激光心肌血管重建术后血管内皮细胞生长因子与碱性成纤维细胞生长因子的变化
作者：郭静萱 黄璇 张萍 葛霁
单位：北京医科大学第三医院心内科，北京 100083 葛霁 中国科学院电子研究所
关键词：血管成形术；激光；内皮生长因子；成纤维细胞生长因子；碱性；代谢
北京医科大学学报990615 摘 要 目的：观察激光心肌血管重建术(transmyocardial laser revascularization, TMR)后新生血管的变化及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor ，VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor ，bFGF)在缺血心肌的表达。方法：制作大鼠急性心肌缺血模型，以单纯缺血为对照组，实验组行激光打孔。手术后6个不同时间点(3天、1周、2周、4周、6周、8周)观察新生血管的变化情况并用免疫组化方法观察VEGF及bFGF的变化，并于显微镜下行计算机图像扫描计算光密度值。结果：实验组2周时可见新生的毛细血管，随时间推移逐渐增多。实验组孔道区在术后3天即有VEGF的表达，在4周时开始上升，bFGF在4周无明显表达，二者于6周时达高峰(0.062±0.004 vs 0.198±0.022，P<0.001；0.118±0.017 vs 0.233±0.012，P<0.001)，8周开始下降。对照组仅于2周、4周有少量表达，于6周后逐渐消失。结论：TMR术可通过介导致血管生成的生长因子(如VEGF及bFGF)的表达来达到其部分血管新生的作用。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R542.22-332
Alteration of vascular endothelial growth factor
and basic fibroblast growth factor post transmyocardial laser revascularization
GUO Jing-Xuan＃， HUANG Xuan， ZHANG Ping， GE Ji
(#Department of Cardiology, the Third Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100083)
MeSH Angioplasty, laser Endothelial growth factors Fibroblast growth factor, basic/metab
, 百拇医药
ABSTRACT Objective: To observe the new vessel growth and the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) and basic fibroblast growth factor(bFGF) after transmyocardial laser revascularization(TMR) and to investigate the relationship between TMR, growth factor and angiogenesis. Methods:Preparation of acute myocardial ischemia rats， the control group is ischemia rats，the experiment group is ischemia and TMR rats. At six different time (3 days，1 week， 2 weeks，4 weeks，6 weeks，8 weeks)，to observe the alteration of VEGF and bFGF by immunohistochemistry. Results: TMR group showed capillary growth beginning from week 2 and thereafter gradually increased till week 8. TMR group had significant higher VEGF expression than controls in all subgroups with a peak in week 6 postoperatively (0.062±0.004 vs 0.198±0.022， P<0.001). No significant differences in bFGF expression were found between two groups on day 3 and in week 1. It began to increase in week 2 in controls and reduced thereafter. In TMR group, it peaked in week 6. Level of bFGF were significant higher in TMR group compared with the control group in weeks 6 and 8 (0.118±0.017 vs 0.233±0.012, P<0.001; 0.113±0.034 vs 0.162±0.010, P<0.001). Conclusion: The expression of VEGF and bFGF was significantly increased after TMR procedure with vascular growth beginning in week 2 in the model of acute myocardial ischemia in rats. It appears that the angiogenic response was mediated by the release of certain angiogenic growth factors such as VEGF and bFGF. As the increasing recognition that the long-term patency of myocardial channels created by laser does not exist, its mechanism may be related to the effect of angiogenesis.
, 百拇医药
(J Beijing Med Univ, 1999,31:536-539)
激光心肌血管重建术(transmyocardial laser revascularization, TMR)是近年来发展起来的改善冠心病心肌缺血的一种方法。尽管TMR在临床上已被广泛应用，但其作用机制不清。本研究利用大鼠急性心肌缺血模型，观察TMR 术后新生血管的变化及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子( basic fibroblast growth factor,bFGF)在缺血心肌的表达，探讨TMR与血管生长因子及血管新生间的关系，为进一步阐明 TMR的机制提供新线索。
1 材料与方法
1.1 实验动物
正常雌性Wistar大鼠84只，体重180～220g,由北京医科大学实验动物中心提供，于北京医科大学第三医院实验动物科饲养。
, 百拇医药
1.2 仪器及试剂
激光仪及传输系统：调制Nd∶YAG激光仪，由中国科学院电子研究所与北京医科大学第三医院联合研制，传输系统采用裸露光导纤维，直径为400μm,采用接触式操作方式，激光波长1.06 μm，脉冲能量为1×103J，峰值功率2×104W,平均功率为25W。以脉冲形式发放。
计算机图像分析系统：LEICA QWIN,Q550IW美国。
免疫组化试剂盒(SP Kit)，美国ZYMED公司生产；兔抗鼠 VEGF多克隆抗体及免抗鼠bFGF-2多克隆抗体，美国Santa Cruz 公司生产，均购自北京中山生物技术有限公司。
封闭用正常羊血清、3-3′-二氨基联苯胺(DAB)购自北京中山生物技术有限公司。
, 百拇医药 1.3 动物模型的制作及分组
动物分为实验组(TMR 组)和对照组，每组各7只。随机按术后处死的不同时间(3天、1周、2周、4周、6周、8周)又分为6组。
大鼠以乙醚吸入麻醉，于左侧第4肋间隙旁或心尖搏动最强处开胸，暴露及固定心脏，于右心耳与肺动脉根部之间结扎左冠状动脉(冠脉)主干或前降支，造成急性左室前壁心肌缺血模型，实验组动物结扎后即刻于左室前外侧壁以接触式行激光打孔，每只动物打孔3个，孔距2～3 mm,呈三角形分布，术毕关胸，缝合胸壁及皮肤。对照组仅行冠脉结扎术，不行激光打孔，余同实验组。
1.4 Hematoxylin and Eosin(HE)染色
动物断颈处死，心标本固定于4 g.L-1多聚甲醛溶液中，石蜡包埋，切片厚度为6μm。HE染色后于光学显微镜下观察新生毛细血管的变化。
, 百拇医药
1.5 免疫组化染色法
石蜡切片，常规脱蜡至水后于3 g.L-1过氧化氢溶液中孵育，抑制内源性过氧化酶。用10g.L-1正常羊血清封闭10 min后，加入Ⅰ抗[VEGF1∶50(体积比);bFGF 1∶40(体积比)],至湿盒中先于37℃温箱孵育30 min后放入4℃冰箱48 h，取出冲洗后依次加入生物素标记的Ⅱ抗(1∶20，体积比)及辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，然后行DBA显色，光镜下控制显色时间。以细胞内出现棕黄色颗粒沉着为阳性反应。染色后的切片于显微镜下行计算机图像扫描计算光密度值，每个样本扫描6个视野取其平均值作为该样本测得值，同组间比较，在同一条件下进行。
1.6 统计学分析
计量资料结果以
±s表示，组内比较用t检验，以P<0.05为差异有显著性。
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2 结果
2.1 标本大体形态所见
对照组与TMR组的左室前外侧壁、心尖上方可见到萎缩、色灰白的心肌组织，心壁变薄变硬。TMR组左室前外侧壁可见到点状白色痕迹，直径约0.5～1mm，周围未见到焦痂，TMR手术2周以后，有的心脏于打孔区产生心包粘连，切开心脏，肉眼不能见到孔道内口。
2.2 HE染色观察新生血管的变化
术后3 d，实验组出现明显的炎症反应，可见大量单核细胞、淋巴细胞、成纤维细胞等炎症细胞聚集，较对照组明显，两组均未见到新生血管；术后1周，实验组孔道区仍可见炎症细胞聚集，于心外膜处可见明显扩张的血管，对照组表现同前；术后2周，实验组心外膜处可见新生的细小的毛细血管，管壁被覆一到两个内皮细胞内充一到数个红细胞，对照组仍未见到新生的毛细血管；术后4～8周，对照组表现无明显改变，而实验组可见到新生的毛细血管随时间逐渐增多。
, 百拇医药
2.3 组织切片免疫组化的镜下观察
VEGF术后3天，对照组未见到免疫反应的阳性物表达，实验组的孔道区可见到大量炎性细胞聚集，心肌细胞胞浆内可见棕黄色颗粒沉着，在孔道区以外的心肌细胞内未见着色(P<0.01)；术后1周，对照组及实验组炎症反应减弱，对照组仍未见到着色的阳性物及阳性细胞，而实验组孔道区心肌细胞内有浅淡着色(P<0.01)；术后第2周，对照组心肌细胞胞浆内仍无明显阳性物表达，实验组的孔道区心肌细胞胞浆内着色较术后1周加深，棕黄色颗粒呈条带状分布于胞浆内(P<0.01)；术后第4周，对照组心肌细胞胞浆内呈阳性反应，实验组孔道区及其周围正常心肌细胞内着色加深(P<0.01)；术后第6周，对照组阳性物表达明显减少，颗粒散在分布于心肌细胞胞浆内，实验组孔道区及孔道外心肌细胞内广泛出现大量棕黄色颗粒沉着，阳性物质分布于胞浆，对照组与实验组之间差异有极显著性(P<0.001)(图1，2)；至第8周时，对照组阳性物逐渐消失，实验组阳性物的表达也较第6周时有减少(P<0.001)。对对照组及实验组心肌细胞内VEGF的变化进行计算机图像分析，结果见表1。
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图1 VEGF免疫组化染色：对照组6周时，有较弱的阳性反应。 ×400
Figure 1 VEGF immunohistochemical staining: control group 6 weeks，little positive response. ×400
图2 VEGF免疫组化染色: 实验组6周，心肌细胞内广泛出现棕黄色颗粒沉着。 ×400
Figure 2 VEGF immunohistochemical staining: experiment group
6 weeks, diffuse brown yellow granulus in myocardial cell. ×400
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bFGF术后3天、1周时，对照组及实验组的心肌孔道区均未见到阳性物表达(P<0.05)；术后2周，对照组心内膜处的心肌细胞胞浆内可见少量阳性物表达，而在实验组的孔道区无阳性反应(P<0.01)；术后第4周，对照组心肌细胞胞浆内着色浅淡，而实验组孔道区仍无着色(P<0.01)；术后第6周，对照组阳性物表达明显减少，仅在个别心肌细胞胞浆内可见浅淡着色，实验组孔道区及孔道外心肌细胞内出现大量棕黄色颗粒沉着(P<0.01)(图3，4)；至第8周时，对照组阳性物逐渐消失，实验组阳性物的表达也较第6周时略有减少(P<0.001)。对对照组及实验组心肌细胞内bFGF的变化进行计算机图像分析，结果见表1。
图3 bFGF免疫组化染色：对照组6周时，有较弱的阳性反应。 ×400
Figure 3 bFGF immunohistochemical staining:
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control group 6 weeks，little positive response. ×400
图4 bFGF免疫组化染色: 实验组6周，心肌细胞内阳性反应剧烈，范围广。 ×400
Figure 4 Immunohistochemical staining of bFGF:
experiment group 6 weeks, obviously positive
response in myocardial cell. ×400
表1 对照组及实验组心肌细胞内VEGF与bFGF光密度值的变化(±s)
, 百拇医药
Table 1 The changes of VEGF and bFGF(OD) in myocardial cell post TMR (±s)
VEGF OD
bFGF OD
Control
Experimental
Control
Experimental
3 days
0.058±0.012
, 百拇医药
0.087±0.016**
0.100±0.009
0.113±0.014*
1 week
0.055±0.006
0.077±0.010**
0.125±0.012
0.120±0.022*
2 weeks
0.058±0.012
, 百拇医药
0.078±0.010**
0.165±0.021
0.113±0.012**
4 weeks
0.080±0.011
0.095±0.011**
0.162±0.019
0.123±0.017**
6 weeks
0.068±0.008
, 百拇医药
0.198±0.022***
0.118±0.017
0.233±0.012***
8 weeks
0.062±0.004
0.107±0.012***
0.113±0.034
0.162±0.010***
*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.0001.
3 讨论
, 百拇医药
TMR为那些不宜接受冠脉介入治疗和动脉搭桥手术的冠心病心绞痛病人提供了新的治疗途径，但迄今为止其机制仍然是众多学者争论的焦点。我院从前的研究曾证实在激光孔道的瘢痕内有很多薄壁血管形成[1，2]，有实验亦发现TMR术后2周即出现局部血管增生现象[3]。人们越来越相信TMR的作用途径是通过血管新生来完成的。
人们于80年代发现了几种对血管新生具有促进作用的因子，包括VEGF、bFGF、TGF-α、TGF-β等。其中对VEGF、bFGF的研究较多。已证实VEGF及bFGF均具有促进血管新生的作用[4]，在缺血、缺氧等应激情况下，它们的表达量增加[5～7]，外源性VEGF可增加缺血心肌内的侧支血流，并使心肌内血管密度增加[8，9]。冠脉内注射及心肌内注射bFGF，可提高狗梗死心肌的收缩功能，减少梗死面积，增加梗死区小动脉及毛细血管数量[10]。
, 百拇医药
本实验的模型中，两组动物均进行左冠状动脉结扎，造成心肌严重缺血，其本身就是致血管新生的因素，使得对照组中VEGF和bFGF分别在缺血4周和2周时有表达。而实验组中VEGF及bFGF的表达在6周时显著较对照组增加。说明TMR过程中所致的额外的机械损伤很可能是导致VEGF和bFGF表达增加的原因。TMR术后3天VEGF的表达即明显增加，在6周时达到高峰，而新生血管的出现发生在术后2周，8周时有升高，在时相上均稍落后于VEGF的表达，说明TMR术致生长因子的生成在前，血管新生作用随后发生，两者之间关系密切，TMR术可通过介导致血管生成的生长因子(如VEGF及bFGF)的释放来达到其部分血管新生的作用。TMR术后3天及1周时，形态学的观察发现孔道区明显的炎症反应，故考虑TMR术导致VEGF、bFGF表达升高的作用途径可能是通过炎症过程中大量炎性介质的释放来完成的。许多炎性介质(如PGE2、IL-1，IL-6，IL-8、TNF-α、NO等)具有直接或间接的促血管新生活性[11，12]。实验组bFGF的表达时相与VEGF不同，前4周几乎未见表达，因这两种因子大多由同一种类细胞分泌，故推测会有相似的结果，对于VEGF与bFGF这种时相上的差异，目前缺乏清楚的解释。
, 百拇医药
本实验应用的是大鼠的急性心肌缺血模型，与临床上慢性心肌缺血病人的实际情况存在一定差距，有待于进一步对慢性缺血模型进行研究。
参考文献
1 郭静萱，陈明哲，毛节明，等.激光心肌血管重建的实验研究。中华心血管病杂志，1991，19(3)：158-160
2 赵 蕊，郭静萱,丁丽华，等.激光心肌血管重建的实验研究.微循环改建的形态学观察。北京医科大学学报，1991，23(2)：131-132
3 Kohmoto T,DeRosa CM,Yamamoto N, et al.Evidence of vascular growth associated with laser treatment of normal canine myocardium.Ann Thorac Surg,1998,65:1360-1367
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4 Folkman J,Klagsburn M.Angiogenic factors.Science,1987,235：442-447
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6 Cohen MV,Hatcher VB,Yaghdjian V, et al. Longitudinal changes in myocardial basic fibroblast growth factor (FGF-2)activity following coronary artery ligation in the dog.J Moll Cell Cardiol,1994,26(5):683-690
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10 Yanagisawa-Mitra A,Kurashima C,Utsuyama M, et al. Salvage of infarcted myocardium by angiogeneic action of basic fibroblast growth factor. Science, 1992, 257(5075): 1402-1404
11 Nickoloff BJ,Mitra RS,Varani J, et al. Aberrant production of interleukin-8 and thrombospondin-1 by psoriatic Keratinocytes mediates angiogenesis.Am J Pathol,1994,44:820-828
12 Fajardo LF,Kwan HH,Kowalaski J, et al. Dual role of tumor necrosis factor-α in angiogenesis. Am J Pathol,1992,140:539-544
(1999-07-19收稿), 百拇医药
单位：北京医科大学第三医院心内科，北京 100083 葛霁 中国科学院电子研究所
关键词：血管成形术；激光；内皮生长因子；成纤维细胞生长因子；碱性；代谢
北京医科大学学报990615 摘 要 目的：观察激光心肌血管重建术(transmyocardial laser revascularization, TMR)后新生血管的变化及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor ，VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor ，bFGF)在缺血心肌的表达。方法：制作大鼠急性心肌缺血模型，以单纯缺血为对照组，实验组行激光打孔。手术后6个不同时间点(3天、1周、2周、4周、6周、8周)观察新生血管的变化情况并用免疫组化方法观察VEGF及bFGF的变化，并于显微镜下行计算机图像扫描计算光密度值。结果：实验组2周时可见新生的毛细血管，随时间推移逐渐增多。实验组孔道区在术后3天即有VEGF的表达，在4周时开始上升，bFGF在4周无明显表达，二者于6周时达高峰(0.062±0.004 vs 0.198±0.022，P<0.001；0.118±0.017 vs 0.233±0.012，P<0.001)，8周开始下降。对照组仅于2周、4周有少量表达，于6周后逐渐消失。结论：TMR术可通过介导致血管生成的生长因子(如VEGF及bFGF)的表达来达到其部分血管新生的作用。
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中国图书资料分类法分类号 R542.22-332
Alteration of vascular endothelial growth factor
and basic fibroblast growth factor post transmyocardial laser revascularization
GUO Jing-Xuan＃， HUANG Xuan， ZHANG Ping， GE Ji
(#Department of Cardiology, the Third Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100083)
MeSH Angioplasty, laser Endothelial growth factors Fibroblast growth factor, basic/metab
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ABSTRACT Objective: To observe the new vessel growth and the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) and basic fibroblast growth factor(bFGF) after transmyocardial laser revascularization(TMR) and to investigate the relationship between TMR, growth factor and angiogenesis. Methods:Preparation of acute myocardial ischemia rats， the control group is ischemia rats，the experiment group is ischemia and TMR rats. At six different time (3 days，1 week， 2 weeks，4 weeks，6 weeks，8 weeks)，to observe the alteration of VEGF and bFGF by immunohistochemistry. Results: TMR group showed capillary growth beginning from week 2 and thereafter gradually increased till week 8. TMR group had significant higher VEGF expression than controls in all subgroups with a peak in week 6 postoperatively (0.062±0.004 vs 0.198±0.022， P<0.001). No significant differences in bFGF expression were found between two groups on day 3 and in week 1. It began to increase in week 2 in controls and reduced thereafter. In TMR group, it peaked in week 6. Level of bFGF were significant higher in TMR group compared with the control group in weeks 6 and 8 (0.118±0.017 vs 0.233±0.012, P<0.001; 0.113±0.034 vs 0.162±0.010, P<0.001). Conclusion: The expression of VEGF and bFGF was significantly increased after TMR procedure with vascular growth beginning in week 2 in the model of acute myocardial ischemia in rats. It appears that the angiogenic response was mediated by the release of certain angiogenic growth factors such as VEGF and bFGF. As the increasing recognition that the long-term patency of myocardial channels created by laser does not exist, its mechanism may be related to the effect of angiogenesis.
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(J Beijing Med Univ, 1999,31:536-539)
激光心肌血管重建术(transmyocardial laser revascularization, TMR)是近年来发展起来的改善冠心病心肌缺血的一种方法。尽管TMR在临床上已被广泛应用，但其作用机制不清。本研究利用大鼠急性心肌缺血模型，观察TMR 术后新生血管的变化及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子( basic fibroblast growth factor,bFGF)在缺血心肌的表达，探讨TMR与血管生长因子及血管新生间的关系，为进一步阐明 TMR的机制提供新线索。
1 材料与方法
1.1 实验动物
正常雌性Wistar大鼠84只，体重180～220g,由北京医科大学实验动物中心提供，于北京医科大学第三医院实验动物科饲养。
, 百拇医药
1.2 仪器及试剂
激光仪及传输系统：调制Nd∶YAG激光仪，由中国科学院电子研究所与北京医科大学第三医院联合研制，传输系统采用裸露光导纤维，直径为400μm,采用接触式操作方式，激光波长1.06 μm，脉冲能量为1×103J，峰值功率2×104W,平均功率为25W。以脉冲形式发放。
计算机图像分析系统：LEICA QWIN,Q550IW美国。
免疫组化试剂盒(SP Kit)，美国ZYMED公司生产；兔抗鼠 VEGF多克隆抗体及免抗鼠bFGF-2多克隆抗体，美国Santa Cruz 公司生产，均购自北京中山生物技术有限公司。
封闭用正常羊血清、3-3′-二氨基联苯胺(DAB)购自北京中山生物技术有限公司。
, 百拇医药 1.3 动物模型的制作及分组
动物分为实验组(TMR 组)和对照组，每组各7只。随机按术后处死的不同时间(3天、1周、2周、4周、6周、8周)又分为6组。
大鼠以乙醚吸入麻醉，于左侧第4肋间隙旁或心尖搏动最强处开胸，暴露及固定心脏，于右心耳与肺动脉根部之间结扎左冠状动脉(冠脉)主干或前降支，造成急性左室前壁心肌缺血模型，实验组动物结扎后即刻于左室前外侧壁以接触式行激光打孔，每只动物打孔3个，孔距2～3 mm,呈三角形分布，术毕关胸，缝合胸壁及皮肤。对照组仅行冠脉结扎术，不行激光打孔，余同实验组。
1.4 Hematoxylin and Eosin(HE)染色
动物断颈处死，心标本固定于4 g.L-1多聚甲醛溶液中，石蜡包埋，切片厚度为6μm。HE染色后于光学显微镜下观察新生毛细血管的变化。
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1.5 免疫组化染色法
石蜡切片，常规脱蜡至水后于3 g.L-1过氧化氢溶液中孵育，抑制内源性过氧化酶。用10g.L-1正常羊血清封闭10 min后，加入Ⅰ抗[VEGF1∶50(体积比);bFGF 1∶40(体积比)],至湿盒中先于37℃温箱孵育30 min后放入4℃冰箱48 h，取出冲洗后依次加入生物素标记的Ⅱ抗(1∶20，体积比)及辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，然后行DBA显色，光镜下控制显色时间。以细胞内出现棕黄色颗粒沉着为阳性反应。染色后的切片于显微镜下行计算机图像扫描计算光密度值，每个样本扫描6个视野取其平均值作为该样本测得值，同组间比较，在同一条件下进行。
1.6 统计学分析
计量资料结果以
±s表示，组内比较用t检验，以P<0.05为差异有显著性。, http://www.100md.com
2 结果
2.1 标本大体形态所见
对照组与TMR组的左室前外侧壁、心尖上方可见到萎缩、色灰白的心肌组织，心壁变薄变硬。TMR组左室前外侧壁可见到点状白色痕迹，直径约0.5～1mm，周围未见到焦痂，TMR手术2周以后，有的心脏于打孔区产生心包粘连，切开心脏，肉眼不能见到孔道内口。
2.2 HE染色观察新生血管的变化
术后3 d，实验组出现明显的炎症反应，可见大量单核细胞、淋巴细胞、成纤维细胞等炎症细胞聚集，较对照组明显，两组均未见到新生血管；术后1周，实验组孔道区仍可见炎症细胞聚集，于心外膜处可见明显扩张的血管，对照组表现同前；术后2周，实验组心外膜处可见新生的细小的毛细血管，管壁被覆一到两个内皮细胞内充一到数个红细胞，对照组仍未见到新生的毛细血管；术后4～8周，对照组表现无明显改变，而实验组可见到新生的毛细血管随时间逐渐增多。
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2.3 组织切片免疫组化的镜下观察
VEGF术后3天，对照组未见到免疫反应的阳性物表达，实验组的孔道区可见到大量炎性细胞聚集，心肌细胞胞浆内可见棕黄色颗粒沉着，在孔道区以外的心肌细胞内未见着色(P<0.01)；术后1周，对照组及实验组炎症反应减弱，对照组仍未见到着色的阳性物及阳性细胞，而实验组孔道区心肌细胞内有浅淡着色(P<0.01)；术后第2周，对照组心肌细胞胞浆内仍无明显阳性物表达，实验组的孔道区心肌细胞胞浆内着色较术后1周加深，棕黄色颗粒呈条带状分布于胞浆内(P<0.01)；术后第4周，对照组心肌细胞胞浆内呈阳性反应，实验组孔道区及其周围正常心肌细胞内着色加深(P<0.01)；术后第6周，对照组阳性物表达明显减少，颗粒散在分布于心肌细胞胞浆内，实验组孔道区及孔道外心肌细胞内广泛出现大量棕黄色颗粒沉着，阳性物质分布于胞浆，对照组与实验组之间差异有极显著性(P<0.001)(图1，2)；至第8周时，对照组阳性物逐渐消失，实验组阳性物的表达也较第6周时有减少(P<0.001)。对对照组及实验组心肌细胞内VEGF的变化进行计算机图像分析，结果见表1。
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图1 VEGF免疫组化染色：对照组6周时，有较弱的阳性反应。 ×400
Figure 1 VEGF immunohistochemical staining: control group 6 weeks，little positive response. ×400
图2 VEGF免疫组化染色: 实验组6周，心肌细胞内广泛出现棕黄色颗粒沉着。 ×400
Figure 2 VEGF immunohistochemical staining: experiment group
6 weeks, diffuse brown yellow granulus in myocardial cell. ×400
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bFGF术后3天、1周时，对照组及实验组的心肌孔道区均未见到阳性物表达(P<0.05)；术后2周，对照组心内膜处的心肌细胞胞浆内可见少量阳性物表达，而在实验组的孔道区无阳性反应(P<0.01)；术后第4周，对照组心肌细胞胞浆内着色浅淡，而实验组孔道区仍无着色(P<0.01)；术后第6周，对照组阳性物表达明显减少，仅在个别心肌细胞胞浆内可见浅淡着色，实验组孔道区及孔道外心肌细胞内出现大量棕黄色颗粒沉着(P<0.01)(图3，4)；至第8周时，对照组阳性物逐渐消失，实验组阳性物的表达也较第6周时略有减少(P<0.001)。对对照组及实验组心肌细胞内bFGF的变化进行计算机图像分析，结果见表1。
图3 bFGF免疫组化染色：对照组6周时，有较弱的阳性反应。 ×400
Figure 3 bFGF immunohistochemical staining:
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control group 6 weeks，little positive response. ×400
图4 bFGF免疫组化染色: 实验组6周，心肌细胞内阳性反应剧烈，范围广。 ×400
Figure 4 Immunohistochemical staining of bFGF:
experiment group 6 weeks, obviously positive
response in myocardial cell. ×400
表1 对照组及实验组心肌细胞内VEGF与bFGF光密度值的变化(
±s), 百拇医药
Table 1 The changes of VEGF and bFGF(OD) in myocardial cell post TMR (
±s)VEGF OD
bFGF OD
Control
Experimental
Control
Experimental
3 days
0.058±0.012
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0.087±0.016**
0.100±0.009
0.113±0.014*
1 week
0.055±0.006
0.077±0.010**
0.125±0.012
0.120±0.022*
2 weeks
0.058±0.012
, 百拇医药
0.078±0.010**
0.165±0.021
0.113±0.012**
4 weeks
0.080±0.011
0.095±0.011**
0.162±0.019
0.123±0.017**
6 weeks
0.068±0.008
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0.198±0.022***
0.118±0.017
0.233±0.012***
8 weeks
0.062±0.004
0.107±0.012***
0.113±0.034
0.162±0.010***
*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.0001.
3 讨论
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TMR为那些不宜接受冠脉介入治疗和动脉搭桥手术的冠心病心绞痛病人提供了新的治疗途径，但迄今为止其机制仍然是众多学者争论的焦点。我院从前的研究曾证实在激光孔道的瘢痕内有很多薄壁血管形成[1，2]，有实验亦发现TMR术后2周即出现局部血管增生现象[3]。人们越来越相信TMR的作用途径是通过血管新生来完成的。
人们于80年代发现了几种对血管新生具有促进作用的因子，包括VEGF、bFGF、TGF-α、TGF-β等。其中对VEGF、bFGF的研究较多。已证实VEGF及bFGF均具有促进血管新生的作用[4]，在缺血、缺氧等应激情况下，它们的表达量增加[5～7]，外源性VEGF可增加缺血心肌内的侧支血流，并使心肌内血管密度增加[8，9]。冠脉内注射及心肌内注射bFGF，可提高狗梗死心肌的收缩功能，减少梗死面积，增加梗死区小动脉及毛细血管数量[10]。
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本实验的模型中，两组动物均进行左冠状动脉结扎，造成心肌严重缺血，其本身就是致血管新生的因素，使得对照组中VEGF和bFGF分别在缺血4周和2周时有表达。而实验组中VEGF及bFGF的表达在6周时显著较对照组增加。说明TMR过程中所致的额外的机械损伤很可能是导致VEGF和bFGF表达增加的原因。TMR术后3天VEGF的表达即明显增加，在6周时达到高峰，而新生血管的出现发生在术后2周，8周时有升高，在时相上均稍落后于VEGF的表达，说明TMR术致生长因子的生成在前，血管新生作用随后发生，两者之间关系密切，TMR术可通过介导致血管生成的生长因子(如VEGF及bFGF)的释放来达到其部分血管新生的作用。TMR术后3天及1周时，形态学的观察发现孔道区明显的炎症反应，故考虑TMR术导致VEGF、bFGF表达升高的作用途径可能是通过炎症过程中大量炎性介质的释放来完成的。许多炎性介质(如PGE2、IL-1，IL-6，IL-8、TNF-α、NO等)具有直接或间接的促血管新生活性[11，12]。实验组bFGF的表达时相与VEGF不同，前4周几乎未见表达，因这两种因子大多由同一种类细胞分泌，故推测会有相似的结果，对于VEGF与bFGF这种时相上的差异，目前缺乏清楚的解释。
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本实验应用的是大鼠的急性心肌缺血模型，与临床上慢性心肌缺血病人的实际情况存在一定差距，有待于进一步对慢性缺血模型进行研究。
参考文献
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10 Yanagisawa-Mitra A,Kurashima C,Utsuyama M, et al. Salvage of infarcted myocardium by angiogeneic action of basic fibroblast growth factor. Science, 1992, 257(5075): 1402-1404
11 Nickoloff BJ,Mitra RS,Varani J, et al. Aberrant production of interleukin-8 and thrombospondin-1 by psoriatic Keratinocytes mediates angiogenesis.Am J Pathol,1994,44:820-828
12 Fajardo LF,Kwan HH,Kowalaski J, et al. Dual role of tumor necrosis factor-α in angiogenesis. Am J Pathol,1992,140:539-544
(1999-07-19收稿), 百拇医药