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编号:10266538
离体甲的甲真菌病模型研究
http://www.100md.com 《首都医科大学学报》 1999年第3期
     作者:马映宇 张文娟 蔡永明 桑菊花

    单位:北京医科大学人民医院皮肤科,北京 100044

    关键词:

    990333 甲真菌病是真菌侵犯甲板引起的感染性疾病。发病率为2%~13%,是最常见的甲疾病。甲癣则是皮肤癣菌侵犯甲板引起的甲病。为探讨不同真菌在甲真菌病中的致病作用及凝集素组织化学染色法对判断甲真菌病病原菌的意义,特制备离体甲的甲真菌病模型,进行组织病理检查、扫描电镜观察,并研究甲板中真菌与4种不同凝集素的结合形式。

    1 材料与方法

    受试菌株:红色毛癣菌(15730)、须癣毛癣菌(14557)、絮状表皮癣菌(14283)、犬小孢子菌(14968)、白念珠菌(72304)、克柔氏念珠菌(11326)各3株,由北京医科大学真菌与真菌病研究中心赠送;近平滑念珠菌、短帚霉各3株,由中国医学科学院皮肤病研究所赠送;断发毛癣菌、串珠镰刀菌、黄曲霉、产黄青霉各3株,为我院真菌实验室保存菌种。
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    甲标本:远端修剪法,剪取未服用系统性抗真菌药物的健康成人正常指甲,修成约3 mm×3 mm大小。

    试剂:①生物素标记凝集素:刀豆凝集素(ConA)、花生凝集素(PNA)、麦胚凝集素(WGA)、琥珀酸麦胚凝集素(SWGA),购自Vector公司;②卵白素过氧化物酶复合物,购自Vector公司;③二氨基联苯胺(DAB),购自Zymed公司。

    仪器:扫描电镜(日立公司)。

    制备真菌悬液:取培养基表面菌落,置于灭菌生理盐水,振荡,过滤,调节孢子数浓度至107 ml-1

    制作甲真菌病模型:将甲标本腹侧向上置于灭菌载玻片上,在灭菌培养皿中用U形玻璃管架空载玻片,滴加30 μl真菌悬液于甲板腹侧面。27 ℃恒温箱中孵育2周,每日在培养皿中加入5 ml蒸馏水以保持湿度。空白对照:用生理盐水取代真菌悬液,其余步骤及孵育条件同上。
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    制备组织病理切片,进行PAS染色:按照张文娟[1]报告的改良组织病理法。

    扫描电镜观察:甲标本经临界点干燥仪干燥,离子溅射仪喷金,扫描电镜观察。

    凝集素组织化学染色:按照高明阳[2]报告的方法。

    2 结果

    2.1 组织病理检查及扫描电镜观察

    红色毛癣菌、须癣毛癣菌及断发毛癣菌有很强的破坏甲板能力,造成甲板疏松易碎。扫描电镜观察到甲板结构被破坏,多数空洞形成。白念珠菌、近平滑念珠菌、絮状表皮癣菌、犬小孢子菌及短帚霉也有一定的侵犯甲板能力,但程度较轻。克柔氏念珠菌、黄曲霉、产黄青霉及串珠镰刀菌几乎不侵犯甲板,菌丝、孢子仅存在于甲板腹侧面浅层的空隙中,甲板仍较致密,扫描电镜下可见甲板角质细胞平行排列。皮肤癣菌多表现为平行甲板生长的细菌丝;念珠菌表现为成团酵母细胞及假菌丝;霉菌则表现各异,典型的为紊乱生长的粗大分支菌丝,也可见孢子。
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    2.2 甲真菌病模型中真菌凝集素的结合形式研究

    皮肤癣菌:ConA在红色毛癣菌呈强阳性,在须癣毛癣菌、断发毛癣菌、絮状表皮癣菌、犬小孢子菌呈阳性;PNA在5种皮肤癣菌呈阴性;WGA、sWGA在5种皮肤癣菌均呈阳性。念珠菌:ConA在3种念珠菌均呈强阳性;PNA、WGA、sWGA在3种念珠菌均呈阴性。霉菌:ConA在黄曲霉、产黄青霉、串珠镰刀菌呈强阳性,在短帚霉呈阳性;PNA在产黄青霉呈阳性,其余均呈阴性;WGA、sWGA在黄曲霉、串珠镰刀菌呈阳性,在产黄青霉、短帚霉呈阴性。

    3 讨论

    本研究表明,受试的12种真菌均可在无任何外加营养的情况下以甲板角质为营养来源而生长。不同真菌在甲板中的生长速度具有差异。用标准菌株接种正常甲,可制备离体甲的甲真菌病模型。甲模型不仅可用于观察真菌在甲板中生长方式、对甲板的侵犯能力,还可用于研究抗真菌药物在甲中的生物利用度及其药代动力学。
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    组织病理检查及扫描电镜观察结果表明,不同真菌在甲板中生长方式、大小、形态、分布及侵犯甲板能力等方面具有很大差异,提示组织病理及扫描电镜可用来对甲板中真菌进行初步分类。凝集素是一种能与糖基相互作用的蛋白质或糖蛋白,可凝集细胞或沉淀复合糖质,但不是免疫产物[3]。真菌细胞壁由多糖、几丁质及蛋白质组成。不同种属的真菌的细胞壁糖基组成、含量、结构不同。因此,凝集素可用于检测真菌细胞壁的糖基组成。

    本研究采用标准菌种进行研究,结果具有典型性。由于采用的凝集素种类较少,有一定的局限性。然而,研究结果已表明真菌在甲板中的凝集素结合形式存在属间差异、种间近似的特点。如果增加凝集素种类,可望使凝集素组织化学染色法成为鉴定甲真菌病病原菌的一种辅助手段。

    参考文献

    1 张文娟,蔡永明,桑菊花,等.甲真菌病组织病理学检查及其意义.中华皮肤科杂志, 1996,29:352-353

    2 高明阳,林熙然.几种皮肤癌及癌前病的凝集素结合形式.中华皮肤科杂志, 1991,24:317-319

    3 Goldstein IJ. What should be called a lectin? Nature, 1980,285:66

    (1998-06-17收稿), 百拇医药