRP基因导入内皮细胞并稳定表达，CGRP对内皮细胞具有明显的促分裂增殖效应。根据这一结果，我们设想在动脉粥样硬化发展的早期或于血管成形术的同时局部导入CGRP基因，在血管损伤的部位高效表达CGRP,有可能促进内皮细胞的分裂、增生，加速内皮修复，尽快恢复内皮的功能，抑制新生内膜的增殖，从而防止PTCA术后以及旁路手术后血管再狭窄的发生。
健康人血循环中CGRP的浓度目前说法不一，有人[8]报道为0.4～4.5pmol.L-1,本文用放免检测法直接测定内皮细胞培养上清的CGRP浓度，转染病毒的内皮细胞CGRP的最高分泌量达到(12.4±0.5)pmol.L-1,尽管这一数值不能与血浆中的含量直接相比，但是Haegerstrand等的研究证明[6]，CGRP用量达10 pmol.L-1时即可刺激培养的HUVEC发生增殖反应，因此，我们认为如果采用转染效率更高的表达载体进行在体转染，CGRP有可能发挥更强大的生物效应。
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逆转录病毒具有稳定、安全、高效的优点，它是基因治疗研究中最主要的基因转移载体，在血管内膜受到刺激(如球囊损伤)时，逆转录病毒载体可以成功转导血管壁细胞，不足之处在于逆转录病毒的感染滴度偏低，使其应用受到一定限制，但是，有研究表明，如果表达产物是分泌型蛋白质或多肽，即使转导效率有限，少数转导细胞(1%)表达的产物也可以通过旁分泌效应在局部产生生物学效应，逆转录病毒载体仍有其应用价值。
* 国家自然科学基金(39570310)资助项目。
参考文献
1 Goodman EC, Iversen LL. Calcitonin gene-related peptide:novel neuropeptide. Life Sci,1986,38:2169-2174
2 Jaffe EA, Nachman RL, Becker CG, et al. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. J Clin Invest, 1973,52:2745-2751
, 百拇医药
3 王 宪,曹向辉,韩启德,等.脑血管疾病患者脑脊液中降钙素基因相关肽(CGRP)浓度的改变.中华神经精神科杂志, 1991,24:133-134
4 Bauters CR.Mechanisms and prevention of restenosis:from experimental models to clinical practice. Cardiovasc Res, 1996,31:835-847
5 Takayuki A, Chen D H, Yukio T, et al. Accelerated restitution of endothelial integrity and endothelium-dependent function after phVEGF gene transfer. Circulation, 1996,94:3291-3301
6 Haegerstrand A, Dalsgard CJ, Jonzon B, et al. Calcitonin gene-related peptide stimulates proliferation of human endothelial cells. Proc Natl Acad Sci, 1990,87:3299-3303
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7 Fiscus RR. Calcitonin gene-related peptide inhibits proliferation of cultured bovine aortic SMC. FASEB J, 1993,7:A791
8 Carter WB, Webster S, Wighy TN, et al. Determination of plasma calcitonin gene-related peptide concentration by a new immunochemiluminometric assay in normal persons with medullary thyroid carcinoma and other neuroendocrine tumors. J Clin Endocrinol Metab, 1991,72:327-332
(1998-03-27收稿), 百拇医药
单位：北京医科大学人民医院心内科 王申五:中心实验室，北京 100044
关键词：转染；内皮；血管；降钙素基因相关肽；脐静脉
北京医科大学学报990112 摘 要 目的:观察逆转录病毒载体介导的降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)基因对人脐静脉内皮细胞的作用，探讨其应用于动脉粥样硬化和经皮腔内冠状动脉成形术后再狭窄基因治疗的可行性。方法:构建含有CGRP cDNA的逆转录病毒载体，体外转染人脐静脉内皮细胞。用RT-PCR及放射免疫法分析检测基因表达水平。应用细胞计数及流式细胞仪观察CGRP基因对内皮细胞生长的影响。结果:逆转录病毒载体能有效地将外源性基因导入血管内皮细胞并稳定表达。导入CGRP基因可以促进内皮细胞的分裂增殖，从而加速损伤内皮的修复。结论:CGRP基因有可能作为动脉粥样硬化及再狭窄基因治疗的有效候选基因。
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中国图书资料分类法分类号 Q343.11
Expression of calcitonin gene-related peptide in human umbilical veinendothelial cells transfected with retroviral vectors in vitro
CUI Jun-Feng＃, XU Cheng-Bin, WANG Shen-Wu, HUO Yu-Qin, JIN Xiao-Feng
(#Department of Cardiology, People's Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100044)
MeSH Transfection Endothelium, vascular Calcitonin gene-related peptide Umbilical veins
, 百拇医药
ABSTRACT Objective: To investigate the effect of calcitonin gene-related peptide (CGRP) gene mediated by recombinant retroviral vector on human umbilical vein endothelial cells(HUVEC) and explore the possibility of using CGRP gene for gene therapy in atherosclerosis and restenosis. Methods: CGRP gene recombinant retroviral vector was constructed to transfect into HUVEC in vitro. The gene expression was detected by radioimmunoassay and RT-PCR. The role of CGRP gene on HUVEC proliferation, viability and cell cycle were observed by cell-counting and flow cytometry, respectively. Results: The CGRP gene could be effectively transferred into HUVEC and stably expressed. The expressed CGRP gene promoted the proliferation of HUVEC and might enhance the recovery of injured endothelium. Conclusion: CGRP gene can serve as one of the promising candidate gene for gene therapy in atherosclerosis and restenosis. Retroviral mediated CGRP gene transfer may be used to treat atherosclerosis and restenosis.
, 百拇医药
(J Beijing Med Univ, 1999,31:41-44)
降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)是迄今发现的人体内舒血管活性最强的一种多肽[1]。它还能抑制平滑肌细胞的增生，促进内皮细胞的修复。而血管内皮细胞损伤被认为是动脉粥样硬化和经皮腔内冠状动脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)后再狭窄等血管增殖性疾病的始发因素，因此，局部导入具有促进血管再生特性的CGRP是防治血管损伤和动脉粥样硬化引起的内膜增殖的一个很有希望的途径。本文选用重组逆转录病毒载体转染培养的人脐静脉内皮细胞，观察CGRP基因的表达及CGRP对内皮细胞表型的影响，以探索一种可能用于防治PTCA后再狭窄的治疗手段。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
, 百拇医药
脐带取自北京医科大学人民医院产房，产后立即切取脐带置PBS液中4℃保存,3h内使用，按文献[2]介绍的方法操作。取1～2代细胞用于实验。内皮细胞鉴定采用von Willebrand's factor antigen,培养液用M199+20%(体积分数)胎牛血清。传代培养时加10μg.L-1 ECGF(endothelial cell growth factor)和肝素5000U.L-1，为减少细胞代次本身的影响，每次尽可能选用相同代次的细胞进行实验。PA317及NIH3T3细胞由北京医科大学人民医院王申五研究员惠赠，培养液用DMEM+10%(体积分数)胎牛血清(简称D10,以下同)。
1.2 逆转录病毒载体的构建
质粒pTT42由美国霍普金斯大学肿瘤学中心Barry Nelkin教授惠赠，含人α-CGRP cDNA 2、3、5和6外显子序列，逆转录病毒载体pLXSN由北京医科大学人民医院王申五研究员惠赠，限制性内切酶和T4 DNA连接酶为Promega公司产品，E.Coli DH5α为人民医院中心实验室保存菌种。pTT42经PstⅠ消化获得cDNA片段，亚克隆至Bluscript SK质粒的PstⅠ位点，转化大肠杆菌后挑取白色菌斑并用BstⅪ筛选正向重组子，由酶切后DNA片段大小即可判定正、反向重组体。正向重组子再经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切，最后将回收的目的片段定向克隆至pLXSN的EcoRⅠ和BamHⅠ多克隆位点，扩增、纯化后进行包装。
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1.3 重组病毒的包装及筛选
取对数生长期的包装细胞PA317在直径60 mm培养皿中传代培养12～24 h，达50%～60%汇合。用脂质体转染试剂DOTAP(Boehringer Mannheim)将纯化后的DNA分别导入包装细胞，以含有400 mg.L-1 G418(Sigma) 的D10 按1∶5～1∶10(体积比)稀释，培养10～15 d，G418浓度加至600～800mg.L-1，约3周长出细胞集落，分别转种扩大培养，收集上清，加10%(体积分数)甘油，-70℃保存。收集的上清分别以1∶102，1∶103，1∶104(体积比)稀释，感染传代后生长24 h的NIH3T3细胞，按1∶10(体积比)稀释传代，并在含G418(400～600mg.L-1)的D10中筛选培养，2～3周后出现细胞克隆，计数并算出病毒滴度(克隆形成单位/毫升,cfu.ml-1)。
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1.4 HUVEC(human umbilical vein endothelial cells)的基因转导
在6孔板中每孔接种2×105 HUVEC, M199+20%(体积分数)胎牛血清培养24h后移出培养液，加1ml病毒上清及polybrene 6 mg.L-1，转染24 h后加入G418100 mg.L-1继续培养12d，每3～4d换液1次，以不加病毒上清及加入空载体病毒上清的细胞作为对照。
1.5 基因表达的分析
取正常细胞及转导病毒的细胞各约3×105，提取细胞RNA,建立反转录体系，设计的目的基因引物分别位于第5和第6外显子之间，扩增片段长度189 bp,引物序列为5′GTGACACTGCCACCTGT3′和5′CACATTAAAAGGAGTTCAGC3′，由美国Cybersyn公司合成。PCR反应条件94℃ 30s,56℃ 30 s,72℃ 30s，共30个循环，20g.L-1琼脂糖凝胶电泳分析结果。
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1.6 CGRP蛋白的放射免疫分析
转导病毒载体的内皮细胞经G418筛选两周(100 mg.L-1)并维持培养，测量前一天换新鲜无血清培养基,取培养上清2 ml，按文献[3]报道的方法测定，兔抗人CGRP(hCGRP)血清为 美国Peninsula Lab产品，125I-hCGRP(1×104～1.5×104 min-1)为Amersham公司产品。
1.7 生长曲线的观察
分别将转导病毒载体的细胞和未转导外源基因的正常细胞按每孔3×104的密度接种至24孔板，每组接种3孔，孵育24h以使细胞贴壁生长。然后用血球计数板每天计数各组细胞，每次数3孔，每孔数3次，最后取3孔的总平均数作为当日的细胞数，共计数5d。
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1.8 流式细胞术对细胞周期各时相DNA定量分析
取1×106正常对照组细胞及转导病毒的细胞各1瓶，胰酶消化，PBS清洗，75%(体积分数)乙醇固定，RNase A(1g.L-1)消化，加碘化丙啶(PI,50mg.L-1)染色后上流式细胞仪进行DNA分析。
1.9 统计分析
实验结果以
±s表示,组与组之间比较采用F检验和q检验。2 结果
2.1 质粒的构建及酶切鉴定
pTT42经PstⅠ消化获得约850 bp cDNA片段，正向重组子pRCGRP经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切后应得到约900 bp和5.822 bp 2个片段,从图1可见酶切结果符合预期片段大小。
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1, λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ marker; 2，CGRP cDNA band;
3, pTT42 digested by PstⅠ, producing two fragments of about 900 bp and 4.36 kb(the first one is too faint to be seen);4, pRCGRP digested by EcoRⅠ and BamHⅠ, producing two fragments of about 900 bp and 5 822 bp; 5, pLXSN digested by EcoRⅠ and BamHⅠ.
图1 重组质粒的酶切鉴定
Figure 1 Electrophoresis map of the restriction products
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of the recombinant plasmids
2.2 分泌重组逆转录病毒的包装细胞的建立及滴度测定
重组质粒转染包装细胞并经G418筛选，共挑出5个抗性克隆，扩大培养后分别收集其培养上清感染NIH3T3细胞,测定滴度，最高每毫升约(1～2)×105克隆形成单位。
2.3 RT-PCR
我们用RT-PCR的方法分析了CGRP基因在靶细胞内的表达。由于GAPDH的表达较为恒定，不大受各种因素的影响，其mRNA的量在一定程度上可以反映总RNA的量，故选用它作为内对照。从RT-PCR结果看，实验组和对照组的GAPDH表达水平差别不大，说明RNA总量基本一致。转染pRCGRP的HUVEC扩增后获得189 bp 的片段，而未转染和转染空载体的HUVEC PCR结果为阴性(图2),说明CGRP已成功地转入HUVEC，同时也说明HUVEC中无 CGRP的内源性表达。
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1,×174 DNA/Hinf I marker; 2,positive control of plasmid pTT42; 3,pRCGRP transfected HUVEC excluding RT reaction;
4,nontransfected HUVEC; 5, product of 189 bp from pRCGRP transfected HUVEC.
图2 RT-PCR扩增产物电泳图谱
Figure 2 Results of CGRP gene expression obtained by RT-PCR
2.4 分泌型CGRP的放射免疫测定
重组病毒转染内皮细胞后培养上清中CGRP的放射免疫定量测定结果表明，转染pRCGRP的内皮细胞培养液中CGRP的浓度最高约(12.4±0.5) pmol.L-1,而单纯用pLXSN转染组和未转染组细胞培养液中未能检测到CGRP(cCGRP<0.7 pmol.L-1)。
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2.5 CGRP对HUVEC生长的影响
细胞生长曲线:pRCGRP能明显促进HUVEC的生长，正常及空载体pLXSN转导的细胞生长缓慢，细胞倍增时间在5 d以上;而转导pRCGRP载体的细胞2～3 d即呈对数生长，培养中发现细胞对血清的依赖性降低,倍增时间约为2.5～3.5 d，说明细胞分裂、增殖加强,5 d后增殖率达到169%(P<0.05)。
细胞周期分析:正常内皮细胞体外培养时，大多处于G1期，只有少数细胞处于S期(16±4)%，而重组逆转录病毒转导后的细胞很多进入了S期(43±5)%,P<0.01，说明CGRP转导细胞后能促进内皮细胞从G1进入S期。
3 讨论
尽管国内、外学者多年来进行了大量的临床和实验研究，PTCA术后再狭窄的防治仍未获得成功，高达40%的再狭窄发生率是PTCA应用和发展的严重障碍。基因疗法的研究与应用范围正在迅速扩展至获得性疾病，基因转移可能是血管再狭窄的一种很有希望的治疗手段。再狭窄发生的原因复杂,但似乎主要是再狭窄局部有关因素控制不力,特别是与冠状动脉内皮损伤和修复不佳以及未能有效控制平滑肌细胞的增生有关。目前再狭窄研究主要是利用药物或生物制剂直接控制平滑肌细胞的增殖，然而，如果球囊损伤后局部内皮能迅速再生便可以间接地抑制内皮下平滑肌的增生。多种动物体内进行的研究表明[4]，血管壁广泛的内皮剥脱可导致内膜增厚，内皮损伤可能是动脉粥样硬化和再狭窄等血管增殖性疾病的始发因素。完整的内皮细胞层还可以防止受损血管内膜纤维化病变的发展。内皮细胞功能障碍是平滑肌细胞增生的原因之一。因此，保护移植血管内膜的完整性，通过某种机制加速内皮细胞的分裂、再生，尽快恢复内皮功能，则可间接地阻抑内膜的增殖。有人利用导管将携带人内皮细胞生长因子的真核表达质粒直接导入兔的髂动脉，7 d后发现球囊损伤后的髂动脉20mm的血管段内膜大部分被新生内皮覆盖，对照组则不到50%，随后血管造影证实，有新生内皮细胞覆盖的血管段管腔狭窄程度明显减轻[5]。
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CGRP 在体内分布广泛，并具有强大的心血管效应，它不仅能通过平滑肌细胞强烈扩张冠状动脉，而且还可以刺激内皮细胞的增殖[6]，抑制平滑肌细胞的增生[7]。本研究中我们选用逆转录病毒载体体外转染人脐静脉内皮细胞，结果表明，逆转录病毒载体可以有效地将CGRP基因导入内皮细胞并稳定表达，CGRP对内皮细胞具有明显的促分裂增殖效应。根据这一结果，我们设想在动脉粥样硬化发展的早期或于血管成形术的同时局部导入CGRP基因，在血管损伤的部位高效表达CGRP,有可能促进内皮细胞的分裂、增生，加速内皮修复，尽快恢复内皮的功能，抑制新生内膜的增殖，从而防止PTCA术后以及旁路手术后血管再狭窄的发生。
健康人血循环中CGRP的浓度目前说法不一，有人[8]报道为0.4～4.5pmol.L-1,本文用放免检测法直接测定内皮细胞培养上清的CGRP浓度，转染病毒的内皮细胞CGRP的最高分泌量达到(12.4±0.5)pmol.L-1,尽管这一数值不能与血浆中的含量直接相比，但是Haegerstrand等的研究证明[6]，CGRP用量达10 pmol.L-1时即可刺激培养的HUVEC发生增殖反应，因此，我们认为如果采用转染效率更高的表达载体进行在体转染，CGRP有可能发挥更强大的生物效应。
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逆转录病毒具有稳定、安全、高效的优点，它是基因治疗研究中最主要的基因转移载体，在血管内膜受到刺激(如球囊损伤)时，逆转录病毒载体可以成功转导血管壁细胞，不足之处在于逆转录病毒的感染滴度偏低，使其应用受到一定限制，但是，有研究表明，如果表达产物是分泌型蛋白质或多肽，即使转导效率有限，少数转导细胞(1%)表达的产物也可以通过旁分泌效应在局部产生生物学效应，逆转录病毒载体仍有其应用价值。
* 国家自然科学基金(39570310)资助项目。
参考文献
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(1998-03-27收稿), 百拇医药