小鼠胚卵石蜡切片及免疫组织化学染色方法*
作者：吕丹瑜 李 英
单位：北京医科大学组织学与胚胎学系，北京 100083
关键词：
北京医科大学学报990119 摘 要 目的：探讨小鼠肝内胆红素葡萄糖醛酸化的性别差异及原因。方法：提取C57BL/6J小鼠肝微粒体，检测胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(B-UGT)的活性及Lubrol Px激活后活性，并以Northern印迹杂交检测肝内B-UGT基因的表达，比较雌、雄小鼠之间的差别。结果：雄性小鼠B-UGT活性比雌性小鼠高，激活后B-UGT活性雄性小鼠比雌性小鼠更高，雄性小鼠肝内B-UGT基因有更高mRNA水平的表达。结论：雄性小鼠B-UGT活性高于雌性小鼠可能与基因表达及酶功能状态的差异有关。
中国图书资料分类法分类号 Q555-332
Gender-related differences in the activity of hepatic
, http://www.100md.com
bilirubin UDP-glucuronosyltransferase of C57BL/6J mice
ZHANG Hong-Jun, ZHU Xue-Guang, YE Ying-Jiang
(Department of General Surgery, People's Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100044)
MeSH Glucuronosyltransferase/metab Bilirubin/metab Liver/metab Sex factors
ABSTRACT Objective: To study the gender-related differences in glucuronidation of bilirubin and its cause. Methods: Microsomes were extracted from livers of C57BL/6J mice, the activities of both native and activated bilirubin UDP-glucuronosyltransferase (B-UGT) with Lubrol Px in microsomes of mice were measured, and the expression of hepatic B-UGT gene in both male and female mice was analysed by Northern blotting. Results: The male mice not only had higher enzymatic activities in both native and activated B-UGT than that of the female mice, but also exhibited stronger expression level of hepatic B-UGT gene mRNA in male mice than that in female mice. Conclusion:A significant gender-related difference did exist in the glucuronidation of bilirubin in mice. The stronger expression level of hepatic B-UGT gene mRNA in male mice might be responsible for the above-mentioned activity differences.
, 百拇医药
(J Beijing Med Univ, 1999,31:65-66)
胆红素代谢异常是胆石症重要的发病因素。胆汁中未结合胆红素增多，结合钙形成胆红素钙沉淀，促进胆色素结石的形成，胆汁中单结合胆红素增多能促进胆固醇析出、胆固醇结石成核[1]。胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(bilirubin UDP-glucuronosyltransferase, B-UGT)是胆红素代谢的关键酶，而胆石症的发病又与性别有关[2]，因此研究肝内B-UGT酶的活性及性别差异，显得尤为重要。
1 材料与方法
1.1 材料
试剂：胆红素，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(uridine diphosphate glucuronic acid, UDPGA)，聚氧化乙烯乙醚W-1( polyoxyethylene ether W-1, Lubrol Px) 为Sigma 产品。戊酮-2，邻氨基苯甲酸乙酯(ethylanthranilate)为Fluka 产品。α-32p-dCTP为北京亚辉生物工程公司产品。总RNA 提取试剂盒，随机引物标记试剂盒为Promega 产品。
, http://www.100md.com
动物：C57BL/6J成年小鼠，雌、雄各8只，由北京医科大学实验动物部提供。
1.2 方法
肝微粒体的制备：参照Siekevitz标准程序[3]进行。
肝微粒体蛋白含量的测定：参照Bradford方法[4]，应用考马斯亮蓝G-250染色法。
肝B-UGT活性(N)的测定：应用偶氮化的邻氨基苯甲酸乙酯定量胆红素的单及双葡萄糖醛酸化产物，参照Burchell方法[5]。
肝B-UGT的激活后活性(A)及酶潜能的测定：用Lubrol Px对微粒体进行预处理,按照Sanchz Pozzi的方法[6]，Lubrol Px与微粒体的质量比为0.2,微粒体的量以蛋白浓度表示。室温孵育10 min后按上述方法然后测定酶的活性，酶潜能计算公式为：(A-N)/N×100% ，N代表酶的天然活性，A代表激活后酶活性。
, 百拇医药
Northern 印迹杂交：按分子杂交常规进行。以α-32p-dCTP标记的小鼠肝B-UGT基因的cDNA[7]为探针，并以小鼠β-actin基因的cDNA重复杂交，作为内参照以校正RNA上样量的不同，杂交后结果进行图像扫描分析，得到样品的积分光密度值(IOD)。
统计方法：酶活性结果以
±s表示，以两样本均数的双侧t检验进行差异显著性的判断,P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 不同性别小鼠肝微粒体B-UGT活性及酶潜能的差异(表1)
表1 肝微粒体天然及激活后B-UGT活性
(以每毫克微粒体蛋白每分钟作用产生的
, 百拇医药
胆红素葡萄糖醛酸化产物量表示)及酶潜能的性别差异
Table 1 Gender-related differences in the activities
of native B-UGT and activated B-UGT(bilirubin
glucuronidation nmol.min-1.mg-1 microsomal protein)
n(bilirubin glucuronidation)/nmol
Native
Lubrol Px
, 百拇医药
Latency(%)
Male(n=8)
3.2±0.3*
10.3±1.1*
229±41*
Female(n=8)
2.8±0.3
7.7±1.0
172±38
*P<0.01， male vs female.
雄性小鼠微粒体B-UGT的活性比雌性小鼠显著升高(P<0.01)，Lubrol Px激活后雌、雄性小鼠B-UGT活性皆明显增高，但雄性小鼠比雌性小鼠增高更显著(P<0.01)，由前两个结果计算所得的雄性小鼠B-UGT酶潜能显著大于雌性(P<0.01)。
, 百拇医药
2.2 不同性别小鼠肝B-UGT基因表达的差异
雄性小鼠肝B-UGT基因mRNA的表达高于雌性小鼠，图像分析得到的IOD值分别为89±12和69±8，差别有显著性(P<0.05)。
3 讨论
本研究结果表明，不同性别的C57BL/6J小鼠之间肝B-UGT酶活性明显不同，雄性小鼠显著高于雌性，这个结果与其它动物某些酶类如细胞色素P450同工酶、谷胱甘肽转移酶等活性的性别差异研究结果相似[8]。
在探讨造成肝B-UGT活性性别差异的原因时，发现肝B-UGT基因在转录水平上就存在性别差异，Northern印迹杂交结果显示雄性小鼠mRNA水平明显高于雌性小鼠，由此可能造成不同性别的小鼠肝B-UGT的酶蛋白含量不同，推测这可能是造成不同性别小鼠肝B-UGT活性不同的原因之一。
, 百拇医药
Lubrol Px是一种去垢剂，能消除微粒体膜脂质成分对酶活性的影响，可作为评价膜微环境对酶醛酸化活性影响的工具。本实验用Lubrol Px处理微粒体膜后，雌性小鼠肝B-UGT活性增加约1.72倍，而雄性小鼠增加约2.29倍之多，增加的酶活性即酶的潜能，酶潜能实际上反映了酶活性受限制的程度，即微粒体膜的结构、脂质成分、流动性等构成的微环境对酶活性的影响。本实验结果显示雄性小鼠B-UGT有更高的潜能，说明微环境对其功能状态影响更大，酶的活性可能受到了更大的限制，尽管如此，雄性小鼠肝仍显示了较雌性小鼠更强的代谢胆红素的能力。
关于性别因素对酶基因表达的调节及对酶功能状态的影响，有资料表明大鼠体内某些蛋白的表达受血液内生长激素的调节。性激素可能通过对下丘脑-垂体轴的作用，控制生长激素的分泌，间接影响肝内基因的表达，进而造成蛋白表达的性别差异[9]。肝B-UGT基因的表达是否也受类似的途径调节，还需进一步证实。
参考文献
, 百拇医药
1 王人灏，祝学光，韩建德，等.单结合胆红素促成核活性的研究.中华外科杂志, 1995,33:662-665
2 Ayyad N, Cohen BI, Mosbach EH, et al. Age, sex and source of hamster affect experimental cholesterol cholelithiasis. Lipids, 1993,28(1):981-986
3 Siekevitz P. Preparation of microsomes and submicrosomal fractions. Methods Enzymol, 1962,5:61-68
4 Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976,72:248-254
, 百拇医药
5 Burchell B. Bilirubin UDP-glucuronosyltransferase. Methods Enzymol, 1981,77:188-192
6 Sanchz Pozzi EJ, Catania VA, Luquita MG, et al. Effect of oral administration of ursodeoxycholic acid on rat hepatic and intestinal UDP-glucuronosyltransferase. Can J Physiol Pharmacol, 1994,72:1265-1271
7 Kong AT, Ma M, Tao D, et al. Molecular cloning of two cDNAs encoding the mouse bilirubin/phenol family of UDP-glucuronosyltransferase(mUGT Br/P). Pharm Res, 1993,10(3):461-465
, 百拇医药
8 Kobliakov V, Popova N, Rossi L. Regulation of the expression of the sex-specific isoforms cytochrome p-450 in rat liver. Eur J Biochem, 1991,195:585-591.
9 Waxman DJ, Pampori NA, Ram PA, et al. Interpulse interval in circulation growth hormone patterns regulates sexually dimorphic expression of hepatic cytochrome p450. Proc Natl Acad Sci USA ,1991, 88: 6868-6872
(1998-04-14收稿), 百拇医药
单位：北京医科大学组织学与胚胎学系，北京 100083
关键词：
北京医科大学学报990119 摘 要 目的：探讨小鼠肝内胆红素葡萄糖醛酸化的性别差异及原因。方法：提取C57BL/6J小鼠肝微粒体，检测胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(B-UGT)的活性及Lubrol Px激活后活性，并以Northern印迹杂交检测肝内B-UGT基因的表达，比较雌、雄小鼠之间的差别。结果：雄性小鼠B-UGT活性比雌性小鼠高，激活后B-UGT活性雄性小鼠比雌性小鼠更高，雄性小鼠肝内B-UGT基因有更高mRNA水平的表达。结论：雄性小鼠B-UGT活性高于雌性小鼠可能与基因表达及酶功能状态的差异有关。
中国图书资料分类法分类号 Q555-332
Gender-related differences in the activity of hepatic
, http://www.100md.com
bilirubin UDP-glucuronosyltransferase of C57BL/6J mice
ZHANG Hong-Jun, ZHU Xue-Guang, YE Ying-Jiang
(Department of General Surgery, People's Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100044)
MeSH Glucuronosyltransferase/metab Bilirubin/metab Liver/metab Sex factors
ABSTRACT Objective: To study the gender-related differences in glucuronidation of bilirubin and its cause. Methods: Microsomes were extracted from livers of C57BL/6J mice, the activities of both native and activated bilirubin UDP-glucuronosyltransferase (B-UGT) with Lubrol Px in microsomes of mice were measured, and the expression of hepatic B-UGT gene in both male and female mice was analysed by Northern blotting. Results: The male mice not only had higher enzymatic activities in both native and activated B-UGT than that of the female mice, but also exhibited stronger expression level of hepatic B-UGT gene mRNA in male mice than that in female mice. Conclusion:A significant gender-related difference did exist in the glucuronidation of bilirubin in mice. The stronger expression level of hepatic B-UGT gene mRNA in male mice might be responsible for the above-mentioned activity differences.
, 百拇医药
(J Beijing Med Univ, 1999,31:65-66)
胆红素代谢异常是胆石症重要的发病因素。胆汁中未结合胆红素增多，结合钙形成胆红素钙沉淀，促进胆色素结石的形成，胆汁中单结合胆红素增多能促进胆固醇析出、胆固醇结石成核[1]。胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(bilirubin UDP-glucuronosyltransferase, B-UGT)是胆红素代谢的关键酶，而胆石症的发病又与性别有关[2]，因此研究肝内B-UGT酶的活性及性别差异，显得尤为重要。
1 材料与方法
1.1 材料
试剂：胆红素，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(uridine diphosphate glucuronic acid, UDPGA)，聚氧化乙烯乙醚W-1( polyoxyethylene ether W-1, Lubrol Px) 为Sigma 产品。戊酮-2，邻氨基苯甲酸乙酯(ethylanthranilate)为Fluka 产品。α-32p-dCTP为北京亚辉生物工程公司产品。总RNA 提取试剂盒，随机引物标记试剂盒为Promega 产品。
, http://www.100md.com
动物：C57BL/6J成年小鼠，雌、雄各8只，由北京医科大学实验动物部提供。
1.2 方法
肝微粒体的制备：参照Siekevitz标准程序[3]进行。
肝微粒体蛋白含量的测定：参照Bradford方法[4]，应用考马斯亮蓝G-250染色法。
肝B-UGT活性(N)的测定：应用偶氮化的邻氨基苯甲酸乙酯定量胆红素的单及双葡萄糖醛酸化产物，参照Burchell方法[5]。
肝B-UGT的激活后活性(A)及酶潜能的测定：用Lubrol Px对微粒体进行预处理,按照Sanchz Pozzi的方法[6]，Lubrol Px与微粒体的质量比为0.2,微粒体的量以蛋白浓度表示。室温孵育10 min后按上述方法然后测定酶的活性，酶潜能计算公式为：(A-N)/N×100% ，N代表酶的天然活性，A代表激活后酶活性。
, 百拇医药
Northern 印迹杂交：按分子杂交常规进行。以α-32p-dCTP标记的小鼠肝B-UGT基因的cDNA[7]为探针，并以小鼠β-actin基因的cDNA重复杂交，作为内参照以校正RNA上样量的不同，杂交后结果进行图像扫描分析，得到样品的积分光密度值(IOD)。
统计方法：酶活性结果以
±s表示，以两样本均数的双侧t检验进行差异显著性的判断,P<0.05为有统计学意义。2 结果
2.1 不同性别小鼠肝微粒体B-UGT活性及酶潜能的差异(表1)
表1 肝微粒体天然及激活后B-UGT活性
(以每毫克微粒体蛋白每分钟作用产生的
, 百拇医药
胆红素葡萄糖醛酸化产物量表示)及酶潜能的性别差异
Table 1 Gender-related differences in the activities
of native B-UGT and activated B-UGT(bilirubin
glucuronidation nmol.min-1.mg-1 microsomal protein)
n(bilirubin glucuronidation)/nmol
Native
Lubrol Px
, 百拇医药
Latency(%)
Male(n=8)
3.2±0.3*
10.3±1.1*
229±41*
Female(n=8)
2.8±0.3
7.7±1.0
172±38
*P<0.01， male vs female.
雄性小鼠微粒体B-UGT的活性比雌性小鼠显著升高(P<0.01)，Lubrol Px激活后雌、雄性小鼠B-UGT活性皆明显增高，但雄性小鼠比雌性小鼠增高更显著(P<0.01)，由前两个结果计算所得的雄性小鼠B-UGT酶潜能显著大于雌性(P<0.01)。
, 百拇医药
2.2 不同性别小鼠肝B-UGT基因表达的差异
雄性小鼠肝B-UGT基因mRNA的表达高于雌性小鼠，图像分析得到的IOD值分别为89±12和69±8，差别有显著性(P<0.05)。
3 讨论
本研究结果表明，不同性别的C57BL/6J小鼠之间肝B-UGT酶活性明显不同，雄性小鼠显著高于雌性，这个结果与其它动物某些酶类如细胞色素P450同工酶、谷胱甘肽转移酶等活性的性别差异研究结果相似[8]。
在探讨造成肝B-UGT活性性别差异的原因时，发现肝B-UGT基因在转录水平上就存在性别差异，Northern印迹杂交结果显示雄性小鼠mRNA水平明显高于雌性小鼠，由此可能造成不同性别的小鼠肝B-UGT的酶蛋白含量不同，推测这可能是造成不同性别小鼠肝B-UGT活性不同的原因之一。
, 百拇医药
Lubrol Px是一种去垢剂，能消除微粒体膜脂质成分对酶活性的影响，可作为评价膜微环境对酶醛酸化活性影响的工具。本实验用Lubrol Px处理微粒体膜后，雌性小鼠肝B-UGT活性增加约1.72倍，而雄性小鼠增加约2.29倍之多，增加的酶活性即酶的潜能，酶潜能实际上反映了酶活性受限制的程度，即微粒体膜的结构、脂质成分、流动性等构成的微环境对酶活性的影响。本实验结果显示雄性小鼠B-UGT有更高的潜能，说明微环境对其功能状态影响更大，酶的活性可能受到了更大的限制，尽管如此，雄性小鼠肝仍显示了较雌性小鼠更强的代谢胆红素的能力。
关于性别因素对酶基因表达的调节及对酶功能状态的影响，有资料表明大鼠体内某些蛋白的表达受血液内生长激素的调节。性激素可能通过对下丘脑-垂体轴的作用，控制生长激素的分泌，间接影响肝内基因的表达，进而造成蛋白表达的性别差异[9]。肝B-UGT基因的表达是否也受类似的途径调节，还需进一步证实。
参考文献
, 百拇医药
1 王人灏，祝学光，韩建德，等.单结合胆红素促成核活性的研究.中华外科杂志, 1995,33:662-665
2 Ayyad N, Cohen BI, Mosbach EH, et al. Age, sex and source of hamster affect experimental cholesterol cholelithiasis. Lipids, 1993,28(1):981-986
3 Siekevitz P. Preparation of microsomes and submicrosomal fractions. Methods Enzymol, 1962,5:61-68
4 Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976,72:248-254
, 百拇医药
5 Burchell B. Bilirubin UDP-glucuronosyltransferase. Methods Enzymol, 1981,77:188-192
6 Sanchz Pozzi EJ, Catania VA, Luquita MG, et al. Effect of oral administration of ursodeoxycholic acid on rat hepatic and intestinal UDP-glucuronosyltransferase. Can J Physiol Pharmacol, 1994,72:1265-1271
7 Kong AT, Ma M, Tao D, et al. Molecular cloning of two cDNAs encoding the mouse bilirubin/phenol family of UDP-glucuronosyltransferase(mUGT Br/P). Pharm Res, 1993,10(3):461-465
, 百拇医药
8 Kobliakov V, Popova N, Rossi L. Regulation of the expression of the sex-specific isoforms cytochrome p-450 in rat liver. Eur J Biochem, 1991,195:585-591.
9 Waxman DJ, Pampori NA, Ram PA, et al. Interpulse interval in circulation growth hormone patterns regulates sexually dimorphic expression of hepatic cytochrome p450. Proc Natl Acad Sci USA ,1991, 88: 6868-6872
(1998-04-14收稿), 百拇医药