小鼠电针镇痛模型的建立与实验观察*
作者：黄诚△ 万有 王晓民 韩济生
单位：北京医科大学神经科学研究所，北京 100083
关键词：电针；针刺镇痛；疾病模型；动物
990311 摘 要 目的：建立小鼠电针镇痛模型，在不同品系小鼠上观察各种电针参数引起的电针镇痛效果。方法：应用LH型HANS刺激仪，采用辐射热甩尾测痛法，比较了6种品系小鼠的电针镇痛效应。结果：(1)品系的差异：100 Hz电针时 DBA/2品系的镇痛效果显著优于其它品系，2Hz电针时DBA/2品系和BALB/c品系显著优于ICR品系；(2)性别差异：2Hz电针 DBA/2、C57、BALB/c3种品系的雌鼠优于雄鼠，100 Hz电针 仅BALB/c品系的雌鼠优于雄鼠；(3)刺激强度方面：1-2-2 mA组针效显著优于0.5-1.5-2.5 mA组或1-1.5-2mA组；(4)DBA/2和C57品系小鼠的电针镇痛与吗啡镇痛呈正相关性；(5)纳洛酮翻转：剂量为1mg.kg-1的纳络酮能翻转2 Hz电针效果；而翻转100 Hz电针效果，则需剂量为25mg.kg-1的纳络酮。结论：小鼠电针镇痛存在品系(遗传背景)和性别差异。阿片受体参与了小鼠电针镇痛，低频和高频电针镇痛分别由不同亚型的阿片受体介导。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R245-0
A mouse model for electroacupuncture-induced analgesia
and its experimental investigation
and its experimental investigation
HUANG Cheng, WAN You, WANG Xiao-Min， HAN Ji-Sheng
(Neuroscience Research Institute, Beijing Medical University, Beijing 100083)
MeSH Electroacupuncture Acupuncture analgesia Disease models, animal
, http://www.100md.com
ABSTRACT Objective: To establish a mouse model for electroacupuncture-induced analgesia (EAA) and to characterize optimal parameters of electroucupuncture (EA) and the effect of EAA in different strains of mice. Methods: Radiant heat tail flick latency was used for nociceptive test. Han's acupoint nerve stimulator (HANS, LH series) was used for EA and 6 strains of mice were screened for the effect of EAA. Results: (1) Strain difference: DBA/2 mice showed significantly better analgesic effect than other 5 strains in 100 Hz EAA, whereas in 2 Hz EAA, only DBA/2 and BALB/c mice showed significantly stronger analgesia compared with ICR mice. (2) Sex difference: Female mice showed better EAA than male. A statistically significant gender difference was seen in 3 strains of mice (DBA/2, C57, BALB/c) under 2Hz EAA, but only in one strain (BALB/c) under 100 Hz EAA. (3) Stimulation intensity: An increasing intensity of 1-2-2 mA in 10 min steps seemed optimal for both 2 Hz and 100 Hz EAA. (4) A positive correlation was observed between morphine analgesia and 100 Hz EA analgesia in DBA/2 and C57 mice. (5) EAA could be significantly reversed by the opioid antagonist naloxone at doses of 1mg.kg-1 for 2 Hz EAA and 25mg.kg-1 (but not 1 and 5 mg.kg-1) for 100 Hz EAA. Conclusion: (1) Comparison of the effect of EAA in 6 strains of mice revealed a significant strain and gender difference. (2) Naloxone blockade strategy revealed that different types of opioid receptors are involved in the mediation of low and high frequency EAA in mice.
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(J Beijing Med Univ, 1999,31:230-234)
针刺镇痛的机制研究需要动物模型作为基础，迄今为止已有大鼠、家兔、狗、猴等很多模型。在小鼠身上很早就有人进行了观察[1]，发现缺乏阿片受体的CXBK小鼠针刺镇痛效果很弱，提示阿片系统在针刺镇痛中的重要性。但其后的大量研究工作都以大鼠为对象，小鼠的应用极少，主要因为小鼠个体较小电针的固定比较困难，脑核团的取材也受到限制。近年来，针刺镇痛研究进入到分子水平，一些分子生物学方法的应用如基因敲除(gene knockout)和基因嵌入(gene knockin)等都需要在小鼠身上进行，因此，迫切需要建立一种针效比较确切、便于操作的小鼠电针镇痛模型。本实验目的是对不同品系小鼠的电针镇痛效果和最佳电针参数(频率、强度)进行比较研究，为阐明电针镇痛的机制打下有力基础。
1 材料与方法
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1.1 实验动物
选择健康的DBA/2、BALB/c、C57、ICR、LACA、NIH 6种近交系和远交系小鼠，体重在20～25 g，雌雄各半。其中C57、BALB/c、ICR、LACA 4种品系由我校动物部提供，NIH品系由解放军总医院动物所提供，DBA/2品系由医学科学院动物繁殖所提供。
1.2 仪器和药品
LH800型HANS电刺激仪(北京航空航天大学)，盐酸吗啡(沈阳制药厂)，盐酸纳络酮(Sigma公司)，无菌生理盐水。
1.3 测痛方法
室温保持在(20±1)℃，将小鼠置于特制塑料圆筒内，尾部和四肢暴露在筒外，待动物稳定30min后，以辐射热甩尾法测痛，采用8.75mm放映灯泡(灯泡电压为8V,可调节)，用一特制灯罩使其发出直径为2mm的光束照在距尾端部约2～3cm处的皮肤上，调节光源电压使甩尾潜伏期在3.5～5.5 s之间，两次测甩尾潜伏期的间隔为5min，共测3次，取平均值作为基础痛阈。电针后测得值与基础值比较，以变化率表示，即:(电针后的痛阈-基础痛阈)/基础痛阈×100%，痛阈超过10s者停止照射，避免损伤皮肤。
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1.4 电针
取两侧的“足三里、三阴交”2穴位，分别插入一对不锈钢针(长3mm，直径0.3mm)，电针频率为2Hz(波宽0.6ms)和100Hz(波宽0.2ms)，刺激强度按1-2-2mA递增，每一强度持续10min，在每10min末停电针测痛1次，共电针30min，取电针30min的3次测量值的平均变化率作为平均针效。停电针后，每10min测痛1次，共测3次作为电针后效应。
1.5 给药方式
盐酸吗啡溶于无菌生理盐水中，按5mg.kg-1的剂量作腹腔注射，每10g体重0.1ml。纳络酮溶于无菌生理盐水中，按0.1，1，5，10，25mg.kg-1的剂量作皮下注射，每10g体重0.1ml。
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1.6 数据处理和数理统计
所得数据均以
±
表示，组间比较用双尾ANOVA分析，继以Newman-Keuls检验作点点比较，以P<0.05作为差异显著的标准。
2 结果
2.1 小鼠电针镇痛的品系比较
取DBA/2、C57、BALB/c、ICR、LACA、NIH等6种品系雄性小鼠，每种20只，分为2组:一组为100Hz，另一组为2Hz，均给1-2-2mA电针刺激。以电针30min内痛阈升高百分数的平均值作为评价指标。结果见表1: (1) 2Hz电针：DBA/2品系优于ICR品系，BALB/c优于ICR品系，其余品系之间没有显著差异；(2) 100 Hz电针：DBA/2品系电针效果优于其它5种品系，均有显著差异，LACA品系优于BALB/c品系，其余品系之间没有显著差异。
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表1 6种小鼠品系2Hz和100Hz电针镇痛效果比较(±s,%)
Table 1 A comparison of 2 Hz and 100 Hz electroacupuncture(EA)
induced analgesia in six strains of mice(±s,%) Strain of mice
n
Frequency of EA
2HzA
100HzB
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DBA/2
10
20.6±5.9
41.7±8.3
BALB/c
10
17.4±2.8
7.2±3.5*#
NIH
9
16.1±6.1
14.4±3.8*
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C57
10
15.3±5.3
19.4±5.2*
LACA
9
9.8±3.8
21.6±5.0*
ICR
10
8.2±4.3*#
10.8±4.2*
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*P<0.05, compared with DBA/2 mice； #P<0.05, compared with BALB/c mice in A, and compared with LACA mice in B, ANOVA followed by Newman-Keuls test.
2.2 小鼠电针镇痛的性别比较
选择DBA/2、 C57、 BALB/c 3种近交系小鼠雌、雄各半，每种品系的雌、雄鼠分为2组: 100 Hz电针组，2Hz电针组。每一品系的雌、雄鼠电针实验同时进行。结果见表2: (1) 2Hz电针：3种小鼠品系的雌鼠电针镇痛效果均显著优于雄鼠；(2) 100Hz电针：BALB/c品系雌鼠的电针镇痛效果显著优于雄鼠，其余两品系的雌、雄之间没有显著差异。
表2 3种小鼠品系2Hz和100Hz电针镇痛效果的性别比较(±s,%)
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Table 2 Gender difference of 2 Hz and 100 Hz electroacupuncture
induced analgesia in three mice strains(±s,%) Frequency
of EA
Sex
n
Strain of mice
BALB/c
C57
DBA/2
, 百拇医药
2 Hz
Male
Female
10
10
7.8±3.3
17.6±3.5*
10.3±1.6
27.1±7.1*
5.0±1.8
17.5±4.0*
100 Hz
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Male
Female
10
10
2.5±2.1
10.4±3.8*
17.8±3.5
22.9±4.0
23.1±6.3
32.5±7.8
*P<0.05 represents significant difference between female and male mice.
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2.3 小鼠电针镇痛与吗啡镇痛的相关性分析
选择DBA/2和C57品系雌雄鼠各10只，分别编号，首先进行100Hz电针实验，测电针30min期间痛阈升高百分数。1周后进行吗啡镇痛实验，腹腔注射盐酸吗啡5m.g-1，然后每15min测痛1次，共测90min，计算痛阈升高百分数的均值。每种小鼠品系的雌、雄鼠电针及吗啡实验分别平行操作，数据用相关分析处理。结果见图1:无论是DBA/2或C57小鼠，雄性或雌性小鼠，100Hz电针镇痛与吗啡镇痛之间均有正相关关系(P<0.01)。把4组数值中吗啡90 min的平均镇痛效果及电针30 min平均镇痛效果作图(图2)，也可以看出两者呈正相关关系。
AUC， area under the curve； dose of morphine, 5mg.kg-1 s.c. The analgesic effect is expressed by percent increase of tail flick latency.
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图1 小鼠电针镇痛与吗啡镇痛的相关分析
Figure 1 Correlation analysis between electroacupuncture(EA)-and
morphine-induced analgesia in mice
AUC， area under the curve. dose of morphine, 5mg.kg-1s.c； the Analgesic effect is expressed by percent increase of tail flick latency.
图2 4种品系及不同性别小鼠的100 Hz电针镇痛与吗啡镇痛的关系
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Figure 2 The relationship between 100 Hz electroacupuncture induced
analgesia and morphine induced analgesia in four strains of mice
2.4 小鼠不同电针强度组合产生的镇痛效果比较
选择DBA/2，C57雌鼠各18只，每一品系小鼠首先均分为两大组：2Hz、100Hz，每一大组分3小组：0.5-1.5-2.5mA、1.0-1.5-2.0mA、1-2-2mA。每一大组中的3小组的实验按拉丁方(两次实验之间相隔4d)设计操作。结果见表3:(1)C57小鼠在2Hz、100Hz电针时，1-2-2mA组的镇痛效果显著优于0.5-1.5-2.5mA组；在100Hz电针时，1.0-1.5-2.0mA组和1-2-2mA组电针效果均显著优于0.5-1.5-2.5mA组；(2)DBA/2在100Hz电针时，1-2-2mA组镇痛效果显著优于1-1.5-2mA组；2Hz时差异无显著性。表3 小鼠不同强度电针产生的镇痛效果比较(±s,%)
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Table 3 A comparison of the analgesic effect produced
by EA of different intensity in mice(±s,%) Frequency
of EA
n
Intensity of
stimulation(mA)
Strain of mice
DBA/2 ♀
C57 ♀
, 百拇医药
2Hz
9
9
9
0.5-1.5-2.5
1-1.5-2
1-2-2
13.9±3.9
9.1±3.7
15.5±4.0
27.0±5.1
39.2±8.7
, http://www.100md.com 43.2±7.1*
100Hz
9
9
9
0.5-1.5-2.5
1-1.5-2
1-2-2
19.4±5.8
15.4±3.8
28.0±6.0
16.3±2.0
, 百拇医药
35.7±7.0*
41.4±9.4*
*P<0.05, compared between groups (ANOVA).
2.5 不同剂量的纳络酮(naloxone,Nal)对小鼠电针镇痛的影响
雌性C57小鼠84只，随机均分为2Hz和100Hz两大组，均给以1-2-2mA电针(EA)刺激。每一大组分为4小组:(1)EA+NS;(2)EA+Nal0.1mg.kg-1;(3)EA+Nal1mg.kg-1;(4)EA+Nal10mg.kg-1。4组实验平行操作。测定基础痛阈后分别皮下注射3种剂量的纳络酮，对照组注射生理盐水,15min后进行2Hz电针(1-2-2mA)30min。结果见表4:1mg.kg-1和10mg.kg-1组分别翻转2Hz电针镇痛效果的82%和85%(P<0.05)，0.1mg.kg-1组翻转了50%，未达显著水平。100Hz电针组的操作同前，注射纳络酮的剂量分别为1,5,25mg.kg-1，25mg.kg-1组翻转了100Hz电针镇痛效果的80%(P<0.05)，其余两组没有翻转作用。可以看出，阻断2Hz和100Hz电针镇痛所需纳络酮剂量相差25倍之多。
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表4 皮下注射不同剂量纳洛酮对小鼠电针镇痛的拮抗作用
Table 4 Antagonism of electroacupuncture analgesia by naloxone of different doses
2 Hz EA
100 Hz EA
NS
Naloxone (mg.kg-1, s.c.)
NS
Naloxone (mg.kg-1, s.c.)
, 百拇医药
0.1
1.0
10.0
1
5
25
Change TFL/%
n
27.5±9.7
10
13.1±7.5
10
3.7±4.7*
, 百拇医药
12
3.0±3.4*
10
14.7±3.3
10
12.0±4.5
12
12.5±4.7
10
3.4±2.3
10
*P<0.05, compared with corresponding NS group, ANOVA followed by Newman-Keuls.
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3 讨论
从原理上讲，电针镇痛无非是作用于身体某些部位(穴位)的电刺激与机体的生理系统相互作用，降低了对伤害刺激的敏感性，因此在建立模型时主要从刺激方面和机体方面来考虑。电针刺激方面要确定刺激强度、频率以及刺激部位(穴位)，机体方面主要是考虑小鼠的品系和性别，它决定了对同样的外部刺激发生反应的潜力。在镇痛机制方面，主要涉及非阿片系统(如5-羟色胺、去甲肾上腺素等经典神经递质)、内阿片系统(内啡肽，脑啡肽，强啡肽，内吗啡肽)以及相应的受体系统[2，3](包括μ、δ、κ阿片受体)的数量(Bmax)和亲和力(Kd)，以及抗阿片系统[包括胆囊收缩素(cholecystokinin, CCK)[4]，血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ， AⅡ)[5]，孤啡肽(orphanin FQ, OFQ)[6]等]。在本工作中，内阿片系统对外界刺激的反应被作为首要问题来考虑。
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不同频率的电针可以引起大鼠和人的中枢神经系统释放出不同种类的阿片肽，低频刺激主要释放脑啡肽和内啡肽，高频刺激释放强啡肽[3]，小鼠是否也符合这种规律，尚待证实。因此实验设计中分别应用2Hz和100Hz电针加以检验。
3.1 6种品系的小鼠电针镇痛效果的比较
在电刺激参数相同的条件下，DBA/2小鼠不论对2 Hz或100 Hz电针都表现出最强的镇痛效应；BALB/c小鼠对2Hz反应强(仅次于DBA/2)，对100Hz反应最弱；而ICR小鼠对2Hz和100Hz电针反应普遍低下。本实验的结果与文献[7]对DBA/Z小鼠与C57小鼠对阿片反应存在差异的报道完全吻合。但两种小鼠脑内阿片肽含量是否有差异尚待证明。至于BALB/c小鼠对2Hz和100Hz电针效果的分离，更值得加以研究，除了观察脑啡肽、内啡肽为一方和强啡肽为另一方之区别外，还应注意最近Zadina等[8]发现的内源μ激动剂“内吗啡肽”是否在BALB/c小鼠脑中特别占优势的可能性。如果得到证明，则2Hz和100Hz电针镇痛也许可作为检测脑内不同阿片系统相对优势程度的一个简便的手段。
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3.2 3种品系小鼠电针镇痛效果的性别差异
对3种电针镇痛效果较好的小鼠DBA/2，C57和BALB/c进行了雌、雄个体针效的比较，发现普遍的规律是雌性针效优于雄性。最近我室时红[9]的工作表明，100Hz电针对雌性大鼠的镇痛作用显著强于雄性，这种性别差异可能与脊髓水平强啡肽镇痛的性别差异有关。曾有文献报道雌激素可以作用于含阿片肽的神经元，以后者为靶细胞调节阿片肽的生成和释放，雌激素还有可能直接作用于阿片受体。Mogil等[10]的报告表明，性别间存在非常显著的痛觉调制机制差异。
3.3 电针强度对镇痛作用的影响
实验中选择了3种强度，都是在30min内逐渐递增式的。一种是起始点为0.5mA，按1mA的增量递增；第2种以1mA为起始点，按0.5mA递增；第3种也以1mA为起始点，以1mA递增，但到2mA即不再递增。第1方案与第2方案30min内总的刺激电流量是相等的，镇痛效果也相似。比较第2和第3种方案，以后者较佳，说明较强的刺激能产生较好的镇痛效果。但刺激强度不能无限度增加。在预实验中曾经试用3mA强度，小鼠表现强烈挣扎，出现明显的应激状态，因此不宜采用。
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3.4 吗啡镇痛与100Hz电针镇痛效果的相关性
在4种条件下，吗啡镇痛与100Hz电针镇痛均有很好的相关性。鉴于吗啡镇痛主要通过μ阿片受体介导，而100Hz电针镇痛主要通过κ受体介导(大鼠的实验结果)，两者在阿片受体方面机制不完全相同，因此不能用阿片受体丰度及亲和性来解释。在不考虑小鼠品系和性别的情况下，两者仍然出现明确的相关性。由此推测：无论是DBA/2或C57小鼠，无论是雄鼠或雌鼠，中枢CCK等抗阿片系统功能的强弱，可能是决定镇痛效果强弱的主要因素[4，11]。
3.5 不同频率电针镇痛对Nal阻断作用的敏感性
以上提到，大鼠实验中已有充分证据说明，2Hz电针和100Hz电针是分别通过μ/δ和κ阿片系统介导的，但小鼠实验中对此未曾进行过系统研究。我们在C57小鼠上用不同剂量纳络酮(0.1～25mg.kg-1，s.c.)进行实验，2Hz电针镇痛只需用0.1mg.kg-1纳络酮即可阻断50%，1mg.kg-1即可阻断80%以上，再增加纳洛酮剂量也不能进一步增强阻断效果；而100Hz电针镇痛即使用5mg.kg-1纳络酮也不能阻断，必需增加到25mg.kg-1才能阻断80%。翻转电针镇痛的纳洛酮剂量至少相差25倍。这再次提示，与大鼠一样，小鼠100Hz电针镇痛也主要是通过κ阿片系统完成的。
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本工作的结果表明，小鼠身上所得的电针镇痛规律与大鼠的结果基本一致，可以相互验证。因此在小鼠身上进行基因敲除等分子生物学实验，应能对电针镇痛机制的深入研究作出有意义的贡献。
国家攀登计划项目及国家自然科学基金(39840160)资助项目；
△ 研究生。
参考文献
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, 百拇医药
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5 Wang KW, Han JS. Accelerated synthesis and release of angiotensinⅡin the rat brain during electroacupuncture tolerance. Sci Chin(B), 1989, 33:686-693
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8 Zadina JE, Hackler L, Ge LJ, et al. Apotent and selective endogenous agonist for the mu-opiate receptor. Nature, 1997,386:499-502
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9 时 红，万 有，韩济生. 100Hz电针和脊髓鞘内注射强啡肽A引起大鼠镇痛作用的性别差异. 中国疼痛医学杂志，1999, 5(2):75-79
10 Mogil JS, Richards SP, O'Toole LA, et al. Genetic sensitivity to hot-plate nociception in DBA/2J and C57BL/6J inbred mouse strains: possible sex-specific mediation by δ2-opioid receptors. Pain, 1997, 70:267-277
11 Han JS. Cholecystokin octapeptide(CCK-8): A negative feedback control mechanism for opioid analgesia. Prog Brain Res, 1995, 105:263-271
(1999-01-11收稿), 百拇医药
单位：北京医科大学神经科学研究所，北京 100083
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990311 摘 要 目的：建立小鼠电针镇痛模型，在不同品系小鼠上观察各种电针参数引起的电针镇痛效果。方法：应用LH型HANS刺激仪，采用辐射热甩尾测痛法，比较了6种品系小鼠的电针镇痛效应。结果：(1)品系的差异：100 Hz电针时 DBA/2品系的镇痛效果显著优于其它品系，2Hz电针时DBA/2品系和BALB/c品系显著优于ICR品系；(2)性别差异：2Hz电针 DBA/2、C57、BALB/c3种品系的雌鼠优于雄鼠，100 Hz电针 仅BALB/c品系的雌鼠优于雄鼠；(3)刺激强度方面：1-2-2 mA组针效显著优于0.5-1.5-2.5 mA组或1-1.5-2mA组；(4)DBA/2和C57品系小鼠的电针镇痛与吗啡镇痛呈正相关性；(5)纳洛酮翻转：剂量为1mg.kg-1的纳络酮能翻转2 Hz电针效果；而翻转100 Hz电针效果，则需剂量为25mg.kg-1的纳络酮。结论：小鼠电针镇痛存在品系(遗传背景)和性别差异。阿片受体参与了小鼠电针镇痛，低频和高频电针镇痛分别由不同亚型的阿片受体介导。
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HUANG Cheng, WAN You, WANG Xiao-Min， HAN Ji-Sheng
(Neuroscience Research Institute, Beijing Medical University, Beijing 100083)
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ABSTRACT Objective: To establish a mouse model for electroacupuncture-induced analgesia (EAA) and to characterize optimal parameters of electroucupuncture (EA) and the effect of EAA in different strains of mice. Methods: Radiant heat tail flick latency was used for nociceptive test. Han's acupoint nerve stimulator (HANS, LH series) was used for EA and 6 strains of mice were screened for the effect of EAA. Results: (1) Strain difference: DBA/2 mice showed significantly better analgesic effect than other 5 strains in 100 Hz EAA, whereas in 2 Hz EAA, only DBA/2 and BALB/c mice showed significantly stronger analgesia compared with ICR mice. (2) Sex difference: Female mice showed better EAA than male. A statistically significant gender difference was seen in 3 strains of mice (DBA/2, C57, BALB/c) under 2Hz EAA, but only in one strain (BALB/c) under 100 Hz EAA. (3) Stimulation intensity: An increasing intensity of 1-2-2 mA in 10 min steps seemed optimal for both 2 Hz and 100 Hz EAA. (4) A positive correlation was observed between morphine analgesia and 100 Hz EA analgesia in DBA/2 and C57 mice. (5) EAA could be significantly reversed by the opioid antagonist naloxone at doses of 1mg.kg-1 for 2 Hz EAA and 25mg.kg-1 (but not 1 and 5 mg.kg-1) for 100 Hz EAA. Conclusion: (1) Comparison of the effect of EAA in 6 strains of mice revealed a significant strain and gender difference. (2) Naloxone blockade strategy revealed that different types of opioid receptors are involved in the mediation of low and high frequency EAA in mice.
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(J Beijing Med Univ, 1999,31:230-234)
针刺镇痛的机制研究需要动物模型作为基础，迄今为止已有大鼠、家兔、狗、猴等很多模型。在小鼠身上很早就有人进行了观察[1]，发现缺乏阿片受体的CXBK小鼠针刺镇痛效果很弱，提示阿片系统在针刺镇痛中的重要性。但其后的大量研究工作都以大鼠为对象，小鼠的应用极少，主要因为小鼠个体较小电针的固定比较困难，脑核团的取材也受到限制。近年来，针刺镇痛研究进入到分子水平，一些分子生物学方法的应用如基因敲除(gene knockout)和基因嵌入(gene knockin)等都需要在小鼠身上进行，因此，迫切需要建立一种针效比较确切、便于操作的小鼠电针镇痛模型。本实验目的是对不同品系小鼠的电针镇痛效果和最佳电针参数(频率、强度)进行比较研究，为阐明电针镇痛的机制打下有力基础。
1 材料与方法
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1.1 实验动物
选择健康的DBA/2、BALB/c、C57、ICR、LACA、NIH 6种近交系和远交系小鼠，体重在20～25 g，雌雄各半。其中C57、BALB/c、ICR、LACA 4种品系由我校动物部提供，NIH品系由解放军总医院动物所提供，DBA/2品系由医学科学院动物繁殖所提供。
1.2 仪器和药品
LH800型HANS电刺激仪(北京航空航天大学)，盐酸吗啡(沈阳制药厂)，盐酸纳络酮(Sigma公司)，无菌生理盐水。
1.3 测痛方法
室温保持在(20±1)℃，将小鼠置于特制塑料圆筒内，尾部和四肢暴露在筒外，待动物稳定30min后，以辐射热甩尾法测痛，采用8.75mm放映灯泡(灯泡电压为8V,可调节)，用一特制灯罩使其发出直径为2mm的光束照在距尾端部约2～3cm处的皮肤上，调节光源电压使甩尾潜伏期在3.5～5.5 s之间，两次测甩尾潜伏期的间隔为5min，共测3次，取平均值作为基础痛阈。电针后测得值与基础值比较，以变化率表示，即:(电针后的痛阈-基础痛阈)/基础痛阈×100%，痛阈超过10s者停止照射，避免损伤皮肤。
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1.4 电针
取两侧的“足三里、三阴交”2穴位，分别插入一对不锈钢针(长3mm，直径0.3mm)，电针频率为2Hz(波宽0.6ms)和100Hz(波宽0.2ms)，刺激强度按1-2-2mA递增，每一强度持续10min，在每10min末停电针测痛1次，共电针30min，取电针30min的3次测量值的平均变化率作为平均针效。停电针后，每10min测痛1次，共测3次作为电针后效应。
1.5 给药方式
盐酸吗啡溶于无菌生理盐水中，按5mg.kg-1的剂量作腹腔注射，每10g体重0.1ml。纳络酮溶于无菌生理盐水中，按0.1，1，5，10，25mg.kg-1的剂量作皮下注射，每10g体重0.1ml。
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1.6 数据处理和数理统计
所得数据均以
±表示，组间比较用双尾ANOVA分析，继以Newman-Keuls检验作点点比较，以P<0.05作为差异显著的标准。2 结果
2.1 小鼠电针镇痛的品系比较
取DBA/2、C57、BALB/c、ICR、LACA、NIH等6种品系雄性小鼠，每种20只，分为2组:一组为100Hz，另一组为2Hz，均给1-2-2mA电针刺激。以电针30min内痛阈升高百分数的平均值作为评价指标。结果见表1: (1) 2Hz电针：DBA/2品系优于ICR品系，BALB/c优于ICR品系，其余品系之间没有显著差异；(2) 100 Hz电针：DBA/2品系电针效果优于其它5种品系，均有显著差异，LACA品系优于BALB/c品系，其余品系之间没有显著差异。
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表1 6种小鼠品系2Hz和100Hz电针镇痛效果比较(
±s,%)Table 1 A comparison of 2 Hz and 100 Hz electroacupuncture(EA)
induced analgesia in six strains of mice(
±s,%) Strain of micen
Frequency of EA
2HzA
100HzB
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DBA/2
10
20.6±5.9
41.7±8.3
BALB/c
10
17.4±2.8
7.2±3.5*#
NIH
9
16.1±6.1
14.4±3.8*
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C57
10
15.3±5.3
19.4±5.2*
LACA
9
9.8±3.8
21.6±5.0*
ICR
10
8.2±4.3*#
10.8±4.2*
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*P<0.05, compared with DBA/2 mice； #P<0.05, compared with BALB/c mice in A, and compared with LACA mice in B, ANOVA followed by Newman-Keuls test.
2.2 小鼠电针镇痛的性别比较
选择DBA/2、 C57、 BALB/c 3种近交系小鼠雌、雄各半，每种品系的雌、雄鼠分为2组: 100 Hz电针组，2Hz电针组。每一品系的雌、雄鼠电针实验同时进行。结果见表2: (1) 2Hz电针：3种小鼠品系的雌鼠电针镇痛效果均显著优于雄鼠；(2) 100Hz电针：BALB/c品系雌鼠的电针镇痛效果显著优于雄鼠，其余两品系的雌、雄之间没有显著差异。
表2 3种小鼠品系2Hz和100Hz电针镇痛效果的性别比较(
±s,%), 百拇医药
Table 2 Gender difference of 2 Hz and 100 Hz electroacupuncture
induced analgesia in three mice strains(
±s,%) Frequencyof EA
Sex
n
Strain of mice
BALB/c
C57
DBA/2
, 百拇医药
2 Hz
Male
Female
10
10
7.8±3.3
17.6±3.5*
10.3±1.6
27.1±7.1*
5.0±1.8
17.5±4.0*
100 Hz
, 百拇医药
Male
Female
10
10
2.5±2.1
10.4±3.8*
17.8±3.5
22.9±4.0
23.1±6.3
32.5±7.8
*P<0.05 represents significant difference between female and male mice.
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2.3 小鼠电针镇痛与吗啡镇痛的相关性分析
选择DBA/2和C57品系雌雄鼠各10只，分别编号，首先进行100Hz电针实验，测电针30min期间痛阈升高百分数。1周后进行吗啡镇痛实验，腹腔注射盐酸吗啡5m.g-1，然后每15min测痛1次，共测90min，计算痛阈升高百分数的均值。每种小鼠品系的雌、雄鼠电针及吗啡实验分别平行操作，数据用相关分析处理。结果见图1:无论是DBA/2或C57小鼠，雄性或雌性小鼠，100Hz电针镇痛与吗啡镇痛之间均有正相关关系(P<0.01)。把4组数值中吗啡90 min的平均镇痛效果及电针30 min平均镇痛效果作图(图2)，也可以看出两者呈正相关关系。
AUC， area under the curve； dose of morphine, 5mg.kg-1 s.c. The analgesic effect is expressed by percent increase of tail flick latency.
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图1 小鼠电针镇痛与吗啡镇痛的相关分析
Figure 1 Correlation analysis between electroacupuncture(EA)-and
morphine-induced analgesia in mice
AUC， area under the curve. dose of morphine, 5mg.kg-1s.c； the Analgesic effect is expressed by percent increase of tail flick latency.
图2 4种品系及不同性别小鼠的100 Hz电针镇痛与吗啡镇痛的关系
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Figure 2 The relationship between 100 Hz electroacupuncture induced
analgesia and morphine induced analgesia in four strains of mice
2.4 小鼠不同电针强度组合产生的镇痛效果比较
选择DBA/2，C57雌鼠各18只，每一品系小鼠首先均分为两大组：2Hz、100Hz，每一大组分3小组：0.5-1.5-2.5mA、1.0-1.5-2.0mA、1-2-2mA。每一大组中的3小组的实验按拉丁方(两次实验之间相隔4d)设计操作。结果见表3:(1)C57小鼠在2Hz、100Hz电针时，1-2-2mA组的镇痛效果显著优于0.5-1.5-2.5mA组；在100Hz电针时，1.0-1.5-2.0mA组和1-2-2mA组电针效果均显著优于0.5-1.5-2.5mA组；(2)DBA/2在100Hz电针时，1-2-2mA组镇痛效果显著优于1-1.5-2mA组；2Hz时差异无显著性。表3 小鼠不同强度电针产生的镇痛效果比较(
±s,%), http://www.100md.com
Table 3 A comparison of the analgesic effect produced
by EA of different intensity in mice(
±s,%) Frequencyof EA
n
Intensity of
stimulation(mA)
Strain of mice
DBA/2 ♀
C57 ♀
, 百拇医药
2Hz
9
9
9
0.5-1.5-2.5
1-1.5-2
1-2-2
13.9±3.9
9.1±3.7
15.5±4.0
27.0±5.1
39.2±8.7
, http://www.100md.com 43.2±7.1*
100Hz
9
9
9
0.5-1.5-2.5
1-1.5-2
1-2-2
19.4±5.8
15.4±3.8
28.0±6.0
16.3±2.0
, 百拇医药
35.7±7.0*
41.4±9.4*
*P<0.05, compared between groups (ANOVA).
2.5 不同剂量的纳络酮(naloxone,Nal)对小鼠电针镇痛的影响
雌性C57小鼠84只，随机均分为2Hz和100Hz两大组，均给以1-2-2mA电针(EA)刺激。每一大组分为4小组:(1)EA+NS;(2)EA+Nal0.1mg.kg-1;(3)EA+Nal1mg.kg-1;(4)EA+Nal10mg.kg-1。4组实验平行操作。测定基础痛阈后分别皮下注射3种剂量的纳络酮，对照组注射生理盐水,15min后进行2Hz电针(1-2-2mA)30min。结果见表4:1mg.kg-1和10mg.kg-1组分别翻转2Hz电针镇痛效果的82%和85%(P<0.05)，0.1mg.kg-1组翻转了50%，未达显著水平。100Hz电针组的操作同前，注射纳络酮的剂量分别为1,5,25mg.kg-1，25mg.kg-1组翻转了100Hz电针镇痛效果的80%(P<0.05)，其余两组没有翻转作用。可以看出，阻断2Hz和100Hz电针镇痛所需纳络酮剂量相差25倍之多。
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表4 皮下注射不同剂量纳洛酮对小鼠电针镇痛的拮抗作用
Table 4 Antagonism of electroacupuncture analgesia by naloxone of different doses
2 Hz EA
100 Hz EA
NS
Naloxone (mg.kg-1, s.c.)
NS
Naloxone (mg.kg-1, s.c.)
, 百拇医药
0.1
1.0
10.0
1
5
25
Change TFL/%
n
27.5±9.7
10
13.1±7.5
10
3.7±4.7*
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12
3.0±3.4*
10
14.7±3.3
10
12.0±4.5
12
12.5±4.7
10
3.4±2.3
10
*P<0.05, compared with corresponding NS group, ANOVA followed by Newman-Keuls.
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3 讨论
从原理上讲，电针镇痛无非是作用于身体某些部位(穴位)的电刺激与机体的生理系统相互作用，降低了对伤害刺激的敏感性，因此在建立模型时主要从刺激方面和机体方面来考虑。电针刺激方面要确定刺激强度、频率以及刺激部位(穴位)，机体方面主要是考虑小鼠的品系和性别，它决定了对同样的外部刺激发生反应的潜力。在镇痛机制方面，主要涉及非阿片系统(如5-羟色胺、去甲肾上腺素等经典神经递质)、内阿片系统(内啡肽，脑啡肽，强啡肽，内吗啡肽)以及相应的受体系统[2，3](包括μ、δ、κ阿片受体)的数量(Bmax)和亲和力(Kd)，以及抗阿片系统[包括胆囊收缩素(cholecystokinin, CCK)[4]，血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ， AⅡ)[5]，孤啡肽(orphanin FQ, OFQ)[6]等]。在本工作中，内阿片系统对外界刺激的反应被作为首要问题来考虑。
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不同频率的电针可以引起大鼠和人的中枢神经系统释放出不同种类的阿片肽，低频刺激主要释放脑啡肽和内啡肽，高频刺激释放强啡肽[3]，小鼠是否也符合这种规律，尚待证实。因此实验设计中分别应用2Hz和100Hz电针加以检验。
3.1 6种品系的小鼠电针镇痛效果的比较
在电刺激参数相同的条件下，DBA/2小鼠不论对2 Hz或100 Hz电针都表现出最强的镇痛效应；BALB/c小鼠对2Hz反应强(仅次于DBA/2)，对100Hz反应最弱；而ICR小鼠对2Hz和100Hz电针反应普遍低下。本实验的结果与文献[7]对DBA/Z小鼠与C57小鼠对阿片反应存在差异的报道完全吻合。但两种小鼠脑内阿片肽含量是否有差异尚待证明。至于BALB/c小鼠对2Hz和100Hz电针效果的分离，更值得加以研究，除了观察脑啡肽、内啡肽为一方和强啡肽为另一方之区别外，还应注意最近Zadina等[8]发现的内源μ激动剂“内吗啡肽”是否在BALB/c小鼠脑中特别占优势的可能性。如果得到证明，则2Hz和100Hz电针镇痛也许可作为检测脑内不同阿片系统相对优势程度的一个简便的手段。
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3.2 3种品系小鼠电针镇痛效果的性别差异
对3种电针镇痛效果较好的小鼠DBA/2，C57和BALB/c进行了雌、雄个体针效的比较，发现普遍的规律是雌性针效优于雄性。最近我室时红[9]的工作表明，100Hz电针对雌性大鼠的镇痛作用显著强于雄性，这种性别差异可能与脊髓水平强啡肽镇痛的性别差异有关。曾有文献报道雌激素可以作用于含阿片肽的神经元，以后者为靶细胞调节阿片肽的生成和释放，雌激素还有可能直接作用于阿片受体。Mogil等[10]的报告表明，性别间存在非常显著的痛觉调制机制差异。
3.3 电针强度对镇痛作用的影响
实验中选择了3种强度，都是在30min内逐渐递增式的。一种是起始点为0.5mA，按1mA的增量递增；第2种以1mA为起始点，按0.5mA递增；第3种也以1mA为起始点，以1mA递增，但到2mA即不再递增。第1方案与第2方案30min内总的刺激电流量是相等的，镇痛效果也相似。比较第2和第3种方案，以后者较佳，说明较强的刺激能产生较好的镇痛效果。但刺激强度不能无限度增加。在预实验中曾经试用3mA强度，小鼠表现强烈挣扎，出现明显的应激状态，因此不宜采用。
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3.4 吗啡镇痛与100Hz电针镇痛效果的相关性
在4种条件下，吗啡镇痛与100Hz电针镇痛均有很好的相关性。鉴于吗啡镇痛主要通过μ阿片受体介导，而100Hz电针镇痛主要通过κ受体介导(大鼠的实验结果)，两者在阿片受体方面机制不完全相同，因此不能用阿片受体丰度及亲和性来解释。在不考虑小鼠品系和性别的情况下，两者仍然出现明确的相关性。由此推测：无论是DBA/2或C57小鼠，无论是雄鼠或雌鼠，中枢CCK等抗阿片系统功能的强弱，可能是决定镇痛效果强弱的主要因素[4，11]。
3.5 不同频率电针镇痛对Nal阻断作用的敏感性
以上提到，大鼠实验中已有充分证据说明，2Hz电针和100Hz电针是分别通过μ/δ和κ阿片系统介导的，但小鼠实验中对此未曾进行过系统研究。我们在C57小鼠上用不同剂量纳络酮(0.1～25mg.kg-1，s.c.)进行实验，2Hz电针镇痛只需用0.1mg.kg-1纳络酮即可阻断50%，1mg.kg-1即可阻断80%以上，再增加纳洛酮剂量也不能进一步增强阻断效果；而100Hz电针镇痛即使用5mg.kg-1纳络酮也不能阻断，必需增加到25mg.kg-1才能阻断80%。翻转电针镇痛的纳洛酮剂量至少相差25倍。这再次提示，与大鼠一样，小鼠100Hz电针镇痛也主要是通过κ阿片系统完成的。
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本工作的结果表明，小鼠身上所得的电针镇痛规律与大鼠的结果基本一致，可以相互验证。因此在小鼠身上进行基因敲除等分子生物学实验，应能对电针镇痛机制的深入研究作出有意义的贡献。
国家攀登计划项目及国家自然科学基金(39840160)资助项目；
△ 研究生。
参考文献
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(1999-01-11收稿), 百拇医药