RT-PCR方法检测非神经元、类神经元、神经元细胞系中淀粉样前体蛋白基因表达
作者：乌永忠 马康涛 Konrad Beyreuther△ 张迺蘅
单位：北京医科大学生物化学与分子生物学系，北京 100083；Konrad Beyreuther:德国海德堡大学分子生物学中心
关键词：聚合酶链反应；基因表达；淀粉样β蛋白前体；代谢；阿尔茨海默病；病因学
北京医科大学学报990105 摘 要 目的与方法：根据人淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)基因cDNA序列设计的引物，提取总RNA，利用RT-PCR方法检测非神经、类神经及神经细胞系APP基因的表达。结果：利用专门设计的引物不能检测野生型COS-7细胞中APP基因的表达，但可以检测转染人APP基因的非神经元类COS-7细胞，类神经元的野生型PC12及人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞中APP基因的表达。结论：利用特异设计的人APP基因引物及RT-PCR方法可以检测类神经及神经细胞系APP基因的表达。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R343.11
The expression of amyloid precusor protein gene in nonneuronal, neuron-likeand neuronal cell lines
by polymerase chain reaction
WU Yong-Zhong＃, MA Kang-Tao, Konrad Beyreuther△, ZHANG Nai-Heng
(#Department of Biochemistry and Molecular Biology, Beijing Medical University, Beijing 100083)
, 百拇医药
MeSH Polymerase chain Reaction Gene expression Amyloid bata-protein precursor/metab Alzheimer's disease/etiol
ABSTRACT Objective and Methods: According to the cDNA sequence of human amyloid precusor protein (APP), gene, a pair of specific primer were designed to detect the expression of APP gene in noneuronal, neuron-like and neuronal cell lines by RT-PCR. Results: No amplification products was observed in noneuronal wild COS-7 cells, but we can detect the expression of APP gene in COS-7 cell transfected with human APP gene, neuron-like wild PC12 cells and human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Conclusion: Specifically designed primer and RT-PCR can be used to assay the level of human APP gene in neuron-like and neuronal cell lines.
, 百拇医药
(J Beijing Med Univ, 1999,31:17-19)
阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD) 是造成老年人痴呆的最主要原因，越来越多的实验表明淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP),基因的点突变、过表达及其代谢异常所引起的淀粉样蛋白(β-amyloid protein, Aβ)的累积是造成AD的重要原因之一[1～3]。因此研究不同组织及细胞中人淀粉样前体蛋白基因表达水平的变化对认识AD的发病机制具有重要意义。RT-PCR具有方法简单、灵敏度高、特异性强，且适应于大批量不同样品的检测等优点。为此我们根据人APP695基因的序列设计了一对引物[4]。利用该引物可以扩增出包含APP基因第16，17外显子的编码人淀粉样蛋白C-末端100个氨基酸的300 bp的cDNA片段。该片段含有完整的Aβ序列。以期用RT-PCR方法检测不同细胞系中APP基因的表达。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 所用细胞
野生型COS-7 细胞，转染人APP695基因的COS-7细胞(COS-695)及转染人APP695基因C-末端100个氨基酸cDNA片段且带有信号肽的COS-7细胞(COS-SPA4CT)，野生型人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)均由德国海德堡大学分子生物学中心Konrad Beyreuther 教授提供；野生型大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞PC12由中国医学科学院基础所蔡良琬教授馈赠；转染人APP695C-末端COS-7细胞(COS-CT)为本室制备。
细胞培养：SH-SY5Y细胞，高糖达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco modified Eagle medium, DMEM)+体积分数为10%的胎牛血清；PC12细胞，高糖DMEM+体积分数为10 %的胎牛血清+体积分数为5%的马血清；COS-695，COS-SPA4CT，高糖DMEM+体积分数为10%的胎牛血清+0.4 g*L-1潮霉素，上述细胞均在体积分数为5%CO2，37 ℃条件下培养。
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1.2 引物
上游引物K1
5′-(TTGGGCCCATGGATGCAGAATTCCGACAT)-3′
下游引物K2
5′-(TTGGATCCCGAGTTCTTCATCTTCT)-3′
1.3 总RNA提取
利用GIBCO/BRL公司的Trizol试剂盒,按说明书进行细胞总RNA的提取，然后用Promega公司的RQ1 RNase free DNase (1 u/μg)于37 ℃消化可能残存的DNA，再用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀获得纯化的RNA。
1.4 RT-PCR反应
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利用Promega公司的单管双酶RT-PCR系统Access-RT-PCR试剂盒,按说明书进行RT-PCR反应。反应过程为48 ℃反转录45 min，94 ℃灭活反转录酶2 min。扩增循环为94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共进行42轮循环。
1.5 产物的分析
取扩增产物10 μl，用每100 ml 1g琼脂糖凝胶进行电泳与Promega公司的1 kb DNA梯度标准物比较，然后在Ever-gene自动成像仪上照相。
2 结果
2.1 野生型及转染的COS-7细胞中APP基因表达检测(图1)
1，DNA marker 1 kb DNA ladder； 2，negative control， no reverse transcriptase in RT-PCR； 3,4,5,6 COS-7, COS-695, COS-SPA4CT, COS-CT cell lines.
, 百拇医药
图1 野生型及转染的COS-7细胞中APP基因表达的检测
Figure 1 The expression of APP gene in wild
and transfected COS-7 cell lines
以1 μg总RNA为模板进行RT-PCR反应，结果表明野生型COS-7细胞中没有扩增出预计条带，而3种转染人APP基因及其部分序列的COS-7细胞中均可扩增出目的条带。且扩增产物量不同，COS-SPA4CT最多，COS-695次之，而COS-CT最少。
2.2 野生型PC12细胞APP基因表达检测(图2)
M，DNA marker 1 kb DNA ladder； lane 1-7, 106,105,104,103,102,10,1 pg cell total RNA RT-PCR products; line 8， negative control: no reverse transcriptase in RT-PCR.
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图2 野生型PC12细胞APP基因表达的检测
Figure 2 The expression of APP gene in wild PC12 cell lines
将细胞总RNA用无RNase的水稀释到106、105、104、103、102、10、1 pg,进行RT-PCR反应。结果表明利用PC12细胞总RNA可以扩增出300 bp的预计条带，且随RNA量的减少扩增产物递减，最小检出量为1 ng。图中250 bp前的条带为引物聚合体。
2.3 野生型SH-SY5Y细胞APP基因表达检测(图3)
M， DNA marker 1 kb DNA ladder； lane 1-6， 106,105,0,103,102,10
, 百拇医药
pg cell total RNA RT-PCR products.
图3 SH-SY5Y细胞APP基因的表达产物分析
Figure 3 The expression of APP gene in wild SH-SY5Y cell lines
按2.2同样的方法对不同稀释度的野生型SH-SY5Y细胞总RNA进行RT-PCR，也获得了预计的300 bp的条带，且扩增产物与模板呈剂量依赖性关系。最小检出量为100 pg。图中250 bp前的条带为引物聚合体。
3 讨论
本室以前工作表明Northern方法可研究IL-1β刺激SH-SY5Y细胞前后APP基因的表达[5]。但RNA用量大(达30 μg),需大量培养细胞。同样用Northern方法研究了IL-1β刺激PC12细胞前后APP基因表达的变化(30 μg RNA)，却未检测到杂交信号，可能系PC12细胞APP基因表达水平低，且与人APP基因的同源性较差，故利用人APP基因B2.3片段作探针检测不到APP基因RNA的表达。
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本实验表明，利用所设计的引物未能检测到野生型COS-7细胞中APP基因的表达，但可以检测转染人APP基因的COS-7细胞中APP基因RNA水平的变化。我们认为这可能是COS-7细胞APP基因与人APP基因同源性较差，故根据人APP基因设计的引物不能检测其表达。本研究表明利用设计的引物及RT-PCR反应条件可以检测到类神经元的野生型PC12及神经类细胞SH-SY5Y细胞APP基因的表达，最低检出量分别为1 ng和100 pg。且两种细胞系扩增产物与总RNA用量呈剂量依赖性关系。实验表明，根据人APP基因cDNA设计的引物及RT-PCR反应条件不能检测非神经细胞中APP基因的变化，但可以较好地研究类神经元及神经细胞系中APP基因表达水平的变化。为探讨各种药物刺激所引起APP基因表达的变化及阐明APP代谢与AD发病之间的关系提供了简便快速而有效的方法。
参考文献
1 Selkoe DJ. Alzheimer's disease:genotypes, phenotype, and treatments, Science, 1997，275:630-631
, 百拇医药
2 Smith C， Anderton BH. The molecular pathology of Alzheimer's disease. Neuropathol Appl Neurobiol, 1994，20:322-338
3 Hendriks L， Broeckhoven BV. The βA4 amyloid precursor protein gene and Alzheimer's disease. Eur J Biochem, 1996,237:6-15
4 Kang J, Lemaire H, Unterbec A, et al. The precursor of Alzheimer's disease amyloid A4 protein resembles a cell-surface receptor. Nature, 1987,325:733-736
5 王少文，马康涛，张迺蘅.IL-1β对β淀粉样前体蛋白基因在人神经母细胞瘤细胞株中表达的调节作用.生物化学杂志, 1994，13(2):141-144
(1998-04-10收稿)
(本文编辑：王 蕾), 百拇医药
单位：北京医科大学生物化学与分子生物学系，北京 100083；Konrad Beyreuther:德国海德堡大学分子生物学中心
关键词：聚合酶链反应；基因表达；淀粉样β蛋白前体；代谢；阿尔茨海默病；病因学
北京医科大学学报990105 摘 要 目的与方法：根据人淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)基因cDNA序列设计的引物，提取总RNA，利用RT-PCR方法检测非神经、类神经及神经细胞系APP基因的表达。结果：利用专门设计的引物不能检测野生型COS-7细胞中APP基因的表达，但可以检测转染人APP基因的非神经元类COS-7细胞，类神经元的野生型PC12及人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞中APP基因的表达。结论：利用特异设计的人APP基因引物及RT-PCR方法可以检测类神经及神经细胞系APP基因的表达。
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中国图书资料分类法分类号 R343.11
The expression of amyloid precusor protein gene in nonneuronal, neuron-likeand neuronal cell lines
by polymerase chain reaction
WU Yong-Zhong＃, MA Kang-Tao, Konrad Beyreuther△, ZHANG Nai-Heng
(#Department of Biochemistry and Molecular Biology, Beijing Medical University, Beijing 100083)
, 百拇医药
MeSH Polymerase chain Reaction Gene expression Amyloid bata-protein precursor/metab Alzheimer's disease/etiol
ABSTRACT Objective and Methods: According to the cDNA sequence of human amyloid precusor protein (APP), gene, a pair of specific primer were designed to detect the expression of APP gene in noneuronal, neuron-like and neuronal cell lines by RT-PCR. Results: No amplification products was observed in noneuronal wild COS-7 cells, but we can detect the expression of APP gene in COS-7 cell transfected with human APP gene, neuron-like wild PC12 cells and human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Conclusion: Specifically designed primer and RT-PCR can be used to assay the level of human APP gene in neuron-like and neuronal cell lines.
, 百拇医药
(J Beijing Med Univ, 1999,31:17-19)
阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD) 是造成老年人痴呆的最主要原因，越来越多的实验表明淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP),基因的点突变、过表达及其代谢异常所引起的淀粉样蛋白(β-amyloid protein, Aβ)的累积是造成AD的重要原因之一[1～3]。因此研究不同组织及细胞中人淀粉样前体蛋白基因表达水平的变化对认识AD的发病机制具有重要意义。RT-PCR具有方法简单、灵敏度高、特异性强，且适应于大批量不同样品的检测等优点。为此我们根据人APP695基因的序列设计了一对引物[4]。利用该引物可以扩增出包含APP基因第16，17外显子的编码人淀粉样蛋白C-末端100个氨基酸的300 bp的cDNA片段。该片段含有完整的Aβ序列。以期用RT-PCR方法检测不同细胞系中APP基因的表达。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 所用细胞
野生型COS-7 细胞，转染人APP695基因的COS-7细胞(COS-695)及转染人APP695基因C-末端100个氨基酸cDNA片段且带有信号肽的COS-7细胞(COS-SPA4CT)，野生型人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)均由德国海德堡大学分子生物学中心Konrad Beyreuther 教授提供；野生型大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞PC12由中国医学科学院基础所蔡良琬教授馈赠；转染人APP695C-末端COS-7细胞(COS-CT)为本室制备。
细胞培养：SH-SY5Y细胞，高糖达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco modified Eagle medium, DMEM)+体积分数为10%的胎牛血清；PC12细胞，高糖DMEM+体积分数为10 %的胎牛血清+体积分数为5%的马血清；COS-695，COS-SPA4CT，高糖DMEM+体积分数为10%的胎牛血清+0.4 g*L-1潮霉素，上述细胞均在体积分数为5%CO2，37 ℃条件下培养。
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1.2 引物
上游引物K1
5′-(TTGGGCCCATGGATGCAGAATTCCGACAT)-3′
下游引物K2
5′-(TTGGATCCCGAGTTCTTCATCTTCT)-3′
1.3 总RNA提取
利用GIBCO/BRL公司的Trizol试剂盒,按说明书进行细胞总RNA的提取，然后用Promega公司的RQ1 RNase free DNase (1 u/μg)于37 ℃消化可能残存的DNA，再用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀获得纯化的RNA。
1.4 RT-PCR反应
, http://www.100md.com
利用Promega公司的单管双酶RT-PCR系统Access-RT-PCR试剂盒,按说明书进行RT-PCR反应。反应过程为48 ℃反转录45 min，94 ℃灭活反转录酶2 min。扩增循环为94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共进行42轮循环。
1.5 产物的分析
取扩增产物10 μl，用每100 ml 1g琼脂糖凝胶进行电泳与Promega公司的1 kb DNA梯度标准物比较，然后在Ever-gene自动成像仪上照相。
2 结果
2.1 野生型及转染的COS-7细胞中APP基因表达检测(图1)
1，DNA marker 1 kb DNA ladder； 2，negative control， no reverse transcriptase in RT-PCR； 3,4,5,6 COS-7, COS-695, COS-SPA4CT, COS-CT cell lines.
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图1 野生型及转染的COS-7细胞中APP基因表达的检测
Figure 1 The expression of APP gene in wild
and transfected COS-7 cell lines
以1 μg总RNA为模板进行RT-PCR反应，结果表明野生型COS-7细胞中没有扩增出预计条带，而3种转染人APP基因及其部分序列的COS-7细胞中均可扩增出目的条带。且扩增产物量不同，COS-SPA4CT最多，COS-695次之，而COS-CT最少。
2.2 野生型PC12细胞APP基因表达检测(图2)
M，DNA marker 1 kb DNA ladder； lane 1-7, 106,105,104,103,102,10,1 pg cell total RNA RT-PCR products; line 8， negative control: no reverse transcriptase in RT-PCR.
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图2 野生型PC12细胞APP基因表达的检测
Figure 2 The expression of APP gene in wild PC12 cell lines
将细胞总RNA用无RNase的水稀释到106、105、104、103、102、10、1 pg,进行RT-PCR反应。结果表明利用PC12细胞总RNA可以扩增出300 bp的预计条带，且随RNA量的减少扩增产物递减，最小检出量为1 ng。图中250 bp前的条带为引物聚合体。
2.3 野生型SH-SY5Y细胞APP基因表达检测(图3)
M， DNA marker 1 kb DNA ladder； lane 1-6， 106,105,0,103,102,10
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pg cell total RNA RT-PCR products.
图3 SH-SY5Y细胞APP基因的表达产物分析
Figure 3 The expression of APP gene in wild SH-SY5Y cell lines
按2.2同样的方法对不同稀释度的野生型SH-SY5Y细胞总RNA进行RT-PCR，也获得了预计的300 bp的条带，且扩增产物与模板呈剂量依赖性关系。最小检出量为100 pg。图中250 bp前的条带为引物聚合体。
3 讨论
本室以前工作表明Northern方法可研究IL-1β刺激SH-SY5Y细胞前后APP基因的表达[5]。但RNA用量大(达30 μg),需大量培养细胞。同样用Northern方法研究了IL-1β刺激PC12细胞前后APP基因表达的变化(30 μg RNA)，却未检测到杂交信号，可能系PC12细胞APP基因表达水平低，且与人APP基因的同源性较差，故利用人APP基因B2.3片段作探针检测不到APP基因RNA的表达。
, http://www.100md.com
本实验表明，利用所设计的引物未能检测到野生型COS-7细胞中APP基因的表达，但可以检测转染人APP基因的COS-7细胞中APP基因RNA水平的变化。我们认为这可能是COS-7细胞APP基因与人APP基因同源性较差，故根据人APP基因设计的引物不能检测其表达。本研究表明利用设计的引物及RT-PCR反应条件可以检测到类神经元的野生型PC12及神经类细胞SH-SY5Y细胞APP基因的表达，最低检出量分别为1 ng和100 pg。且两种细胞系扩增产物与总RNA用量呈剂量依赖性关系。实验表明，根据人APP基因cDNA设计的引物及RT-PCR反应条件不能检测非神经细胞中APP基因的变化，但可以较好地研究类神经元及神经细胞系中APP基因表达水平的变化。为探讨各种药物刺激所引起APP基因表达的变化及阐明APP代谢与AD发病之间的关系提供了简便快速而有效的方法。
参考文献
1 Selkoe DJ. Alzheimer's disease:genotypes, phenotype, and treatments, Science, 1997，275:630-631
, 百拇医药
2 Smith C， Anderton BH. The molecular pathology of Alzheimer's disease. Neuropathol Appl Neurobiol, 1994，20:322-338
3 Hendriks L， Broeckhoven BV. The βA4 amyloid precursor protein gene and Alzheimer's disease. Eur J Biochem, 1996,237:6-15
4 Kang J, Lemaire H, Unterbec A, et al. The precursor of Alzheimer's disease amyloid A4 protein resembles a cell-surface receptor. Nature, 1987,325:733-736
5 王少文，马康涛，张迺蘅.IL-1β对β淀粉样前体蛋白基因在人神经母细胞瘤细胞株中表达的调节作用.生物化学杂志, 1994，13(2):141-144
(1998-04-10收稿)
(本文编辑：王 蕾), 百拇医药