低氧性肺动脉高压大鼠肺血管结构及血浆一氧化氮的变化
作者：齐建光 杜军保 贾建峰 赵 斌 张前进 李万镇
单位：齐建光 杜军保 贾建峰 李万镇 北京医科大学第一医院儿科；张前进 中医科，北京 100034；赵 斌 北京积水潭医院内科
关键词：一氧化氮；血液；肺动脉；超微结构；低氧；高血压；肺性
北京医科大学学报990412 摘 要 目的：探讨一氧化氮(NO)在低氧性肺动脉高压形成中的作用。方法：参与实验全过程的Wistar大鼠共12只(6个对子)。以右心导管法测定肺动脉压力，以分光光度法间接测定血浆NO含量，并对大鼠肺组织标本进行显微结构观测和超微结构观察。结果：低氧组大鼠肺动脉平均压明显高于对照组[(2.75±0.30) kPa vs (2.06±0.14) kPa，P<0.05]，其血浆NO间接含量明显低于对照组[(3.5±1.2) μmol.L-1 vs (4.8±0.4) μmol.L-1，P<0.05]。光镜下，低氧组大鼠肺小血管肌化程度明显增强，肺中、小肌型动脉相对中膜厚度(RMT)和相对中膜面积(RMA)明显增加[肺中等肌型动脉RMT:(9.94±0.30)% vs (7.70±0.41)%;肺中等肌型动脉RMA:(18.87±0.54)% vs (14.76±0.75)%; 肺小肌型动脉RMT:(15.15±0.21)% vs (10.12±0.60)%;肺小肌型动脉RMA:[(27.99±0.88)% vs (19.23±1.05)%, P均<0.01]。电镜下，肺中、小肌型动脉内皮细胞增生、肥厚、肿胀，平滑肌细胞增生、肥厚，并由收缩表型向合成表型转化。结论：低氧后NO水平的降低可能参与了低氧性肺血管结构重建及低氧性肺动脉高压的形成。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R563-332
The changes in pulmonary vascular structure and plasma level of
nitric oxide in hypoxic pulmonary hypertensive rats
QI Jian-Guang#, DU Jun-Bao, JIA Jian-Feng, ZHAO Bin, ZHANG Qian-Jin, LI Wan-Zhen
(#Department of Pediatrics, the First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034)
ABSTRACT Objective: To explore the possible role of nitric oxide (NO) in the development of hypoxic pulmonary hypertension. Methods: A total of 12 Wistar rats (6 pairs ) were involved in the whole process of the experiment. Pulmonary artery pressure of each rat was evaluated by using a right cardiac catheterization procedure. Plasma concentration of NO was measured indirecthy via spectrophotometry. Changes in pulmonary vascular structure were measured and the ultrastructural changes in intrapulmonary muscularized arteries were observed. Results: Pulmonary artery mean pressure was significantly increased in rats exposed to two-week hypoxia [(2.75±0.30) kPa vs (2.06±0.14) kPa，P<0.05]. Meanwhile, indirect plasma NO concentration was markedly decreased in comparison with controls[(3.5±1.2) μmol.L-1 vs (4.8±0.4) μmol.L-1，P<0.05]. Relative medial thickness (RMT) and relative medial area (RMA) of pulmonary arteries and the percentage of muscularized arteries of small pulmonary vessels were obviously increased in hypoxic rats as compared with those of normal controls [RMT of median pulmonary arteries: (9.94±0.30)% vs (7.70±0.41)%; RMA of median pulmonary arteries: (18.87±0.54)% vs (14.76±0.75)%; RMT of small pulmonary arteries: (15.15±0.21)% vs (10.12±0.60)%; RMA of small pulmonary arteries: (27.99±0.88)% vs (19.23±1.05)%, P<0.01, respectively]. Ultrastructural changes, such as hyperplasia, hypertrophy and swelling of endothelial cells and hyperplasia, hypertrophy and the increased number of synthetic phenotype of smooth muscle cells, were found in intrapulmonary muscularized arteries of hypoxic rats. Conclusion: The down-regulation of NO due to hypoxia is probably involved in the development of hypoxic pulmonary vascular structural remodeling and even hypoxic pulmonary hypertension.
, 百拇医药
MeSH Nitric oxide/blood Pulmonary artery/ultrastruct Anoxia Hypertension, pulmonary
低氧性肺动脉高压是临床众多心、肺疾病发生、发展过程中重要的病理生理环节，其形成机制尚不完全清楚[1]。低氧性肺血管结构重建是慢性低氧性肺动脉高压的重要病理基础，近年来受到越来越多的重视，其主要特征是肺动脉平滑肌细胞增生、肥厚，中膜增厚，外周小血管机化，以及细胞外基质的增多[2]。一氧化氮(nitric oxide, NO)是近年来发现的一种新型细胞信使分子，具有抑制平滑肌细胞增殖的作用[3，4]。但NO在低氧性肺血管重建形成中的作用尚未完全阐明[5，6]，因此我们通过对慢性低氧性肺动脉高压大鼠进行显微和超微结构分析，结合血浆NO的间接含量测定，探讨NO在低氧性肺血管结构重建中的作用，进一步认识低氧性肺动脉高压形成的机制。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 动物分组及低氧方法
雄性Wistar大鼠(北京医科大学实验动物中心提供)共14只，体重210～300 g，将窝别相同、体重接近的每2只大鼠配成1个对子，共7个对子，并将每个对子的动物随机分配到低氧组和对照组。将低氧组大鼠置于常压低氧舱(中国医学科学院基础医学研究所)内，控制舱内氧浓度在(10.0±0.5)%(体积分数)。舱内放置钠石灰吸收CO2，以无水CaCl2吸收水蒸气。每天连续低氧6 h，共低氧两周。对照组大鼠除吸入空气外，其他饲养条件与低氧大鼠相同。低氧组大鼠于低氧过程中有一只死亡，故将此对子剔除。因此共有6个对子完成整个实验。
1.2 大鼠肺动脉压力的测定
大鼠饲养两周后，腹腔注射100 g.L-1乌拉坦麻醉，固定于手术台上，采用右心导管法测定大鼠肺动脉压力。将聚乙烯导管从右颈外静脉插入右心室及肺动脉，导管的另一端经P50压力传感器与RM-6000型多导生理仪相连，描记肺动脉压力曲线，测定肺动脉平均压(pulmonary artery mean pressure, PAMP)。
, 百拇医药
1.3 血浆NO间接含量测定
大鼠处死前，自颈总动脉取血2 ml，离心后吸取血浆0.1 ml，加9.3 mmol.L-1硫酸锌0.6 ml及双氧水0.4 ml，加入1 mol.L-1氢氧化钠0.1 ml后冰上孵育1 h。离心后取上清液0.6 ml加入双氧水及3 g.L-1磺胺，与6 mmol.L-1聚乙烯二胺盐酸盐反应1 h，以545 nm比色(LIV-365型紫外分光光度仪，日本)，读光密度值，按标准曲线计算NO间接含量。
1.4 肺组织标本的取材和制备
测定肺动脉压力后，打开胸腔，取大鼠一侧肺叶于液氮冷冻后，-70 ℃保存。从冰冻肺组织标本外周部位切取数个1 mm×1 mm×1 mm组织块，经戊二醛和四氧化锇双固定，系列丙酮脱水，Epon812包埋。半薄切片后定位，选取外径在15～150 μm之间的肺肌型动脉行超薄切片，醋酸双氧铀-枸橼酸铅双染色，100CX-Ⅱ透射电子显微镜(日本)观察。另一侧肺叶以3.3 mol.L-1甲醛缓冲液固定，梯度酒精顺序脱水，二甲苯透明后石蜡包埋，切片(厚5 μm)，Weigert弹力纤维染色，Van Gieson复染。
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1.5 三型肺小血管百分比的测定
在40倍光镜下，观察并计数整个切片肺小血管(15 μm<外径≤50 μm)中肌型动脉、部分肌型动脉及非肌型血管的数目，分别计算它们各占肺小血管总数的百分比。肌型动脉在光镜下具有完整的内、外两层弹力层；部分肌型动脉在光镜下具有完整的外弹力层，但内弹力层不完整；非肌型血管在光镜下仅有一层弹力层。
1.6 肺中、小肌型动脉相对中膜厚度及面积的测定
应用Q550 LW图像处理与分析系统(德国)对整个切片中内弹力层清晰、形状较规则的肺中、小肌型动脉进行分析。运用Leica Qwin软件测量每个血管的如下指标：经过血管轴心的外弹力层之间的最长外径和最短外径，内弹力层长度，内弹力层包围的面积和外弹力层包围的面积。根据Barth等[7]的方法计算不同切面角度及处于不同舒缩状态的血管之相对中膜厚度( relative medial thickness, RMT)及相对中膜面积(relative medial area, RMA)。每只大鼠测量5～10个肺中、小肌型动脉，分别测算肺中等肌型动脉(50 μm<外径≤150 μm)和肺小肌型动脉(15 μm<外径≤50 μm)RMT及RMA，并求其均值。
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1.7 统计学处理
采用配对t检验对完成整个实验过程的6个对子大鼠的实验数据之组间差异进行显著性检验。
2 结果
2.1 肺动脉压力
低氧组大鼠的PAMP显著高于对照组，差异有显著意义(t=2.82, P<0.05，表1)。
表1 两组大鼠PAMP、血浆NO间接含量
和肺动脉显微结构的变化
Table 1 The changes in PAMP, indirect plasma NO concentration
and pulmonary vascular micromorphometric indices of rats
, 百拇医药
Groups
Hypoxic
(
±s)
Control
(±s)
Difference△
(±s)
p(PAMP)/kPa
, 百拇医药
2.75±0.30
2.06±0.14
0.70±0.25
c(NO)/μmol.L-1
3.5±1.2
4.8±0.4
-1.2±0.4
RMT/%
Median MA
9.94±0.30＃
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2.25±0.50
Small MA
15.15±0.21＃
10.12±0.60
5.04±0.69
RMA/%
Median MA
18.87±0.54＃
14.76±0.75
4.10±0.91
, http://www.100md.com
Small MA
27.99±0.88＃
19.23±1.05
8.81±1.23
Small pulmonary
vessels/%
MA
16.04±0.74＃
9.33±0.53
6.71±0.62
PMA
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10.32±0.35＃
7.07±0.25
3.25±0.53
NMV
73.64±0.73＃
83.59±0.56
-9.95±0.83
p(PAMP), pulmonary artery mean pressure; c(NO), concentration of nitric oxide; MA, muscularized artery; PMA, partially muscularized artery; NMV, nonmuscularized vessel. *P<0.05, #P<0.01, compared with control group; △values of hypoxic group minus those in control group.
, 百拇医药
2.2 血浆NO的间接含量
低氧组大鼠的血浆NO间接含量明显低于对照组(t=3.14, P<0.05,表1)。
2.3 三型肺小血管百分比
低氧组大鼠肺小血管中肌型动脉百分比明显高于对照组(t=10.79, P<0.01)，部分肌型动脉百分比明显高于对照组(t=6.07, P<0.01)，而非肌型血管百分比明显低于对照组(t=12.00, P<0.01, 表1)。
2.4 肺中、小肌型动脉相对中膜厚度及面积
低氧组大鼠肺中等肌型动脉RMT及RMA明显高于对照组(t=4.48, t=4.50, P均<0.01)，肺小肌型动脉RMT及RMA也明显高于对照组(t=7.32, t=7.23, P均<0.01, 表1)。
, 百拇医药
2.5 肺中、小肌型动脉内皮细胞超微结构
对照组大鼠肺中、小肌型动脉(6/6)内皮细胞胞体扁平，内衬血管内壁，结构正常(图1)。低氧组大鼠多数肺中、小肌型动脉(4/6)内皮细胞数目增多，胞浆内粗面内质网、游离核糖体和线粒体等细胞器增多。内皮细胞呈立方型，部分突入管腔，可见呈“阅兵式”样排列的内皮细胞。肺动脉(6/6)内皮细胞肿胀，胞浆内可见大量空泡，线粒体肿胀，内质网扩张(图2)。
Endothelial cell is flat. Smooth muscle cell shows a contractile phenotype and the cytoplasm is full of myofilaments and dense bodies.
图1 对照组大鼠肺肌型动脉 电镜×10 000
, 百拇医药
Figure 1 Electron micrograph of pulmonary muscular artery
of a rat in control group ×10 000
Endothelial cell appears swollen and a lot of bubbles are seen in its cytoplasm. Smooth muscle cell shows a synthetic phenotype and the cytoplasm is filled with rough endoplasmic reticulum, free ribosomes and mitochondria.
图2 低氧组大鼠肺肌型动脉 电镜×20 000
, 百拇医药
Figure 2 Electron micrograph of pulmonary muscular
artery of a hypoxic rat ×20 000
2.6 肺中、小肌型动脉平滑肌细胞超微结构
对照组大鼠肺中、小肌型动脉(6/6)平滑肌细胞1～2层，细胞胞体小，呈收缩表型，胞浆被大量肌丝占据，并见许多密斑，少数平滑肌细胞于近核处有少量粗面内质网、游离核糖体，胞浆内有散在的线粒体(图1)。低氧组大鼠肺中、小肌型动脉平滑肌细胞可达3～4层，细胞胞体肥大，多数肺中、小肌型动脉(5/6)壁内部分平滑肌细胞不同程度向合成表型转化，胞浆中肌丝和密斑减少，粗面内质网和游离核糖体等细胞器增多(图2)。
3 讨论
本研究发现，常压低氧两周大鼠肺动脉压力明显增高，同时肺血管结构也发生了明显的改变：光镜下，肺小血管中肌型动脉百分比明显升高；肺中、小肌型动脉RMT和RMA明显增加。电镜下，低氧组肺中、小肌型动脉内皮细胞增生、肥厚、肿胀；中膜平滑肌细胞增生、肥大，并不同程度地向合成表型转化，即胞浆中与合成和分泌功能有关的粗面内质网、游离核糖体等细胞器增多，而与收缩功能有关的肌丝、密斑减少。表明慢性低氧性肺动脉高压的大鼠肺血管结构发生了重建，此结果与以往的研究结论一致[8]。
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低氧性肺血管结构重建对慢性低氧性肺动脉高压的形成有重要意义[8]。慢性低氧时，肺动脉中膜增厚和非肌型血管的肌化，使血管内腔变窄，血流阻力增加，减弱了肺血管对血容量和阻力改变的缓冲作用，成为慢性低氧性肺动脉高压发生的主要形态学改变。已知只有经过向合成表型转化的平滑肌细胞才能对丝裂原反应而增殖，故低氧时肺动脉平滑肌细胞向合成表型转化成为平滑肌细胞增生、肥大、中膜肥厚的基础。而且合成表型的平滑肌细胞合成分泌的细胞外基质，尤其是胶原增多，使肺血管弹性回缩力和顺应性降低，血流阻力增加，有助于肺动脉保持高压状态。此外，肿胀、增殖、肥厚的内皮细胞使原来缩小的管腔变得更为狭窄和阻塞，促进了低氧性肺动脉高压的形成。
低氧性肺动脉高压的形成机制至今尚未完全清楚。目前已明确，NO是一种内皮源性舒张因子，它在肺动脉内皮细胞由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸(L-Arg)产生后，迅速进入平滑肌细胞，通过增加环磷酸鸟苷(cGMP)的生成，调节平滑肌细胞舒张并对平滑肌细胞增殖起着可能的调节作用[3，4]。NO在低氧性肺血管结构重建时的变化及其对低氧性肺动脉高压的作用目前尚无一致性结论[5，6]。我们以往的研究表明，低氧性肺动脉高压大鼠肺动脉NOS基因表达下调，而NO又具有抑制平滑肌细胞增殖的作用[9]。由此间接提示，低氧后NO体系被抑制可能导致低氧性肺血管重建，从而参与低氧性肺动脉高压的形成。但是目前尚缺乏有关低氧性肺动脉高压时肺血管结构改变(显微结构及超微结构改变)与NO水平之间关系的研究，因此，在一定程度上限制了人们对NO在低氧性肺动脉高压形成机制中作用的认识。鉴于以上情况，我们在以往的研究工作基础上，率先将低氧性肺动脉高压大鼠肺血管结构改变与血浆NO间接含量同步研究。结果表明，低氧大鼠肺动脉高压大鼠肺血管结构发生重建，同时血浆NO水平下降。提示低氧后肺血管内皮细胞功能不良，NO合成释放减少，可能参与肺血管结构重建，从而促进低氧性肺动脉高压的形成。
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(本研究得到中国医学科学院基础医学研究所孙仁宇研究员、本校基础医学院病理学系张波教授的指导，及军事医学科学院朱婕老师的帮助，特此致谢。)
国家自然科学基金(39470735)及卫生部优秀青年科技人才专项基金资助课题。
参考文献
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3 Ignarro LJ. Biological actions and properties of endothelium-derived nitric oxide formed and released from artery and vein. Circ Res, 1989,65：1-21
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4 Garg UC, Hassid A. Nitric oxide-generating vasodilators and 8-bromo-cyclic guanosine monophosphate inhibit mitogenesis and proferation of cultured rat vascular smooth muscle cells. J Clin Invest, 1989,83:1774-1777
5 Xue C, Johns RA. Upregulation of nitric oxide synthase correlates temporally with onset of pulmonary vascular remodeling in the hypoxic rat. Hypertension, 1996,28:743-753
6 齐建光，杜军保.内源性一氧化氮调节大鼠低氧性肺血管结构重建. 中华儿科杂志，1999，37 (2)：104-106
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7 Barth PJ, Kimpel C, Roy S, et al. An improved mathematical approach for the assessment of the medial thickness of pulmonary arteries. Path Res Pract, 1993, 189:567-576
8 蔡英年.肺动脉高压形成的血管机制.见:韩启德,文允镒主编. 血管生物学. 北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社, 1997. 260～278
9 杜军保，赵 斌，黎 文，等.一氧化氮合酶mRNA在缺氧性肺动脉高压大鼠肺动脉的表达. 中华儿科杂志，1998，36：19-21
(1998-06-29收稿), 百拇医药
单位：齐建光 杜军保 贾建峰 李万镇 北京医科大学第一医院儿科；张前进 中医科，北京 100034；赵 斌 北京积水潭医院内科
关键词：一氧化氮；血液；肺动脉；超微结构；低氧；高血压；肺性
北京医科大学学报990412 摘 要 目的：探讨一氧化氮(NO)在低氧性肺动脉高压形成中的作用。方法：参与实验全过程的Wistar大鼠共12只(6个对子)。以右心导管法测定肺动脉压力，以分光光度法间接测定血浆NO含量，并对大鼠肺组织标本进行显微结构观测和超微结构观察。结果：低氧组大鼠肺动脉平均压明显高于对照组[(2.75±0.30) kPa vs (2.06±0.14) kPa，P<0.05]，其血浆NO间接含量明显低于对照组[(3.5±1.2) μmol.L-1 vs (4.8±0.4) μmol.L-1，P<0.05]。光镜下，低氧组大鼠肺小血管肌化程度明显增强，肺中、小肌型动脉相对中膜厚度(RMT)和相对中膜面积(RMA)明显增加[肺中等肌型动脉RMT:(9.94±0.30)% vs (7.70±0.41)%;肺中等肌型动脉RMA:(18.87±0.54)% vs (14.76±0.75)%; 肺小肌型动脉RMT:(15.15±0.21)% vs (10.12±0.60)%;肺小肌型动脉RMA:[(27.99±0.88)% vs (19.23±1.05)%, P均<0.01]。电镜下，肺中、小肌型动脉内皮细胞增生、肥厚、肿胀，平滑肌细胞增生、肥厚，并由收缩表型向合成表型转化。结论：低氧后NO水平的降低可能参与了低氧性肺血管结构重建及低氧性肺动脉高压的形成。
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中国图书资料分类法分类号 R563-332
The changes in pulmonary vascular structure and plasma level of
nitric oxide in hypoxic pulmonary hypertensive rats
QI Jian-Guang#, DU Jun-Bao, JIA Jian-Feng, ZHAO Bin, ZHANG Qian-Jin, LI Wan-Zhen
(#Department of Pediatrics, the First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034)
ABSTRACT Objective: To explore the possible role of nitric oxide (NO) in the development of hypoxic pulmonary hypertension. Methods: A total of 12 Wistar rats (6 pairs ) were involved in the whole process of the experiment. Pulmonary artery pressure of each rat was evaluated by using a right cardiac catheterization procedure. Plasma concentration of NO was measured indirecthy via spectrophotometry. Changes in pulmonary vascular structure were measured and the ultrastructural changes in intrapulmonary muscularized arteries were observed. Results: Pulmonary artery mean pressure was significantly increased in rats exposed to two-week hypoxia [(2.75±0.30) kPa vs (2.06±0.14) kPa，P<0.05]. Meanwhile, indirect plasma NO concentration was markedly decreased in comparison with controls[(3.5±1.2) μmol.L-1 vs (4.8±0.4) μmol.L-1，P<0.05]. Relative medial thickness (RMT) and relative medial area (RMA) of pulmonary arteries and the percentage of muscularized arteries of small pulmonary vessels were obviously increased in hypoxic rats as compared with those of normal controls [RMT of median pulmonary arteries: (9.94±0.30)% vs (7.70±0.41)%; RMA of median pulmonary arteries: (18.87±0.54)% vs (14.76±0.75)%; RMT of small pulmonary arteries: (15.15±0.21)% vs (10.12±0.60)%; RMA of small pulmonary arteries: (27.99±0.88)% vs (19.23±1.05)%, P<0.01, respectively]. Ultrastructural changes, such as hyperplasia, hypertrophy and swelling of endothelial cells and hyperplasia, hypertrophy and the increased number of synthetic phenotype of smooth muscle cells, were found in intrapulmonary muscularized arteries of hypoxic rats. Conclusion: The down-regulation of NO due to hypoxia is probably involved in the development of hypoxic pulmonary vascular structural remodeling and even hypoxic pulmonary hypertension.
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MeSH Nitric oxide/blood Pulmonary artery/ultrastruct Anoxia Hypertension, pulmonary
低氧性肺动脉高压是临床众多心、肺疾病发生、发展过程中重要的病理生理环节，其形成机制尚不完全清楚[1]。低氧性肺血管结构重建是慢性低氧性肺动脉高压的重要病理基础，近年来受到越来越多的重视，其主要特征是肺动脉平滑肌细胞增生、肥厚，中膜增厚，外周小血管机化，以及细胞外基质的增多[2]。一氧化氮(nitric oxide, NO)是近年来发现的一种新型细胞信使分子，具有抑制平滑肌细胞增殖的作用[3，4]。但NO在低氧性肺血管重建形成中的作用尚未完全阐明[5，6]，因此我们通过对慢性低氧性肺动脉高压大鼠进行显微和超微结构分析，结合血浆NO的间接含量测定，探讨NO在低氧性肺血管结构重建中的作用，进一步认识低氧性肺动脉高压形成的机制。
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1 材料与方法
1.1 动物分组及低氧方法
雄性Wistar大鼠(北京医科大学实验动物中心提供)共14只，体重210～300 g，将窝别相同、体重接近的每2只大鼠配成1个对子，共7个对子，并将每个对子的动物随机分配到低氧组和对照组。将低氧组大鼠置于常压低氧舱(中国医学科学院基础医学研究所)内，控制舱内氧浓度在(10.0±0.5)%(体积分数)。舱内放置钠石灰吸收CO2，以无水CaCl2吸收水蒸气。每天连续低氧6 h，共低氧两周。对照组大鼠除吸入空气外，其他饲养条件与低氧大鼠相同。低氧组大鼠于低氧过程中有一只死亡，故将此对子剔除。因此共有6个对子完成整个实验。
1.2 大鼠肺动脉压力的测定
大鼠饲养两周后，腹腔注射100 g.L-1乌拉坦麻醉，固定于手术台上，采用右心导管法测定大鼠肺动脉压力。将聚乙烯导管从右颈外静脉插入右心室及肺动脉，导管的另一端经P50压力传感器与RM-6000型多导生理仪相连，描记肺动脉压力曲线，测定肺动脉平均压(pulmonary artery mean pressure, PAMP)。
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1.3 血浆NO间接含量测定
大鼠处死前，自颈总动脉取血2 ml，离心后吸取血浆0.1 ml，加9.3 mmol.L-1硫酸锌0.6 ml及双氧水0.4 ml，加入1 mol.L-1氢氧化钠0.1 ml后冰上孵育1 h。离心后取上清液0.6 ml加入双氧水及3 g.L-1磺胺，与6 mmol.L-1聚乙烯二胺盐酸盐反应1 h，以545 nm比色(LIV-365型紫外分光光度仪，日本)，读光密度值，按标准曲线计算NO间接含量。
1.4 肺组织标本的取材和制备
测定肺动脉压力后，打开胸腔，取大鼠一侧肺叶于液氮冷冻后，-70 ℃保存。从冰冻肺组织标本外周部位切取数个1 mm×1 mm×1 mm组织块，经戊二醛和四氧化锇双固定，系列丙酮脱水，Epon812包埋。半薄切片后定位，选取外径在15～150 μm之间的肺肌型动脉行超薄切片，醋酸双氧铀-枸橼酸铅双染色，100CX-Ⅱ透射电子显微镜(日本)观察。另一侧肺叶以3.3 mol.L-1甲醛缓冲液固定，梯度酒精顺序脱水，二甲苯透明后石蜡包埋，切片(厚5 μm)，Weigert弹力纤维染色，Van Gieson复染。
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1.5 三型肺小血管百分比的测定
在40倍光镜下，观察并计数整个切片肺小血管(15 μm<外径≤50 μm)中肌型动脉、部分肌型动脉及非肌型血管的数目，分别计算它们各占肺小血管总数的百分比。肌型动脉在光镜下具有完整的内、外两层弹力层；部分肌型动脉在光镜下具有完整的外弹力层，但内弹力层不完整；非肌型血管在光镜下仅有一层弹力层。
1.6 肺中、小肌型动脉相对中膜厚度及面积的测定
应用Q550 LW图像处理与分析系统(德国)对整个切片中内弹力层清晰、形状较规则的肺中、小肌型动脉进行分析。运用Leica Qwin软件测量每个血管的如下指标：经过血管轴心的外弹力层之间的最长外径和最短外径，内弹力层长度，内弹力层包围的面积和外弹力层包围的面积。根据Barth等[7]的方法计算不同切面角度及处于不同舒缩状态的血管之相对中膜厚度( relative medial thickness, RMT)及相对中膜面积(relative medial area, RMA)。每只大鼠测量5～10个肺中、小肌型动脉，分别测算肺中等肌型动脉(50 μm<外径≤150 μm)和肺小肌型动脉(15 μm<外径≤50 μm)RMT及RMA，并求其均值。
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1.7 统计学处理
采用配对t检验对完成整个实验过程的6个对子大鼠的实验数据之组间差异进行显著性检验。
2 结果
2.1 肺动脉压力
低氧组大鼠的PAMP显著高于对照组，差异有显著意义(t=2.82, P<0.05，表1)。
表1 两组大鼠PAMP、血浆NO间接含量
和肺动脉显微结构的变化
Table 1 The changes in PAMP, indirect plasma NO concentration
and pulmonary vascular micromorphometric indices of rats
, 百拇医药
Groups
Hypoxic
(
±s)Control
(
±s)Difference△
(
±s)p(PAMP)/kPa
, 百拇医药
2.75±0.30
2.06±0.14
0.70±0.25
c(NO)/μmol.L-1
3.5±1.2
4.8±0.4
-1.2±0.4
RMT/%
Median MA
9.94±0.30＃
, http://www.100md.com 7.70±0.41
2.25±0.50
Small MA
15.15±0.21＃
10.12±0.60
5.04±0.69
RMA/%
Median MA
18.87±0.54＃
14.76±0.75
4.10±0.91
, http://www.100md.com
Small MA
27.99±0.88＃
19.23±1.05
8.81±1.23
Small pulmonary
vessels/%
MA
16.04±0.74＃
9.33±0.53
6.71±0.62
PMA
, http://www.100md.com
10.32±0.35＃
7.07±0.25
3.25±0.53
NMV
73.64±0.73＃
83.59±0.56
-9.95±0.83
p(PAMP), pulmonary artery mean pressure; c(NO), concentration of nitric oxide; MA, muscularized artery; PMA, partially muscularized artery; NMV, nonmuscularized vessel. *P<0.05, #P<0.01, compared with control group; △values of hypoxic group minus those in control group.
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2.2 血浆NO的间接含量
低氧组大鼠的血浆NO间接含量明显低于对照组(t=3.14, P<0.05,表1)。
2.3 三型肺小血管百分比
低氧组大鼠肺小血管中肌型动脉百分比明显高于对照组(t=10.79, P<0.01)，部分肌型动脉百分比明显高于对照组(t=6.07, P<0.01)，而非肌型血管百分比明显低于对照组(t=12.00, P<0.01, 表1)。
2.4 肺中、小肌型动脉相对中膜厚度及面积
低氧组大鼠肺中等肌型动脉RMT及RMA明显高于对照组(t=4.48, t=4.50, P均<0.01)，肺小肌型动脉RMT及RMA也明显高于对照组(t=7.32, t=7.23, P均<0.01, 表1)。
, 百拇医药
2.5 肺中、小肌型动脉内皮细胞超微结构
对照组大鼠肺中、小肌型动脉(6/6)内皮细胞胞体扁平，内衬血管内壁，结构正常(图1)。低氧组大鼠多数肺中、小肌型动脉(4/6)内皮细胞数目增多，胞浆内粗面内质网、游离核糖体和线粒体等细胞器增多。内皮细胞呈立方型，部分突入管腔，可见呈“阅兵式”样排列的内皮细胞。肺动脉(6/6)内皮细胞肿胀，胞浆内可见大量空泡，线粒体肿胀，内质网扩张(图2)。
Endothelial cell is flat. Smooth muscle cell shows a contractile phenotype and the cytoplasm is full of myofilaments and dense bodies.
图1 对照组大鼠肺肌型动脉 电镜×10 000
, 百拇医药
Figure 1 Electron micrograph of pulmonary muscular artery
of a rat in control group ×10 000
Endothelial cell appears swollen and a lot of bubbles are seen in its cytoplasm. Smooth muscle cell shows a synthetic phenotype and the cytoplasm is filled with rough endoplasmic reticulum, free ribosomes and mitochondria.
图2 低氧组大鼠肺肌型动脉 电镜×20 000
, 百拇医药
Figure 2 Electron micrograph of pulmonary muscular
artery of a hypoxic rat ×20 000
2.6 肺中、小肌型动脉平滑肌细胞超微结构
对照组大鼠肺中、小肌型动脉(6/6)平滑肌细胞1～2层，细胞胞体小，呈收缩表型，胞浆被大量肌丝占据，并见许多密斑，少数平滑肌细胞于近核处有少量粗面内质网、游离核糖体，胞浆内有散在的线粒体(图1)。低氧组大鼠肺中、小肌型动脉平滑肌细胞可达3～4层，细胞胞体肥大，多数肺中、小肌型动脉(5/6)壁内部分平滑肌细胞不同程度向合成表型转化，胞浆中肌丝和密斑减少，粗面内质网和游离核糖体等细胞器增多(图2)。
3 讨论
本研究发现，常压低氧两周大鼠肺动脉压力明显增高，同时肺血管结构也发生了明显的改变：光镜下，肺小血管中肌型动脉百分比明显升高；肺中、小肌型动脉RMT和RMA明显增加。电镜下，低氧组肺中、小肌型动脉内皮细胞增生、肥厚、肿胀；中膜平滑肌细胞增生、肥大，并不同程度地向合成表型转化，即胞浆中与合成和分泌功能有关的粗面内质网、游离核糖体等细胞器增多，而与收缩功能有关的肌丝、密斑减少。表明慢性低氧性肺动脉高压的大鼠肺血管结构发生了重建，此结果与以往的研究结论一致[8]。
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低氧性肺血管结构重建对慢性低氧性肺动脉高压的形成有重要意义[8]。慢性低氧时，肺动脉中膜增厚和非肌型血管的肌化，使血管内腔变窄，血流阻力增加，减弱了肺血管对血容量和阻力改变的缓冲作用，成为慢性低氧性肺动脉高压发生的主要形态学改变。已知只有经过向合成表型转化的平滑肌细胞才能对丝裂原反应而增殖，故低氧时肺动脉平滑肌细胞向合成表型转化成为平滑肌细胞增生、肥大、中膜肥厚的基础。而且合成表型的平滑肌细胞合成分泌的细胞外基质，尤其是胶原增多，使肺血管弹性回缩力和顺应性降低，血流阻力增加，有助于肺动脉保持高压状态。此外，肿胀、增殖、肥厚的内皮细胞使原来缩小的管腔变得更为狭窄和阻塞，促进了低氧性肺动脉高压的形成。
低氧性肺动脉高压的形成机制至今尚未完全清楚。目前已明确，NO是一种内皮源性舒张因子，它在肺动脉内皮细胞由一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸(L-Arg)产生后，迅速进入平滑肌细胞，通过增加环磷酸鸟苷(cGMP)的生成，调节平滑肌细胞舒张并对平滑肌细胞增殖起着可能的调节作用[3，4]。NO在低氧性肺血管结构重建时的变化及其对低氧性肺动脉高压的作用目前尚无一致性结论[5，6]。我们以往的研究表明，低氧性肺动脉高压大鼠肺动脉NOS基因表达下调，而NO又具有抑制平滑肌细胞增殖的作用[9]。由此间接提示，低氧后NO体系被抑制可能导致低氧性肺血管重建，从而参与低氧性肺动脉高压的形成。但是目前尚缺乏有关低氧性肺动脉高压时肺血管结构改变(显微结构及超微结构改变)与NO水平之间关系的研究，因此，在一定程度上限制了人们对NO在低氧性肺动脉高压形成机制中作用的认识。鉴于以上情况，我们在以往的研究工作基础上，率先将低氧性肺动脉高压大鼠肺血管结构改变与血浆NO间接含量同步研究。结果表明，低氧大鼠肺动脉高压大鼠肺血管结构发生重建，同时血浆NO水平下降。提示低氧后肺血管内皮细胞功能不良，NO合成释放减少，可能参与肺血管结构重建，从而促进低氧性肺动脉高压的形成。
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(本研究得到中国医学科学院基础医学研究所孙仁宇研究员、本校基础医学院病理学系张波教授的指导，及军事医学科学院朱婕老师的帮助，特此致谢。)
国家自然科学基金(39470735)及卫生部优秀青年科技人才专项基金资助课题。
参考文献
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9 杜军保，赵 斌，黎 文，等.一氧化氮合酶mRNA在缺氧性肺动脉高压大鼠肺动脉的表达. 中华儿科杂志，1998，36：19-21
(1998-06-29收稿), 百拇医药