c-Jun氨基末端激酶活性测定*
作者：蔡琪 李晓玫 王海燕
单位：北京医科大学第一医院肾内科，北京 100034
关键词：
990329 丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase， MAPKs)是细胞内重要的信号转导酶类，它们被细胞外刺激因子激活后，可通过使不同的转录因子磷酸化，调节特定基因的表达，转导细胞增殖、肥大或细胞分化的信号。研究表明，MAPKs家族至少有3个亚类，分别为细胞外信息调节激酶(extracellular signal-regulated kinases， ERK1/ERK2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase， JNK)和p38激酶，其中JNK又称应激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase， SAPK)，已知它可被炎症介质(TNF-α、IL-1)、应激刺激(热休克、高渗)、紫外线、缺血/再灌注等激活。激活的JNK可使转录因子c-Jun氨基末端转录激活，促进依赖于c-Jun的基因转录，从而参与应激或病理刺激引起的细胞凋亡或细胞再生过程[1，2]。在研究应激或病理条件下细胞的增殖、分化与凋亡时常需要测定JNK的活性，因此，我们应用GST-c-Jun融合蛋白分离纯化JNK特异底物，建立了用特异底物进行磷酸化反应的JNK活性测定方法，为探讨炎症、肿瘤等增殖性疾病发病中的信号转导机制提供研究手段。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 主要试剂与材料
IPTG及溶菌酶来源于华美生物工程公司；Pepstatin 、Leupeptin 、Aprotinin 、PMSF 、GSH-agarose 均购自Sigma公司；含GST-c-Jun(1-79)重组表达质粒的菌种由美国科罗拉多大学医学中心Raphael A .Nemenoff教授惠赠。Wistar大鼠由北京医科大学实验动物中心提供。
1.2 液体配制
NETN缓冲液(mmol.L-1)：Tris-HCl 20(pH 7.6)， NaCl100， EDTA1，DTT2， 0.5%(体积分数)NP-40。
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JNK裂解缓冲液(mmol.L-1)：Hepes25(pH 7.7)，NaCl 300， EDTA 0.2，MgCl2 1.5，0.1%(体积分数)Triton-X100，DTT 0.5，β-磷酸甘油 20(pH 7.6)，Na3VO4 0.1，2mg.L-1 Leupeptin，4mg.L-1 Aprotinin。
JNK结合缓冲液(mmol.L-1)：Hepes 20(pH 7.7)，NaCl 50，MgCl2 2.5，EDTA 0.1， 0.05% (体积分数)Triton-X100，β-磷酸甘油 20(pH 7.6)，Na3VO4 0.1。
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JNK反应液(mmol.L-1)：β-磷酸甘油50(pH 7.6)，Na3VO4 0.2，MgCl2 10，ATP 0.02；29.6×104Bq γ-32P-ATP。
1.3 JNK特异性底物c-Jun的制备
将含GST-c-Jun重组表达质粒的菌种接种于5ml LB培养基中(含氨苄青霉素100mg.L-1)，37℃水浴中振荡孵育过夜，次日按1%(体积分数)将过夜培养物转种于500 LB培养基中(含氨苄青霉素100mg.L-1)，继续37 ℃水浴中振荡，孵育至600nm光密度值为0.4～0.5，加入IPTG(终浓度0.8mmol.L-1)，再振荡孵育3h，然后以5000r.min-1离心培养物10min收集沉淀。将沉淀悬于10ml NETN缓冲液中，同时加溶菌酶及蛋白酶抑制剂，冰上放置1h后超声粉碎细菌，10 000r.min-1离心10min收集上清。上清加50%(体积分数)GSH-agarose1ml，4℃冷室内振摇1h，用NETN缓冲液洗GST-c-Jun-GSH-agarose共3次，最后以10%(体积分数)将其悬于5 ml JNK裂解缓冲液中，4 ℃贮存备用。
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1.4 JNK粗提液的制备
组织JNK粗提液的制备：取新鲜或-80 ℃贮存的组织标本100mg加液氮少许，乳钵中研成粉末，再加JNK裂解缓冲液1ml,冰上匀浆1min，超声粉碎2次，每次5s，以12000r.min-1离心10 min，收集上清为组织JNK粗提液。
培养细胞JNK粗提液的制备：体外培养的细胞转种于60mm平皿中，正常条件下培养至单层细胞长满皿底，用无血清或低浓度血清培养过夜(18～24h)，加刺激物后37℃CO2孵箱中继续培养适当时间，中止刺激后PBS洗3次，每皿加JNK裂解缓冲液0.3ml，冰上放置30min后，12000r.min-1离心10min，收集上清为细胞JNK粗提液。
用Bradford法测定上述JNK粗提液的蛋白浓度。
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1.5 JNK活性测定
用JNK裂解缓冲液稀释JNK粗提液，使蛋白质量浓度为1g.L-1，取200μl稀释液加10%(体积分数)GST-c-Jun-GSH-agarose100μl于4℃冷室内振摇2h，然后用JNK结合缓冲液洗此agarose 4次，最后吸尽JNK结合缓冲液，加40μl JNK反应液，在30℃水浴中振荡反应20min。反应结束后加10μl Laemmli's buffer中止反应，将样品煮沸3min，12000r.min-1离心2min，取上清上样行10%(质量分数)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，用考马斯亮蓝染色5min，脱色液脱色至特异条带出现，然后在干胶器上干胶，胶片于-70 ℃放射自显影24h，并将胶上所见特异条带剪下进行放射性计数。
1.6 JNK活性计算
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本实验中JNK活性以单位时间内单位质量的蛋白质能够催化掺入到特异性底物c-Jun中ATP的pmol数表示。
即：JNK活性＝(样品放射性计数-本底放射性计数)×0 .4 /[放射性总计数×蛋白质用量(g)×反应时间(min)]
其中，放射性总计数为10 μl反应液1 000(体积比)倍稀释后取20μl进行放射性计数所得每分钟计数值。
2 结果
JNK特异底物GST-cJun的纯化鉴定：GST-c-Jun(1-79)为一融合蛋白，其相对分子质量约为34×103。本实验所用GST-c-Jun重组表达质粒，其表达产物大部分为可溶性，因此，细菌裂解后将主要存于上清中，故可直接用GSH-agarose分离纯化。我们将IPTG诱导前菌、IPTG诱导后菌及其超声粉碎后菌、GSH-agarose分离纯化产物行10%(质量分数)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，可见34×103的新蛋白即目的蛋白GST-c-Jun 被IPTG诱导，同时可直接被GSH-agarose分离纯化(图1)。
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图1 JNK特异底物GST-c-Jun 的纯化电泳分析
Figure 1 Electrophoresis assay of purified JNK
specific substrate GST-c-Jun
缺血再灌注肾损伤时肾组织JNK活性的变化：应用上述JNK活性测定方法，我们初步检测了雄性Wistar大鼠缺血再灌注肾损伤时肾组织JNK活性的变化。如图2所示，肾缺血45min，再灌注5 min时，JNK可被明显激活，再灌注20 min达高峰，JNK激活可持续到再灌注2h，随再灌注时间延长JNK活性逐渐恢复正常。
A,control(sham); B,isch.45 min; C,isch./reper.5 min;
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D,isch./reper. 20 min; E,isch./reper. 1 h; F,isch./reper.
2 h; G,isch./reper. 6 h.
图2 缺血再灌注肾损伤时肾组织JNK活性的变化
Figure 2 Activation of JNK in ischemiac
and ischemic/reperfusion rat kidney
3 讨论
JNK在细胞中含量较低、激活时间短暂，加之其特异性底物为c-Jun，故测定其活性较为困难。随着基因工程产物c-Jun的问世，使JNK活性的测定成为可能。 在本实验中，JNK底物c-Jun的制备是JNK活性测定的关键环节。根据国外文献[3～6]，我们反复摸索，最终获得了稳定、纯化的JNK底物。我们体会在制备过程中应注意几个环节：(1)LB培养基的pH值应准确调节为7，若pH值过低，目的蛋白的表达量很少；(2)加IPTG诱导时，菌液600nm光密度值不能过低也不能过高，若过低，目的蛋白的表达量少，若过高，目的蛋白的表达受抑制；(3)超声粉碎细菌时应在冰上进行，而且超声所用功率不能过高，时间不能过长，否则超声产热导致GST构象改变，影响其与GSH的结合，进而影响c-Jun的纯化及JNK活性的测定。
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目前，JNK活性测定的方法主要有免疫复合物激酶活性测定、胶内激酶活性测定和免疫杂交等[1，2]，但是这3种方法均需特异JNK抗体而价格昂贵，而且其操作复杂费时，故限制了这些方法在国内研究中的应用。我们参考国外文献所建立的JNK特异底物磷酸化测定法，不但具有上述3种方法所共有的特异性强、灵敏度高的特点，而且经济、省时、实用。
JNK为丝/苏氨酸激酶，可特异性地与底物c-Jun结合。本实验利用JNK这一特性，首先通过连于agarose上的c-Jun与JNK特异性结合，将JNK从JNK粗提液中分离出来；其次，以γ-32P-ATP作为磷酸化反应中磷酸基的供体，通过JNK磷酸化反应，将32P掺入到c-Jun分子中，反应产物行10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，最终通过特异性条带的同位素计数，计算出JNK的活性。由于本实验同免疫复合物激酶活性测定、胶内激酶活性测定相同，采用的是特异性底物磷酸化法，均以同位素32P为标记物，因此用于JNK活性测定时，兼有上述二法特异性强、灵敏度高的特点。此外，本实验直接用c-Jun-GST-agarose从JNK粗提液中分离JNK，可省却用免疫复合物激酶活性测定时通过免疫沉淀分离JNK所需购买JNK抗体的昂贵费用，同时也避免了胶内激酶活性测定过程中蛋白复性耗时长、特异性底物用量多的缺点。
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* 高等学校博士学科点专项科研基金及国家自然科学基金(39770346)资助课题。
参考文献
1 Pombo CM, Bonventre JV, Avruch J, et al. The stress-activated protein kinases are major c-Jun amino-terminal kinase activated by ischemia and reperfusion. J Biol Chem, 1994,269:26546-26551
2 Yin T, Sandhu G, Wolfgang CD, et al. Tissue-specific pattern of stress kinase activation in ischemia/reperfusied heart and kidney. J Biol Chem, 1997,272:19943-19950
, 百拇医药
3 Hibi M, Lin A, Smeal T, et al. Identification of an oncoprotein-and UV-responsive protein kinase that binds and potentiates the c-Jun activation domain. Genes Dev, 1993,7:2135-2148
4 Bogoyevitch MA, Ketterman AJ, Sugden PH. Cellular stresses differentially activate c-Jun N-terminal protein kinases and extracellular signal-regulated protein kinase in cultured ventricular myocytes. J Biol Chem, 1995,270:29710-29717
5 Smith DB, Johnson KS. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia Coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene, 1988,67:31-40
6 Simons PC, Vander JDL. Purification of glutathione S-transferases from human liver by glutathione-affinity chromatography. Anal Biochem, 1977,82:334-341
(1998-07-01收稿), 百拇医药
单位：北京医科大学第一医院肾内科，北京 100034
关键词：
990329 丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase， MAPKs)是细胞内重要的信号转导酶类，它们被细胞外刺激因子激活后，可通过使不同的转录因子磷酸化，调节特定基因的表达，转导细胞增殖、肥大或细胞分化的信号。研究表明，MAPKs家族至少有3个亚类，分别为细胞外信息调节激酶(extracellular signal-regulated kinases， ERK1/ERK2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase， JNK)和p38激酶，其中JNK又称应激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase， SAPK)，已知它可被炎症介质(TNF-α、IL-1)、应激刺激(热休克、高渗)、紫外线、缺血/再灌注等激活。激活的JNK可使转录因子c-Jun氨基末端转录激活，促进依赖于c-Jun的基因转录，从而参与应激或病理刺激引起的细胞凋亡或细胞再生过程[1，2]。在研究应激或病理条件下细胞的增殖、分化与凋亡时常需要测定JNK的活性，因此，我们应用GST-c-Jun融合蛋白分离纯化JNK特异底物，建立了用特异底物进行磷酸化反应的JNK活性测定方法，为探讨炎症、肿瘤等增殖性疾病发病中的信号转导机制提供研究手段。
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1 材料与方法
1.1 主要试剂与材料
IPTG及溶菌酶来源于华美生物工程公司；Pepstatin 、Leupeptin 、Aprotinin 、PMSF 、GSH-agarose 均购自Sigma公司；含GST-c-Jun(1-79)重组表达质粒的菌种由美国科罗拉多大学医学中心Raphael A .Nemenoff教授惠赠。Wistar大鼠由北京医科大学实验动物中心提供。
1.2 液体配制
NETN缓冲液(mmol.L-1)：Tris-HCl 20(pH 7.6)， NaCl100， EDTA1，DTT2， 0.5%(体积分数)NP-40。
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JNK裂解缓冲液(mmol.L-1)：Hepes25(pH 7.7)，NaCl 300， EDTA 0.2，MgCl2 1.5，0.1%(体积分数)Triton-X100，DTT 0.5，β-磷酸甘油 20(pH 7.6)，Na3VO4 0.1，2mg.L-1 Leupeptin，4mg.L-1 Aprotinin。
JNK结合缓冲液(mmol.L-1)：Hepes 20(pH 7.7)，NaCl 50，MgCl2 2.5，EDTA 0.1， 0.05% (体积分数)Triton-X100，β-磷酸甘油 20(pH 7.6)，Na3VO4 0.1。
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JNK反应液(mmol.L-1)：β-磷酸甘油50(pH 7.6)，Na3VO4 0.2，MgCl2 10，ATP 0.02；29.6×104Bq γ-32P-ATP。
1.3 JNK特异性底物c-Jun的制备
将含GST-c-Jun重组表达质粒的菌种接种于5ml LB培养基中(含氨苄青霉素100mg.L-1)，37℃水浴中振荡孵育过夜，次日按1%(体积分数)将过夜培养物转种于500 LB培养基中(含氨苄青霉素100mg.L-1)，继续37 ℃水浴中振荡，孵育至600nm光密度值为0.4～0.5，加入IPTG(终浓度0.8mmol.L-1)，再振荡孵育3h，然后以5000r.min-1离心培养物10min收集沉淀。将沉淀悬于10ml NETN缓冲液中，同时加溶菌酶及蛋白酶抑制剂，冰上放置1h后超声粉碎细菌，10 000r.min-1离心10min收集上清。上清加50%(体积分数)GSH-agarose1ml，4℃冷室内振摇1h，用NETN缓冲液洗GST-c-Jun-GSH-agarose共3次，最后以10%(体积分数)将其悬于5 ml JNK裂解缓冲液中，4 ℃贮存备用。
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1.4 JNK粗提液的制备
组织JNK粗提液的制备：取新鲜或-80 ℃贮存的组织标本100mg加液氮少许，乳钵中研成粉末，再加JNK裂解缓冲液1ml,冰上匀浆1min，超声粉碎2次，每次5s，以12000r.min-1离心10 min，收集上清为组织JNK粗提液。
培养细胞JNK粗提液的制备：体外培养的细胞转种于60mm平皿中，正常条件下培养至单层细胞长满皿底，用无血清或低浓度血清培养过夜(18～24h)，加刺激物后37℃CO2孵箱中继续培养适当时间，中止刺激后PBS洗3次，每皿加JNK裂解缓冲液0.3ml，冰上放置30min后，12000r.min-1离心10min，收集上清为细胞JNK粗提液。
用Bradford法测定上述JNK粗提液的蛋白浓度。
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1.5 JNK活性测定
用JNK裂解缓冲液稀释JNK粗提液，使蛋白质量浓度为1g.L-1，取200μl稀释液加10%(体积分数)GST-c-Jun-GSH-agarose100μl于4℃冷室内振摇2h，然后用JNK结合缓冲液洗此agarose 4次，最后吸尽JNK结合缓冲液，加40μl JNK反应液，在30℃水浴中振荡反应20min。反应结束后加10μl Laemmli's buffer中止反应，将样品煮沸3min，12000r.min-1离心2min，取上清上样行10%(质量分数)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，用考马斯亮蓝染色5min，脱色液脱色至特异条带出现，然后在干胶器上干胶，胶片于-70 ℃放射自显影24h，并将胶上所见特异条带剪下进行放射性计数。
1.6 JNK活性计算
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本实验中JNK活性以单位时间内单位质量的蛋白质能够催化掺入到特异性底物c-Jun中ATP的pmol数表示。
即：JNK活性＝(样品放射性计数-本底放射性计数)×0 .4 /[放射性总计数×蛋白质用量(g)×反应时间(min)]
其中，放射性总计数为10 μl反应液1 000(体积比)倍稀释后取20μl进行放射性计数所得每分钟计数值。
2 结果
JNK特异底物GST-cJun的纯化鉴定：GST-c-Jun(1-79)为一融合蛋白，其相对分子质量约为34×103。本实验所用GST-c-Jun重组表达质粒，其表达产物大部分为可溶性，因此，细菌裂解后将主要存于上清中，故可直接用GSH-agarose分离纯化。我们将IPTG诱导前菌、IPTG诱导后菌及其超声粉碎后菌、GSH-agarose分离纯化产物行10%(质量分数)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，可见34×103的新蛋白即目的蛋白GST-c-Jun 被IPTG诱导，同时可直接被GSH-agarose分离纯化(图1)。
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图1 JNK特异底物GST-c-Jun 的纯化电泳分析
Figure 1 Electrophoresis assay of purified JNK
specific substrate GST-c-Jun
缺血再灌注肾损伤时肾组织JNK活性的变化：应用上述JNK活性测定方法，我们初步检测了雄性Wistar大鼠缺血再灌注肾损伤时肾组织JNK活性的变化。如图2所示，肾缺血45min，再灌注5 min时，JNK可被明显激活，再灌注20 min达高峰，JNK激活可持续到再灌注2h，随再灌注时间延长JNK活性逐渐恢复正常。
A,control(sham); B,isch.45 min; C,isch./reper.5 min;
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D,isch./reper. 20 min; E,isch./reper. 1 h; F,isch./reper.
2 h; G,isch./reper. 6 h.
图2 缺血再灌注肾损伤时肾组织JNK活性的变化
Figure 2 Activation of JNK in ischemiac
and ischemic/reperfusion rat kidney
3 讨论
JNK在细胞中含量较低、激活时间短暂，加之其特异性底物为c-Jun，故测定其活性较为困难。随着基因工程产物c-Jun的问世，使JNK活性的测定成为可能。 在本实验中，JNK底物c-Jun的制备是JNK活性测定的关键环节。根据国外文献[3～6]，我们反复摸索，最终获得了稳定、纯化的JNK底物。我们体会在制备过程中应注意几个环节：(1)LB培养基的pH值应准确调节为7，若pH值过低，目的蛋白的表达量很少；(2)加IPTG诱导时，菌液600nm光密度值不能过低也不能过高，若过低，目的蛋白的表达量少，若过高，目的蛋白的表达受抑制；(3)超声粉碎细菌时应在冰上进行，而且超声所用功率不能过高，时间不能过长，否则超声产热导致GST构象改变，影响其与GSH的结合，进而影响c-Jun的纯化及JNK活性的测定。
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目前，JNK活性测定的方法主要有免疫复合物激酶活性测定、胶内激酶活性测定和免疫杂交等[1，2]，但是这3种方法均需特异JNK抗体而价格昂贵，而且其操作复杂费时，故限制了这些方法在国内研究中的应用。我们参考国外文献所建立的JNK特异底物磷酸化测定法，不但具有上述3种方法所共有的特异性强、灵敏度高的特点，而且经济、省时、实用。
JNK为丝/苏氨酸激酶，可特异性地与底物c-Jun结合。本实验利用JNK这一特性，首先通过连于agarose上的c-Jun与JNK特异性结合，将JNK从JNK粗提液中分离出来；其次，以γ-32P-ATP作为磷酸化反应中磷酸基的供体，通过JNK磷酸化反应，将32P掺入到c-Jun分子中，反应产物行10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，最终通过特异性条带的同位素计数，计算出JNK的活性。由于本实验同免疫复合物激酶活性测定、胶内激酶活性测定相同，采用的是特异性底物磷酸化法，均以同位素32P为标记物，因此用于JNK活性测定时，兼有上述二法特异性强、灵敏度高的特点。此外，本实验直接用c-Jun-GST-agarose从JNK粗提液中分离JNK，可省却用免疫复合物激酶活性测定时通过免疫沉淀分离JNK所需购买JNK抗体的昂贵费用，同时也避免了胶内激酶活性测定过程中蛋白复性耗时长、特异性底物用量多的缺点。
, http://www.100md.com
* 高等学校博士学科点专项科研基金及国家自然科学基金(39770346)资助课题。
参考文献
1 Pombo CM, Bonventre JV, Avruch J, et al. The stress-activated protein kinases are major c-Jun amino-terminal kinase activated by ischemia and reperfusion. J Biol Chem, 1994,269:26546-26551
2 Yin T, Sandhu G, Wolfgang CD, et al. Tissue-specific pattern of stress kinase activation in ischemia/reperfusied heart and kidney. J Biol Chem, 1997,272:19943-19950
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3 Hibi M, Lin A, Smeal T, et al. Identification of an oncoprotein-and UV-responsive protein kinase that binds and potentiates the c-Jun activation domain. Genes Dev, 1993,7:2135-2148
4 Bogoyevitch MA, Ketterman AJ, Sugden PH. Cellular stresses differentially activate c-Jun N-terminal protein kinases and extracellular signal-regulated protein kinase in cultured ventricular myocytes. J Biol Chem, 1995,270:29710-29717
5 Smith DB, Johnson KS. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia Coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene, 1988,67:31-40
6 Simons PC, Vander JDL. Purification of glutathione S-transferases from human liver by glutathione-affinity chromatography. Anal Biochem, 1977,82:334-341
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