内源性一氧化碳与一氧化氮在高血压发病中的相互作用*
作者：欧和生 严丽梅 王晓红 庞永正 苏静怡 唐朝枢
单位：欧和生 王晓红 庞永正 苏静怡 唐朝枢 北京医科大学第一医院心血管病研究所，北京100034；严丽梅 衡阳医学院
关键词：一氧化氮；代谢；一氧化氮合酶☆；一氧化碳；代谢；血红素氧化酶；代谢；高血压；流行病学
北京医科大学学报990611 摘 要 目的：研究一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)/一氧化氮(nictric oxide, NO)系统和血红素加氧酶(heme oxygenase, HO)/一氧化碳(carbon monoxide, CO)系统在高血压发生机制中的作用及其相互关系。方法：采用NOS抑制剂诱导大鼠高血压模型，观察大鼠动脉血压，主动脉组织NOS、HO活性和CO产生释放的变化。结果：大鼠在注射NOS抑制剂——左旋硝基精氨酸(NG-nitric-L-arginine, L-NNA)后第4周血压明显增高，同时HO活性和HbCO形成分别增加28.4%和31.1% (均为P<0.01)，血浆和主动脉平滑肌cGMP含量明显增加。同时注射HO底物HLL和L-NNA时，4周内血压无明显改变，而HO活性、HbCO的形成、血浆和主动脉平滑肌cGMP含量比单纯L-NNA组增加更明显。结果表明在NOS抑制剂诱导的大鼠高血压形成过程中，内源性HO/CO系统可呈代偿性上调状态；应用HO底物可诱导HO活性和CO的生成增加，对NOS抑制剂所诱导的高血压有防止作用。结论：内源性CO和NO都参与血管张力的调节，两者在高血压发生发展过程中有相互代偿作用。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R544.1-332
The interaction between endogenous carbon monoxide
and nitric oxide in regulating the pathogenesis of hypertension
OU He-Sheng＃, YAN Li-Mei, WANG Xiao-Hong, PANG Yong-Zheng, SU Jing-Yi, TANG Chao-Shu
(#Institute of Cardiovascular Disease, the First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034)
, 百拇医药
MeSH Nitric oxide/metab Nitric oxide synthase☆ Carbon monoxide/metab Heme oxygenase/metab Hypertension/epidemiol
ABSTRACT Objective: To investigate the interaction between endogenous carbon monoxide(CO) and nitric oxide(NO) in regulating the pathogenesis of hypertension induced by NO synthase inhibition in rats. Methods: The blood pressure of animal was measured, and the HO activity, HbCO formation and cGMP content within aortic smooth muscle tissues were examined. Results: It was suggested that blood pressure of the animal in the 4th week was significantly elevated after treatment of NG-Nitric-L-Arginine(L-NNA),an inhibitor of NO synthase, while HO activity, HbCO formation, cGMP content in plasma and tissues were significantly increased by 28.4%, 31.3%, 58.8% and 56.4% (P<0.01, respectively). It was interesting that the blood pressure of the rats was unchanged within 4 weeks after treatment of L-NNA and HLL (heme-L-lysinate, a HO substrate), and the HO activity, HbCO formation, cGMP content in plasma and tissues were more enhanced than that in single L-NNA-treated rats. The data revealed that endogenous HO/CO system was upregulated during NO synthase-induced hypertension formation which might be restored by administration of HO substrate. Conclusion: It was concluded that both endogenous CO and NO were involved in regulating vascular tone, and they could be compensated each other for regulating the pathogenesis of hypertension induced by NO synthase inhibition.
, http://www.100md.com
(J Beijing Med Univ, 1999,31:520-523)
一氧化氮(nitric oxide, NO)是血管内皮细胞利用L-精氨酸产生、释放的内源性硝基扩血管剂，内皮细胞损伤可使其合成释放减少而引起血管收缩；应用左旋硝基精氨酸(NG-nitric-L-arginine, L-NNA)能诱导大鼠高血压[1，2]。继NO之后，近年来人们又发现一种新的参与细胞内信息传递的小分子气体——内源性一氧化碳(carbon monoxide, CO)，其也具有重要的血管生物学效应[3]。内源性CO主要由血红素在血红素加氧酶(heme oxygenase, HO)作用下降解过程所产生。在我们前面的工作中，应用HO活性抑制剂2,4-二甘油次卟啉锌(zinc deuteroporphyrin 2,4-bisglycol, ZnDPBG)成功地诱发大鼠高血压，并且对败血症性休克时低血压的发生有预防作用；HO底物血红素-左旋-赖氨酸盐(heme-L-lysinate, HLL)能明显地降低自发性高血压大鼠的血压[4，5]。这些资料提示NO和CO均可能参与血管舒张功能的调节；然而它们在高血压形成过程中是否存在相互作用尚不清楚，在血管张力调节中的相互关系亦未得到阐明。本实验在左旋硝基精氨酸诱导大鼠高血压模型上，观察主动脉组织HO活性和CO生成变化，以探讨内源性CO和NO在高血压发生机制中的相互作用。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 大鼠高血压模型的制备[2]
选用10周龄雄性Wistar大鼠(150～200g)18只，随机分为3组，每组6只：(1)对照组，(2)NOS抑制组，(3)NOS抑制+HLL组。第(2)组腹腔注射L-NNA(15 mg.kg-1.d-1)；第(3)组腹腔注射L-NNA(15 mg.kg-1.d-1)和HLL(15 mg.kg-1.d-1)；对照组注射等容积生理盐水；连续注射4周。喂养期间动物自由进食、进水。
1.2 大鼠血压测定
停药12 h后，用大鼠血压检测仪(Model RBP-1)检测大鼠尾动脉血压。第4周测完血压后过量麻醉处死动物，取主动脉备用。
, http://www.100md.com
1.3 主动脉平滑肌HO活性和碳氧血红蛋白(HbCO)生成测定
主动脉去除内膜和外层组织，用于以下HO活性HbCO生成的测定。HO活性测定采用Tenhunen等[6]和Morita等[7]的方法稍加改良。主要步骤有，血管组织用5倍体积冷Tris/HCl缓冲液(50 mmol.L-1, pH7.4,含250 mmol.L-1蔗糖和0.5 mmol.L-1EDTA)匀浆，匀浆液过滤后离心两次(800×g10min，13500×g20min)沉淀线粒体。上清液再离心(105000×g90min)分离微粒体。焦磷酸钠(100mmol.L-1, pH7.4)去除血红蛋白后，再用磷酸钾缓冲液(pH7.4, 含0.1mmol.L-1 EDTA)制成微粒体悬液, 使其蛋白浓度为4 g.L-1。取0.5 mg微粒体加入0.4 ml反应液中(含肝实质0.6 mg, NADP 0.8 mmol.L-1, 6-磷酸葡萄糖1 mmol.L-1和6-磷酸葡萄糖脱氢酶0.2 U),再加入10 μl0.25 mmol.L-1的血红素作底物。混匀后37℃孵育10 min，用50 μl 100g.L-1 HgCl2终止反应。在紫外分光光度计上(OD464-530)比色。HO活性单位用每毫克蛋白胆红素形成速率(pmol.h-1)表示。组织蛋白含量用考马斯亮蓝法测定。
, http://www.100md.com
主动脉组织HbCO形成测定采用Morita和Kourembanas[8]方法。根据CO与血红蛋白结合产生HbCO的原理，用HbCO的生成量代表组织CO的生成释放量。主要步骤有，将主动脉平滑肌剪成3 mm长的组织块，置于DMEM培养液中(每15mg组织含纯血红蛋白1mg) 孵育1h[37℃, 95%(体积分数)O2-5%(体积分数)CO2]。在光电血氧仪上(波长569 nm) 测定HbCO生成量。
1.4 血管组织cGMP含量的测定
血浆和主动脉平滑肌组织中cGMP含量的测定采用放免法。取血管组织称重后加入60 g.L-1三氯醋酸(0℃)制成匀浆，低温离心(2000×g,20 min), 上清液用0.2 mol.L-1乙酸缓冲液提取2次，再以无水乙醇提取3次，重复离心后，收集上清液，沉淀再用75%(体积分数)乙醇提取1次，收集每次用前的上清液，60℃氮气吹干，测定时用400 μl乙酸复溶，然后用cGMP放免药盒测定cGMP含量，以每毫克蛋白的量(μmol)表示。
, 百拇医药
1.5 主要材料和试剂
Wistar大鼠由北京医科大学动物中心提供，L-NNA，HLL，NADP，6-磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖脱氢酶等均购自Sigma公司；RBP-1型大鼠血压检测仪来自中日友好医院；WFZ800-D2型紫外分光光度计系北京第二光学仪器厂产品；cGMP放免药盒由上海中医学院提供。
1.6 统计学处理
结果用
±s表示，各组间差异比较用方差分析，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 NOS抑制剂对大鼠血压和主动脉组织HO活性和HbCO生成变化的影响
, 百拇医药
表1显示各实验组动物在给予L-NNA或同时给予L-NNA和HLL后不同时间的血压变化情况。与对照组比较，单纯注射L-NNA 2周内动物血压无明显变化，第3周血压升高，第4周血压升高达47.8%。同时注射L-NNA和HLL时，4周内动物血压无明显变化；与单纯L-NNA组相比，第3周和第4周动物血压分别降低14.7%和28.2% (均为P<0.01)。
表1 L-NNA和HLL对实验大鼠血压的影响 (±s)
Table 1 The effects of L-NNA and HLL on changes of arterial blood pressure in rats in various experimental groups (±s)p/kPa Groups
, 百拇医药
n
t/w
0
1
2
3
4
Control
6
12.3±0.7
12.3±0.4
12.3±0.6
12.4±0.8
, 百拇医药
12.5±0.6
L-NNA
6
11.9±0.6
12.3±0.9
12.7±0.5
15.0±0.7*
18.1±0.5**
L-NNA+HLL
6
12.0±0.5
11.9±0.8
, 百拇医药
12.4±0.8
12.8±0.3##
13.0±0.9**##
q=5.70, *P<0.05, q=21.54, **P<0.01, compared with control; q=8.22, 20.00, ##P<0.01, compared with L-NNA group respectively； p，blood pressure.
2.2 大鼠主动脉平滑肌组织HO活性和HbCO形成的变化
与对照组比较，单纯注射L-NNA第4周主动脉平滑肌组织HO活性和HbCO的形成分别增加28.4%和31.1%(均为P<0.01)。有趣的是，同时注射L-NNA和HLL时，HO活性和HbCO的形成增加更为明显，与单纯L-NNA组比较，HO活性和HbCO的形成分别增加22.4%和28.4% (均为P<0.01，表2)。
, 百拇医药
表2 主动脉平滑肌HO活性和HbCO形成的变化(±s)
Table 2 Changes of HO activity and HbCO formation from
vascular smooth muscle tissues in various experimental groups (±s) Groups
n
HO activity
(pmol.mg-1△.h-1)
, http://www.100md.com
c[HbCO]
/μmol.L-1
Control
6
363±25
4.8±0.5
L-NNA
6
465±42**
6.2±0.7**
L-NNA+HLL
, 百拇医药
6
560±68**##
8.0±0.7**##
△, per mg protein; q=20.82, 10.10, 9.60, 12.31, **P<0.01, compared with control; q=7.21, 8.13, ##P<0.01, compared with L-NNA group respectively； c, concentration.
2.3 大鼠血浆和主动脉组织cGMP含量的变化
单纯注射L-NNA后4周，大鼠血浆和主动脉平滑肌组织中cGMP量比对照组分别增加58.8%和56.4%(均为P<0.01)。同时注射L-NNA和HLL时cGMP量的增加更加明显，血浆和组织cGMP量比单纯L-NNA组分别增加37.3%和51.3%(均为P<0.01，表3)。
, 百拇医药
表3 实验各组动物血浆和主动脉平滑肌组织每毫克蛋白
cGMP的量(μmol,±s)
Table 3 Contents of cGMP in plasma and vascular smooth muscle
tissues per mg protein in various experimental groups(μmol,±s) Group
n
cGMP content
Plasma
, 百拇医药
Aorta
Control
6
4.2±0.5
0.46±0.08
L-NNA
6
6.7±0.8**
1.48±0.10**
L-NNA+HLL
6
9.2±0.6**#
, http://www.100md.com
2.24±0.11**##
q=9.98, 18.52, 25.50, 44.52, **P<0.01, compared with control; q=10.02, 20.54 #P<0.05, ##P<0.01, compared with L-NNA group.
3 讨论
本实验应用NOS抑制剂L-NNA诱导大鼠高血压，大鼠在第4周形成稳定的高血压，同时伴随HO活性和CO的产生增加；血浆和主动脉平滑肌组织中的cGMP量亦有所增加。然而令人感兴趣的是，同时加入L-NNA和HLL时，大鼠在4周内并不出现高血压，而HO的活性和CO的产生比单纯给予L-NNA的大鼠更增加，血浆和主动脉平滑肌组织中的cGMP含量也有类似变化。当同时给予NOS抑制剂L-NNA和HO的底物HLL时，由于此时的HO处于高水平状态，因而产生大量的CO，以至于在本实验4周内大鼠不出现L-NNA诱导的高血压。发生高血压同时伴HO/CO系统上调，这似乎矛盾，因为内源性CO是一种血管舒张因子。本实验认为，在慢性给予NOS抑制剂的情况下，高血压本身是一种血管损伤性因素，而HO活性的上调可能是血管平滑肌细胞对慢性损伤的一种应激反应。最近有类似的实验表明，HO上调对大鼠球囊拉伤后血管壁细胞的增殖有一定的抑制作用[9]。在动脉粥样硬化斑块形成过程中存在HO-1的表达增加[10]。HO象NOS一样具有诱导型和结构型[11]，HO-1属于诱导型，在许多因素作用下被诱导产生，包括NOS的一些诱导因子(如细菌脂多糖和细胞因子)[12]；HO-2是结构型，它属于糖皮质激素调节基因家族中的一员，并可由肾上腺皮质激素引起上调[13]。由糖皮质激素也可上调诱导型NOS活性，但下调结构型NOS。资料表明，诱导型HO (HO-1)是一种细胞应激性反应蛋白，对细胞的损伤具有一定的保护作用[14],在家兔动脉粥样硬化斑块形成中，HO-1表达上调可能是血管壁细胞对慢性刺激的适应性反应之一[15]。
, 百拇医药
内源性CO与NO一样也是一种小分子气体，两者均具有激活可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylate cyclase, sGC)的功能，后者能将GTP转化成cGMP[7]。在正常情况下很难辨别是NO还是CO对sGC的激活，除非使用HO或NOS的特异性抑制剂进行人为的控制。本实验长期应用NOS抑制剂观察到血浆和主动脉平滑肌细胞中的cGMP水平改变与HO活性和CO产生释放的变化相平行。血压增加同时伴有cGMP增多，表明内源性CO通过sGC-cGMP机制尚不足以完全代偿NOS抑制剂所导致的高血压，同时也提示sGC-cGMP机制不是调节血管舒缩状态的唯一途径。但本实验在同时加HLL时，cGMP的进一步增加却能有效地舒张血管，有利于防止高血压的发生。在NOS受到抑制时，引起血管舒张的cGMP阈值有待研究。
体外实验证实，应用NOS抑制剂对NOS活性有明显的抑制作用，但对HO活性无影响；同样地，HO抑制剂对HO活性有明显的抑制作用，但对NOS活性无影响[15]。这似乎表明NOS和HO处于相对独立状态。然而本实验结果表明，应用NOS抑制剂能引起大鼠的血管平滑肌细胞中HO活性的上调；类似的实验是应用HO-1诱导物buthionine(S,R)-sulfoximine(BSO)对2d新生大鼠腹腔注射时，2d后脑组织HO活性增加1倍，同时NOS活性减少40%[16]。这表明至少在体内NOS和HO是存在相互影响的。推测正常情况下对血管舒张的调节可能由NOS/NO系统占优势，一旦出现某些病理情况如血管内皮细胞的损伤，则HO/CO系统上调。它不仅是对慢性损伤的一种适应性反应，也可作为NOS/NO系统受损的代偿性调节。在高血压等病理情况下HO/CO系统上调的机制有待进一步阐明。
, 百拇医药
*国家自然科学基金(39730220)资助课题；
参考文献
1 Dananberg J， Sider RS, Grekin RJ. Sustained hypertension induced by orally administered nitro-L-arginine. Hypertension, 1993，21:359-363
2 高连如，赵云涛，石湘芸，等.左旋硝基精氨酸诱导大鼠持续高血压.基础医学与临床, 1995，15(3):49-53
3 Jonhson RA, Lavesa M, Askari B, et al. A heme oxygenase product, presumably carbon monoxide, mediates a vasodepressor function in rats. Hypertension, 1995，25:166-169
, 百拇医药
4 Ou HS，Yang J，Dong LW， et al.Role of endogenous carbon monoxide in hypertension pathogenesis of rats. Acta Physiol Sin, 1998， 50(6): 643-648
5 Ou HS，Yang J， Dong LW， et al. The role of endogenous carbon monoxide in hypotension pathogenesis of rats during septic shock. Acta Physiol Sin, 1999， 51(1): 1-6
6 Tenhunen R, Marver HS, Schmid R. The enzymatic catabolism of hemoglobin: Stimulation of microsomal heme oxygenase by hemin. J Lab Clin Med, 1970，75:410-420
, http://www.100md.com
7 Morita T, Perrella MA, Lee M-E, et al. Smooth muscle cell-derived carbon monoxide is a regulator of vascular cGMP. Proc Natl Acad Sci USA, 1995，92:1475-1479
8 Morita T, Kourembanas S. Endothelial cell expression of vasoconstrictors and growth factors is regulated by smooth muscle cell-derived carbon monoxide. J Clin Invest, 1995， 96:2676-2682
9 Ou HS, Yang J, Tong LJ, et al. Role of endogenous carbon monoxide in neointimal formation induced by balloon-injury in rat aortic artery. Chin Med Sci J, 1999,14(1):41-45
, http://www.100md.com
10 Wang LJ, Lee TS, Lee FY, et al. Expression of heme oxygenase-1 in atherosclerotic lesions. Am J Pathol, 1998,152(3):711-720
11 Cruse I , Maines MD. Evidence suggesting that two forms of heme oxygenase are products of different genes. J Biol Chem, 1988，263:3348-3353
12 Geller DA, Nussler AK, DiSalvio M, et al. Cytokines ,endotoxin, and glucocorticoids regulate the expression of inducible nitric oxide synthase in hepatocytes. Proc Natl Acad Sci， 1993，90:522-526
, 百拇医药
13 Weber CM, Eke BC, Maines MD. Corticosterone regulates heme oxygenase-2 and NO synthase transcription and protein experssion in rat brain. J Neurochem， 1994，63:953-962
14 Chong KY, Lai CC, Lille S, et al. Stable overexpression of the constitutive form of heat shock protein 70 confers oxidative protection. J Mol Cell Cardiol, 1998，30(3):599-608
15 Luo D, Vincent SR. Metalloporphyrins inhibit nitric oxide-dependent cGMP formation in vivo. Eur J Pharmacol, 1994，267:263-267
16 Maines MD. Carbon monoxide and nitric oxide homology: differential modulation of heme oxygenase in brain and detection of protein and activity. Methods Enzymol, 1996，268:473-488
(1998-10-09收稿), http://www.100md.com
单位：欧和生 王晓红 庞永正 苏静怡 唐朝枢 北京医科大学第一医院心血管病研究所，北京100034；严丽梅 衡阳医学院
关键词：一氧化氮；代谢；一氧化氮合酶☆；一氧化碳；代谢；血红素氧化酶；代谢；高血压；流行病学
北京医科大学学报990611 摘 要 目的：研究一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)/一氧化氮(nictric oxide, NO)系统和血红素加氧酶(heme oxygenase, HO)/一氧化碳(carbon monoxide, CO)系统在高血压发生机制中的作用及其相互关系。方法：采用NOS抑制剂诱导大鼠高血压模型，观察大鼠动脉血压，主动脉组织NOS、HO活性和CO产生释放的变化。结果：大鼠在注射NOS抑制剂——左旋硝基精氨酸(NG-nitric-L-arginine, L-NNA)后第4周血压明显增高，同时HO活性和HbCO形成分别增加28.4%和31.1% (均为P<0.01)，血浆和主动脉平滑肌cGMP含量明显增加。同时注射HO底物HLL和L-NNA时，4周内血压无明显改变，而HO活性、HbCO的形成、血浆和主动脉平滑肌cGMP含量比单纯L-NNA组增加更明显。结果表明在NOS抑制剂诱导的大鼠高血压形成过程中，内源性HO/CO系统可呈代偿性上调状态；应用HO底物可诱导HO活性和CO的生成增加，对NOS抑制剂所诱导的高血压有防止作用。结论：内源性CO和NO都参与血管张力的调节，两者在高血压发生发展过程中有相互代偿作用。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R544.1-332
The interaction between endogenous carbon monoxide
and nitric oxide in regulating the pathogenesis of hypertension
OU He-Sheng＃, YAN Li-Mei, WANG Xiao-Hong, PANG Yong-Zheng, SU Jing-Yi, TANG Chao-Shu
(#Institute of Cardiovascular Disease, the First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034)
, 百拇医药
MeSH Nitric oxide/metab Nitric oxide synthase☆ Carbon monoxide/metab Heme oxygenase/metab Hypertension/epidemiol
ABSTRACT Objective: To investigate the interaction between endogenous carbon monoxide(CO) and nitric oxide(NO) in regulating the pathogenesis of hypertension induced by NO synthase inhibition in rats. Methods: The blood pressure of animal was measured, and the HO activity, HbCO formation and cGMP content within aortic smooth muscle tissues were examined. Results: It was suggested that blood pressure of the animal in the 4th week was significantly elevated after treatment of NG-Nitric-L-Arginine(L-NNA),an inhibitor of NO synthase, while HO activity, HbCO formation, cGMP content in plasma and tissues were significantly increased by 28.4%, 31.3%, 58.8% and 56.4% (P<0.01, respectively). It was interesting that the blood pressure of the rats was unchanged within 4 weeks after treatment of L-NNA and HLL (heme-L-lysinate, a HO substrate), and the HO activity, HbCO formation, cGMP content in plasma and tissues were more enhanced than that in single L-NNA-treated rats. The data revealed that endogenous HO/CO system was upregulated during NO synthase-induced hypertension formation which might be restored by administration of HO substrate. Conclusion: It was concluded that both endogenous CO and NO were involved in regulating vascular tone, and they could be compensated each other for regulating the pathogenesis of hypertension induced by NO synthase inhibition.
, http://www.100md.com
(J Beijing Med Univ, 1999,31:520-523)
一氧化氮(nitric oxide, NO)是血管内皮细胞利用L-精氨酸产生、释放的内源性硝基扩血管剂，内皮细胞损伤可使其合成释放减少而引起血管收缩；应用左旋硝基精氨酸(NG-nitric-L-arginine, L-NNA)能诱导大鼠高血压[1，2]。继NO之后，近年来人们又发现一种新的参与细胞内信息传递的小分子气体——内源性一氧化碳(carbon monoxide, CO)，其也具有重要的血管生物学效应[3]。内源性CO主要由血红素在血红素加氧酶(heme oxygenase, HO)作用下降解过程所产生。在我们前面的工作中，应用HO活性抑制剂2,4-二甘油次卟啉锌(zinc deuteroporphyrin 2,4-bisglycol, ZnDPBG)成功地诱发大鼠高血压，并且对败血症性休克时低血压的发生有预防作用；HO底物血红素-左旋-赖氨酸盐(heme-L-lysinate, HLL)能明显地降低自发性高血压大鼠的血压[4，5]。这些资料提示NO和CO均可能参与血管舒张功能的调节；然而它们在高血压形成过程中是否存在相互作用尚不清楚，在血管张力调节中的相互关系亦未得到阐明。本实验在左旋硝基精氨酸诱导大鼠高血压模型上，观察主动脉组织HO活性和CO生成变化，以探讨内源性CO和NO在高血压发生机制中的相互作用。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 大鼠高血压模型的制备[2]
选用10周龄雄性Wistar大鼠(150～200g)18只，随机分为3组，每组6只：(1)对照组，(2)NOS抑制组，(3)NOS抑制+HLL组。第(2)组腹腔注射L-NNA(15 mg.kg-1.d-1)；第(3)组腹腔注射L-NNA(15 mg.kg-1.d-1)和HLL(15 mg.kg-1.d-1)；对照组注射等容积生理盐水；连续注射4周。喂养期间动物自由进食、进水。
1.2 大鼠血压测定
停药12 h后，用大鼠血压检测仪(Model RBP-1)检测大鼠尾动脉血压。第4周测完血压后过量麻醉处死动物，取主动脉备用。
, http://www.100md.com
1.3 主动脉平滑肌HO活性和碳氧血红蛋白(HbCO)生成测定
主动脉去除内膜和外层组织，用于以下HO活性HbCO生成的测定。HO活性测定采用Tenhunen等[6]和Morita等[7]的方法稍加改良。主要步骤有，血管组织用5倍体积冷Tris/HCl缓冲液(50 mmol.L-1, pH7.4,含250 mmol.L-1蔗糖和0.5 mmol.L-1EDTA)匀浆，匀浆液过滤后离心两次(800×g10min，13500×g20min)沉淀线粒体。上清液再离心(105000×g90min)分离微粒体。焦磷酸钠(100mmol.L-1, pH7.4)去除血红蛋白后，再用磷酸钾缓冲液(pH7.4, 含0.1mmol.L-1 EDTA)制成微粒体悬液, 使其蛋白浓度为4 g.L-1。取0.5 mg微粒体加入0.4 ml反应液中(含肝实质0.6 mg, NADP 0.8 mmol.L-1, 6-磷酸葡萄糖1 mmol.L-1和6-磷酸葡萄糖脱氢酶0.2 U),再加入10 μl0.25 mmol.L-1的血红素作底物。混匀后37℃孵育10 min，用50 μl 100g.L-1 HgCl2终止反应。在紫外分光光度计上(OD464-530)比色。HO活性单位用每毫克蛋白胆红素形成速率(pmol.h-1)表示。组织蛋白含量用考马斯亮蓝法测定。
, http://www.100md.com
主动脉组织HbCO形成测定采用Morita和Kourembanas[8]方法。根据CO与血红蛋白结合产生HbCO的原理，用HbCO的生成量代表组织CO的生成释放量。主要步骤有，将主动脉平滑肌剪成3 mm长的组织块，置于DMEM培养液中(每15mg组织含纯血红蛋白1mg) 孵育1h[37℃, 95%(体积分数)O2-5%(体积分数)CO2]。在光电血氧仪上(波长569 nm) 测定HbCO生成量。
1.4 血管组织cGMP含量的测定
血浆和主动脉平滑肌组织中cGMP含量的测定采用放免法。取血管组织称重后加入60 g.L-1三氯醋酸(0℃)制成匀浆，低温离心(2000×g,20 min), 上清液用0.2 mol.L-1乙酸缓冲液提取2次，再以无水乙醇提取3次，重复离心后，收集上清液，沉淀再用75%(体积分数)乙醇提取1次，收集每次用前的上清液，60℃氮气吹干，测定时用400 μl乙酸复溶，然后用cGMP放免药盒测定cGMP含量，以每毫克蛋白的量(μmol)表示。
, 百拇医药
1.5 主要材料和试剂
Wistar大鼠由北京医科大学动物中心提供，L-NNA，HLL，NADP，6-磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖脱氢酶等均购自Sigma公司；RBP-1型大鼠血压检测仪来自中日友好医院；WFZ800-D2型紫外分光光度计系北京第二光学仪器厂产品；cGMP放免药盒由上海中医学院提供。
1.6 统计学处理
结果用
±s表示，各组间差异比较用方差分析，P<0.05为差异有显著性。2 结果
2.1 NOS抑制剂对大鼠血压和主动脉组织HO活性和HbCO生成变化的影响
, 百拇医药
表1显示各实验组动物在给予L-NNA或同时给予L-NNA和HLL后不同时间的血压变化情况。与对照组比较，单纯注射L-NNA 2周内动物血压无明显变化，第3周血压升高，第4周血压升高达47.8%。同时注射L-NNA和HLL时，4周内动物血压无明显变化；与单纯L-NNA组相比，第3周和第4周动物血压分别降低14.7%和28.2% (均为P<0.01)。
表1 L-NNA和HLL对实验大鼠血压的影响 (
±s)Table 1 The effects of L-NNA and HLL on changes of arterial blood pressure in rats in various experimental groups (
±s)p/kPa Groups, 百拇医药
n
t/w
0
1
2
3
4
Control
6
12.3±0.7
12.3±0.4
12.3±0.6
12.4±0.8
, 百拇医药
12.5±0.6
L-NNA
6
11.9±0.6
12.3±0.9
12.7±0.5
15.0±0.7*
18.1±0.5**
L-NNA+HLL
6
12.0±0.5
11.9±0.8
, 百拇医药
12.4±0.8
12.8±0.3##
13.0±0.9**##
q=5.70, *P<0.05, q=21.54, **P<0.01, compared with control; q=8.22, 20.00, ##P<0.01, compared with L-NNA group respectively； p，blood pressure.
2.2 大鼠主动脉平滑肌组织HO活性和HbCO形成的变化
与对照组比较，单纯注射L-NNA第4周主动脉平滑肌组织HO活性和HbCO的形成分别增加28.4%和31.1%(均为P<0.01)。有趣的是，同时注射L-NNA和HLL时，HO活性和HbCO的形成增加更为明显，与单纯L-NNA组比较，HO活性和HbCO的形成分别增加22.4%和28.4% (均为P<0.01，表2)。
, 百拇医药
表2 主动脉平滑肌HO活性和HbCO形成的变化(
±s)Table 2 Changes of HO activity and HbCO formation from
vascular smooth muscle tissues in various experimental groups (
±s) Groupsn
HO activity
(pmol.mg-1△.h-1)
, http://www.100md.com
c[HbCO]
/μmol.L-1
Control
6
363±25
4.8±0.5
L-NNA
6
465±42**
6.2±0.7**
L-NNA+HLL
, 百拇医药
6
560±68**##
8.0±0.7**##
△, per mg protein; q=20.82, 10.10, 9.60, 12.31, **P<0.01, compared with control; q=7.21, 8.13, ##P<0.01, compared with L-NNA group respectively； c, concentration.
2.3 大鼠血浆和主动脉组织cGMP含量的变化
单纯注射L-NNA后4周，大鼠血浆和主动脉平滑肌组织中cGMP量比对照组分别增加58.8%和56.4%(均为P<0.01)。同时注射L-NNA和HLL时cGMP量的增加更加明显，血浆和组织cGMP量比单纯L-NNA组分别增加37.3%和51.3%(均为P<0.01，表3)。
, 百拇医药
表3 实验各组动物血浆和主动脉平滑肌组织每毫克蛋白
cGMP的量(μmol,
±s)Table 3 Contents of cGMP in plasma and vascular smooth muscle
tissues per mg protein in various experimental groups(μmol,
±s) Groupn
cGMP content
Plasma
, 百拇医药
Aorta
Control
6
4.2±0.5
0.46±0.08
L-NNA
6
6.7±0.8**
1.48±0.10**
L-NNA+HLL
6
9.2±0.6**#
, http://www.100md.com
2.24±0.11**##
q=9.98, 18.52, 25.50, 44.52, **P<0.01, compared with control; q=10.02, 20.54 #P<0.05, ##P<0.01, compared with L-NNA group.
3 讨论
本实验应用NOS抑制剂L-NNA诱导大鼠高血压，大鼠在第4周形成稳定的高血压，同时伴随HO活性和CO的产生增加；血浆和主动脉平滑肌组织中的cGMP量亦有所增加。然而令人感兴趣的是，同时加入L-NNA和HLL时，大鼠在4周内并不出现高血压，而HO的活性和CO的产生比单纯给予L-NNA的大鼠更增加，血浆和主动脉平滑肌组织中的cGMP含量也有类似变化。当同时给予NOS抑制剂L-NNA和HO的底物HLL时，由于此时的HO处于高水平状态，因而产生大量的CO，以至于在本实验4周内大鼠不出现L-NNA诱导的高血压。发生高血压同时伴HO/CO系统上调，这似乎矛盾，因为内源性CO是一种血管舒张因子。本实验认为，在慢性给予NOS抑制剂的情况下，高血压本身是一种血管损伤性因素，而HO活性的上调可能是血管平滑肌细胞对慢性损伤的一种应激反应。最近有类似的实验表明，HO上调对大鼠球囊拉伤后血管壁细胞的增殖有一定的抑制作用[9]。在动脉粥样硬化斑块形成过程中存在HO-1的表达增加[10]。HO象NOS一样具有诱导型和结构型[11]，HO-1属于诱导型，在许多因素作用下被诱导产生，包括NOS的一些诱导因子(如细菌脂多糖和细胞因子)[12]；HO-2是结构型，它属于糖皮质激素调节基因家族中的一员，并可由肾上腺皮质激素引起上调[13]。由糖皮质激素也可上调诱导型NOS活性，但下调结构型NOS。资料表明，诱导型HO (HO-1)是一种细胞应激性反应蛋白，对细胞的损伤具有一定的保护作用[14],在家兔动脉粥样硬化斑块形成中，HO-1表达上调可能是血管壁细胞对慢性刺激的适应性反应之一[15]。
, 百拇医药
内源性CO与NO一样也是一种小分子气体，两者均具有激活可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylate cyclase, sGC)的功能，后者能将GTP转化成cGMP[7]。在正常情况下很难辨别是NO还是CO对sGC的激活，除非使用HO或NOS的特异性抑制剂进行人为的控制。本实验长期应用NOS抑制剂观察到血浆和主动脉平滑肌细胞中的cGMP水平改变与HO活性和CO产生释放的变化相平行。血压增加同时伴有cGMP增多，表明内源性CO通过sGC-cGMP机制尚不足以完全代偿NOS抑制剂所导致的高血压，同时也提示sGC-cGMP机制不是调节血管舒缩状态的唯一途径。但本实验在同时加HLL时，cGMP的进一步增加却能有效地舒张血管，有利于防止高血压的发生。在NOS受到抑制时，引起血管舒张的cGMP阈值有待研究。
体外实验证实，应用NOS抑制剂对NOS活性有明显的抑制作用，但对HO活性无影响；同样地，HO抑制剂对HO活性有明显的抑制作用，但对NOS活性无影响[15]。这似乎表明NOS和HO处于相对独立状态。然而本实验结果表明，应用NOS抑制剂能引起大鼠的血管平滑肌细胞中HO活性的上调；类似的实验是应用HO-1诱导物buthionine(S,R)-sulfoximine(BSO)对2d新生大鼠腹腔注射时，2d后脑组织HO活性增加1倍，同时NOS活性减少40%[16]。这表明至少在体内NOS和HO是存在相互影响的。推测正常情况下对血管舒张的调节可能由NOS/NO系统占优势，一旦出现某些病理情况如血管内皮细胞的损伤，则HO/CO系统上调。它不仅是对慢性损伤的一种适应性反应，也可作为NOS/NO系统受损的代偿性调节。在高血压等病理情况下HO/CO系统上调的机制有待进一步阐明。
, 百拇医药
*国家自然科学基金(39730220)资助课题；
参考文献
1 Dananberg J， Sider RS, Grekin RJ. Sustained hypertension induced by orally administered nitro-L-arginine. Hypertension, 1993，21:359-363
2 高连如，赵云涛，石湘芸，等.左旋硝基精氨酸诱导大鼠持续高血压.基础医学与临床, 1995，15(3):49-53
3 Jonhson RA, Lavesa M, Askari B, et al. A heme oxygenase product, presumably carbon monoxide, mediates a vasodepressor function in rats. Hypertension, 1995，25:166-169
, 百拇医药
4 Ou HS，Yang J，Dong LW， et al.Role of endogenous carbon monoxide in hypertension pathogenesis of rats. Acta Physiol Sin, 1998， 50(6): 643-648
5 Ou HS，Yang J， Dong LW， et al. The role of endogenous carbon monoxide in hypotension pathogenesis of rats during septic shock. Acta Physiol Sin, 1999， 51(1): 1-6
6 Tenhunen R, Marver HS, Schmid R. The enzymatic catabolism of hemoglobin: Stimulation of microsomal heme oxygenase by hemin. J Lab Clin Med, 1970，75:410-420
, http://www.100md.com
7 Morita T, Perrella MA, Lee M-E, et al. Smooth muscle cell-derived carbon monoxide is a regulator of vascular cGMP. Proc Natl Acad Sci USA, 1995，92:1475-1479
8 Morita T, Kourembanas S. Endothelial cell expression of vasoconstrictors and growth factors is regulated by smooth muscle cell-derived carbon monoxide. J Clin Invest, 1995， 96:2676-2682
9 Ou HS, Yang J, Tong LJ, et al. Role of endogenous carbon monoxide in neointimal formation induced by balloon-injury in rat aortic artery. Chin Med Sci J, 1999,14(1):41-45
, http://www.100md.com
10 Wang LJ, Lee TS, Lee FY, et al. Expression of heme oxygenase-1 in atherosclerotic lesions. Am J Pathol, 1998,152(3):711-720
11 Cruse I , Maines MD. Evidence suggesting that two forms of heme oxygenase are products of different genes. J Biol Chem, 1988，263:3348-3353
12 Geller DA, Nussler AK, DiSalvio M, et al. Cytokines ,endotoxin, and glucocorticoids regulate the expression of inducible nitric oxide synthase in hepatocytes. Proc Natl Acad Sci， 1993，90:522-526
, 百拇医药
13 Weber CM, Eke BC, Maines MD. Corticosterone regulates heme oxygenase-2 and NO synthase transcription and protein experssion in rat brain. J Neurochem， 1994，63:953-962
14 Chong KY, Lai CC, Lille S, et al. Stable overexpression of the constitutive form of heat shock protein 70 confers oxidative protection. J Mol Cell Cardiol, 1998，30(3):599-608
15 Luo D, Vincent SR. Metalloporphyrins inhibit nitric oxide-dependent cGMP formation in vivo. Eur J Pharmacol, 1994，267:263-267
16 Maines MD. Carbon monoxide and nitric oxide homology: differential modulation of heme oxygenase in brain and detection of protein and activity. Methods Enzymol, 1996，268:473-488
(1998-10-09收稿), http://www.100md.com