雷公藤多甙对皮肤角朊细胞株增殖抑制及凋亡的调节作用
作者：张倩 陈学荣 白小薇 殷金珠
单位：张倩 陈学荣(北京大学第三医院皮肤科，北京 100083)；白小薇 殷金珠(基础医学院免疫学系)
关键词：雷公藤多甙；药理学；角朊细胞；凋亡；药物作用；增殖抑制
北京医科大学学报000418 [摘 要] 目的：研究雷公藤多甙(tripterygium wilfordii hook f multi-glycosides，TWG)对角朊细胞株(COLO-16)的增殖抑制及对凋亡的影响，并探讨其治疗免疫性皮肤病的机制。方法：MTT法检测细胞增殖抑制，二苯胺及PI染色法检测细胞凋亡，RT-PCR测细胞bcl-2及bcl-Xs mRNA表达。结果：TWG 0.25 mg.L-1与角朊细胞共育72 h后，角朊细胞增殖活性受抑，此抑制作用具药物(质量)浓度依赖性；TWG 1 mg.L-1作用于角朊细胞72 h，即可使片段化DNA含量及亚二倍体细胞百分数较对照明显增加,此现象随药物质量浓度增加而增高;TWG 5 mg.L-1，可上调角朊细胞bcl-Xs mRNA表达，此作用随药物作用时间延长而增强；TWG对bcl-2 mRNA表达则无明显影响。结论：TWG可抑制角朊细胞株增殖并诱导其凋亡，此诱导凋亡机制可能与bcl-Xs上调有关。
, 百拇医药
[中图分类号] R986 [文献标识码] A [文章编号] 1000-1530(2000)04-0343-04
Regulatory effects of Tripterygium wilfordii hook f multi-glycosides
on inhibiting proliferation and inducing apoptosis of keratinocytic line
ZHANG Qian
(Department of Dermotology， Peking University Third Hospital,Beijing 100083, China)
CHEN Xue-Rong
, http://www.100md.com
(Department of Dermotology， Peking University Third Hospital,Beijing 100083, China)
BAI Xiao-Wei
(Department of Immunology, Peking University School of Basic Medical Sciences)
YIN Jin-Zhu
(Department of Immunology, Peking University School of Basic Medical Sciences)
ABSTRACT Objective:
To investigate the effect of tripterygium wilfordii hook f multi-glycosides(TWG) on proliferation and apoptosis of COLO-16 cells. Methods: Cell proliferation was measured using the MTT method; apoptosis was determined by DNA fragmentation and PI staining for Flow Cytometry assay; RT-PCR was used to evaluate the expression of bcl-Xs and bcl-2 mRNA. Results: Treatment of COLO-16 cells with TWG resulted in (1) significant inhibition of proliferation in a dose-dependent manner, (2) The DNA fragmentation and hypodiploid cell formation, (3) Up-regulation of bcl-Xs mRNA.Conclusion: TWG induced apoptosis and inhibited the proliferation of COLO-16 cells. TWG might achieve this effect by up-regulation the bcl-X genes.
, http://www.100md.com
KEY WORDS Tript wilf polyglycosidum/pharmacol; Keratinocytic； Apoptosis/drug eff; Proliferation
(J Beijing Med Univ, 2000,32:343-346)
雷公藤多甙作为一种免疫抑制剂，在皮肤科多用于结缔组织病及银屑病等与免疫相关的疾病治疗，雷公藤的提取物——雷公藤内酯醇已制成软膏外用治疗银屑病，并取得良好的疗效。至于雷公藤作用机制，研究较多的是其对外周血淋巴细胞的增殖抑制及抑制细胞因子的产生和分泌，如一些体外实验发现雷公藤制剂可抑制活化的人外周血T、B淋巴细胞增殖，降低IL-2、IL-4及Ig的产生[1～4];雷公藤内酯醇及T2能诱导活化T细胞及人肥大细胞白血病细胞系HMC-1凋亡[3，5，6]。
研究表明，角朊细胞在维持皮肤免疫自稳中有重要作用[7]，如果角朊细胞的增殖、分化及凋亡的平衡失调则可导致皮肤病。如常见的皮肤病——银屑病，作为一种免疫性疾病，其免疫发病机制可能为抗原呈递细胞将抗原呈递给表皮内的CD4 T细胞，启动疾病；活化的CD4 T细胞释放细胞因子，直接刺激角朊细胞增生及诱导角朊细胞活化并分泌细胞因子及表达粘附分子；然后角朊细胞通过自泌作用及与T细胞的细胞因子的旁泌作用，进一步促进角朊细胞不断增生，使此过程周而复始。
, http://www.100md.com
雷公藤制剂内服及外用治疗皮肤病时，除具有对活化的外周血淋巴细胞产生免疫抑制及诱导凋亡的作用，是否尚具有直接抑制角朊细胞增殖，并诱导其凋亡的作用机制，本文拟对此进行探讨。
1 材料与方法
1.1 药品
雷公藤多甙(TWG，湖南株洲制药三厂生产)由我校实验药厂从片剂中提取有效成分，DMSO助溶，60Co照射灭菌，实验前用培养基分别配制成所需浓度。
1.2 试剂及仪器
1.2.1 试剂 RPMI-1640培养基(GIBCO公司)；MTT(噻唑篮)及PI(碘化丙啶)(Sigma公司)；Trizol(RNA提取剂)(北京京师生物工程技术公司)；dNTPs，DTT，RNA酶抑制剂，AMV-RT及Taq酶(Promega公司)；二苯胺试剂(中国上海南翔试剂厂)；以下引物由美国Cybersyn公司合成。
, http://www.100md.com
人bcl-2引物(219bp)：
5′GGAACTGTACGGCCCCAGCATGCG3′
5′TGCAGCTTTGTTTCATGGTAGATC3′
人bcl-Xs引物(151bp)：
5′CGGGCATTCAGTGACCTGAC3′
5′TCAGGAACCAGCGGTTGAAG3′
人(-actin引物(548bp)：
5′GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3′
5′CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3′
, http://www.100md.com
1.2.2 仪器 450型ELISA-RADER仪(Bio-Rad公司)，FACScan流式细胞计(美国Becto-Dickinson 公司)，ThermojeT PCR仪(EquiBio公司)，数字化凝胶成像分析仪(天津市帝格科技公司)，DU-640(BECKMAN公司)。
1.3 细胞株及细胞培养
角朊细胞株COLO16(我校免疫学系保存)培养于含10%(体积分数)灭活小牛血清的完全RPMI-1640培养基中；置5%(体积分数)CO2孵箱，37℃。
1.4 MTT法测细胞增殖[8，9]
角朊细胞1×105 ml-1加96孔平板，每孔200 μl，培养18～24 h，半量更换培养液后加药，以溶媒做对照，对照及终(质量)浓度为0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10、50、100 mg.L-1的TWG各设三复孔，继续培养72 h；实验结束前4 h弃去培养液，加MTT，37℃继续孵育4 h，弃去MTT，加DMSO，室温振荡0.5 h，ELISA-RADER仪读取波长595 nm光密度(D)；D与活细胞数成正比。
, 百拇医药
1.5 TWG对角朊细胞凋亡的影响
角朊细胞以每瓶1×106，培养在50 ml培养瓶中18～24 h，更换培养液，每瓶10 ml，同时加药并以其溶媒做对照。
细胞片段化DNA百分含量测定[10]：对照及加入终(质量)浓度为1、2.5、5 mg.L-1的TWG，培养72 h，消化细胞，加400 μl细胞溶解液，4℃，30 min；离心13 000×g，10min；上清中含片段化DNA，沉淀为完整的高相对分子质量DNA。于200 μl沉淀及200 μl上清中分别加入400 μl二苯胺试剂30℃，20 h；取200 μl加96孔平底细胞培养板，用酶标仪测590 nm光吸收值(D)。片段化DNA百分含量=2×D上清/(2×D上清+D沉淀)×100%
, 百拇医药
流式细胞仪分析亚二倍体细胞含量：对照及加入终(质量)浓度为1、2.5、5 mg.L-1的TWG加入，培养72 h，消化细胞，离心1000×g，10 min，弃上清，悬于1 ml PI染液4℃过夜；上机前过200目尼龙网，去除细胞团块，然后上FACScan分析(104细胞中)亚二倍体细胞含量。
RT-PCR方法测TWG作用后角朊细胞bcl-2及bcl-Xs mRNA表达：加入终(质量)浓度为5 mg.L-1的TWG，培养24、48、72 h；0 h为未加药正常对照。按Trizol试剂盒所示方法提取细胞总RNA，并在DU-640仪上测定RNA浓度，然后进行RT-PCR；实验中设无RNA成分阴性对照，设β-actin引物同步扩增；扩增产物用20 g.L-1琼脂糖凝胶(含0.5 mg.L-1EB)电泳，于紫外检测仪及数字化凝胶成像分析仪上观察并测电泳条带灰度值(IOD)作为半定量指标，用β-actin校准。
, 百拇医药
1.6 统计
EXCEL软件做t检验。
2 结果
2.1 TWG对COLO-16细胞增殖抑制作用
TWG为0.1 mg.L-1时，其D高于对照(P>0.05)；TWG质量浓度≥0.25 mg.L-1后，随TWG质量浓度增高，D降低，提示其抑制细胞增殖的能力随药物质量浓度增加而增加；TWG为0.25 mg.L-1时，P<0.01；质量浓度≥0.5mg.L-1以后，P<0.001。
2.2 TWG对COLO-16细胞凋亡的影响
, 百拇医药
片段化DNA含量的测定(表1)：TWG在1 mg.L-1时，片段化DNA含量即高于对照(P<0.05)，且随药物浓度的增加，片段化DNA含量亦增加，提示TWG诱导细胞凋亡的能力随药物(质量)浓度的增加而增加。TWG为5mg.L-1时，P<0.001。
表1 二苯胺法及PI染色检测雷公藤多甙对
角朊细胞株诱导凋亡作用
Table 1 Percentage of DNA fragmention and hypodiploid
of keratinocyte cell induced by TWG ρ(TWG)/
(mg.L-1)
, 百拇医药
DNA fragmention
(%)
Hypodiploid cell
(%)
Control
15.3±3.0
21.4±1.7
1
17.1±2.2*
25.3±1.8*
2.5
, 百拇医药 20.4±3.0**
30.0±1.6**
5
33.6±5.4**
37.4±2.3**
n=5, * P<0.05, ** P<0.001 vs control. 流式细胞仪分析亚二倍体细胞含量(表1，图1)：TWG在1 mg.L-1时，亚二倍体细胞含量即高于对照(P<0.05)，且随药物质量浓度的增加，亚二倍体细胞含量亦增加，提示TWG诱导细胞凋亡的能力随药物质量浓度的增加而增加；TWG为5 mg.L-1时，P<0.001。
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A， control； B， TWG(1 μg.ml-2) 72h;
C, TWG(2.5 mg.L-1)； D， TWG(5 mg.L-1) 72 h.
图1 PI染色测TWG诱导的亚二倍细胞百分数
Figure 1 Percentage of hypodiploid cell of Colo-16 induced by TWG
TWG(5 mg.L-1)作用于角朊细胞不同时间，对bcl-2及bcl-Xs mRNA表达的影响(表2，图2)：未加药及加药24、48及72 h，角朊细胞bcl-2 mRNA的灰度值均无大变化；而bcl-Xs mRNA表达则随药物作用时间延长而逐渐加强。
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表2 RT-PCR法测雷公藤多甙对角朊细胞株COLO-16 bcl-2及bcl-Xs mRNA表达的影响
Table 2 The effect of TWG on expression of bcl-2 and bcl-Xs mRNA
in COLO-16 cells—the result of RT-PCR (IOD value) TWG(5 mg.L-1)
β-actin
IOD
Bcl-2
Bcl-Xs
IOD
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Relative value
IOD
Relative value
Normal control
15 863
466.9
0.029
669.21
0.042
24 h
32 475
738.9
, 百拇医药
0.022
8 140.1
0.251
48 h
24 850
629.3
0.025
10 225
0.411
72 h
30 951
917.5
0.030
, 百拇医药
13 244
0.428
IOD， integrated optical density.
1, marker; 2, TWG,24 h; 3, TWG,48 h; 4, TWG,72 h;
5, normal control; 6, negative control.
图2 TWG(5 mg.L-1)对角朊细胞bcl-Xs及bcl-2 mRNA表达的影响
Figure 2 Expression of bcl-Xs and bcl-2 mRNA affected by TWG(5 mg.L-1)
, 百拇医药
3 讨论
免疫抑制剂雷公藤多甙由于全身用药的副作用常限制其用药范围，针对皮肤病的特点及角朊细胞在皮肤免疫生理及病理中的作用，若能应用药物直接作用于角朊细胞,既可避免全身用药的副作用，又可达到治疗效应。
本文通过MTT实验证实：TWG具抑制角朊细胞增殖的能力，此抑制作用具药物(质量)浓度依赖性；而由二苯胺法及PI染色法显示：TWG具诱导角朊细胞凋亡的能力，且凋亡细胞百分率随药物(质量)浓度的增加而递增；进一步研究此药诱导细胞凋亡的机制时发现：TWG为5 mg.L-1，24、48及72 h，角朊细胞株bcl-Xs mRNA表达则随药物作用时间延长而逐渐加强；此结果与TWG引起的细胞片段化DNA增多及亚二倍体细胞百分率增加相平行；提示TWG可能通过上调促凋亡基因 bcl-Xs 而产生诱导角朊细胞凋亡的作用。
TWG抑制角朊细胞增殖的细胞内生化过程，尚待近一步研究。但可推断角朊细胞增殖受抑则将影响其细胞因子的产生，膜表面分子的表达等功能，此必将直接影响疾病的发生和发展。
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在生理条件下表皮角朊细胞维持自稳，需要细胞增殖、分化及死亡之间的平衡调节。因此，角朊细胞凋亡是机体表皮正常生理活动之一，一旦角朊细胞出现凋亡异常(过度或不足)即可引起各种疾病，包括免疫性皮肤病及皮肤肿瘤，如银屑病、皮肤鳞状细胞癌等。调节皮肤免疫细胞凋亡已成为免疫性皮肤病治疗的研究热点之一。本实验研究发现TWG可能上调促凋亡基因bcl-Xs，诱导角朊细胞凋亡。bcl-Xs是bcl-2基因家族的成员，因缺少某个bcl-2蛋白家族共有的保守肽段而成为促凋亡因子。
雷公藤制剂所产生的抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡的作用之间是否有联系，国外在研究雷公藤制剂对T细胞增殖抑制及诱导凋亡之间的关系时，有人认为此类药诱导的生长抑制不是源于细胞凋亡，因为在bcl-2转染细胞，药物不能诱导DNA片段化，但可抑制DNA复制及抑制活化诱导的IL-2的产生[11]；有人认为此药在非细胞毒性剂量下可能通过PKC及钙依赖的信号通路产生生长抑制，而在细胞毒性剂量时，则通过诱导凋亡而产生抑制增殖作用[3]。总之，本实验发现TWG可直接抑制角朊细胞增殖，并在一定浓度下可诱导其凋亡，本实验结果为临床上雷公藤制剂内用及外用治疗皮肤病又提供一理论依据。
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(我校实验药厂舒永华教授提取雷公藤多甙，特此致谢)
参考文献
1，Tao XL, Davis LS, Lipsky PE. Effect of an extract of the Chinese herbal remedy Tripterygium wilfordii Hook F on human immune responsiveness[J]. Arthritis Rheum, 1991 ,34(10):1274-1281
2，邵静芳，朱慧芬，张悦，等. 雷公藤甲素对正常人细胞免疫功能的影响[J]. 免疫学杂志, 1994,10(3):162-164
3，Ho LJ, Chang DM, Chang ML， et al. Mechanism of immunosup-pression of the antirheumatic Herb TWHf in human T cells[J]. J Rheumatol ,1999,26(1):14-24
, http://www.100md.com
4，Chang DM, Chang WY, Kuo SY， et al. The effects of traditional antirheumatic herbal medicines on immune response cells[J]. J Rheumatol , 1997,24(3):436-41
5，杨俊伟，陈朝红，刘 栋，等. 雷公藤内酯醇通过细胞凋亡阻止人T细胞增殖[J]. 肾脏病与透析移植杂志, 1997,6(3):205-209
6，鲍一笑，余润泉，张登海，等. 雷公藤红素对人肥大细胞白学病细胞系HMC-1作用的实验研究[J]. 中华血液学杂志, 1999,20(3):146-148
7，王 刚.角朊细胞免疫学研究进展[A]. 见:张学军，刘维达，秦建中主编. 现代皮肤性病学进展[M].合肥:安徽科学技术出版社，1997,1-9
, 百拇医药
8，李翠玲，崔正言，李淑贞. MTT比色分析法的改良及初步应用[J].上海免疫学杂志，1996,16(5):306-309
9，Marionnet AV, Lizard G, Chignol MC， et al. Differences in reactivity to cyclosporin A and interferon-gamma of normal and HPV-transformed keratinocytes[J]. Anticancer Res, 1996,16:257-268
10，Illere VA, Perandones CE, Stunz LL, et al. Apoptosis in splenic B lymphocytes: regulation by protein kinase C and IL-4[J]. J Immunol, 1993, 151:2965
11，Yang LL, Liu ZH, Tolosa E， et al. Triptolide induces apoptotic death of T lymphocyte[J]. Immunopharmacology, 1998,40:139-149
(2000-03-31收稿), http://www.100md.com
单位：张倩 陈学荣(北京大学第三医院皮肤科，北京 100083)；白小薇 殷金珠(基础医学院免疫学系)
关键词：雷公藤多甙；药理学；角朊细胞；凋亡；药物作用；增殖抑制
北京医科大学学报000418 [摘 要] 目的：研究雷公藤多甙(tripterygium wilfordii hook f multi-glycosides，TWG)对角朊细胞株(COLO-16)的增殖抑制及对凋亡的影响，并探讨其治疗免疫性皮肤病的机制。方法：MTT法检测细胞增殖抑制，二苯胺及PI染色法检测细胞凋亡，RT-PCR测细胞bcl-2及bcl-Xs mRNA表达。结果：TWG 0.25 mg.L-1与角朊细胞共育72 h后，角朊细胞增殖活性受抑，此抑制作用具药物(质量)浓度依赖性；TWG 1 mg.L-1作用于角朊细胞72 h，即可使片段化DNA含量及亚二倍体细胞百分数较对照明显增加,此现象随药物质量浓度增加而增高;TWG 5 mg.L-1，可上调角朊细胞bcl-Xs mRNA表达，此作用随药物作用时间延长而增强；TWG对bcl-2 mRNA表达则无明显影响。结论：TWG可抑制角朊细胞株增殖并诱导其凋亡，此诱导凋亡机制可能与bcl-Xs上调有关。
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[中图分类号] R986 [文献标识码] A [文章编号] 1000-1530(2000)04-0343-04
Regulatory effects of Tripterygium wilfordii hook f multi-glycosides
on inhibiting proliferation and inducing apoptosis of keratinocytic line
ZHANG Qian
(Department of Dermotology， Peking University Third Hospital,Beijing 100083, China)
CHEN Xue-Rong
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(Department of Dermotology， Peking University Third Hospital,Beijing 100083, China)
BAI Xiao-Wei
(Department of Immunology, Peking University School of Basic Medical Sciences)
YIN Jin-Zhu
(Department of Immunology, Peking University School of Basic Medical Sciences)
ABSTRACT Objective:
To investigate the effect of tripterygium wilfordii hook f multi-glycosides(TWG) on proliferation and apoptosis of COLO-16 cells. Methods: Cell proliferation was measured using the MTT method; apoptosis was determined by DNA fragmentation and PI staining for Flow Cytometry assay; RT-PCR was used to evaluate the expression of bcl-Xs and bcl-2 mRNA. Results: Treatment of COLO-16 cells with TWG resulted in (1) significant inhibition of proliferation in a dose-dependent manner, (2) The DNA fragmentation and hypodiploid cell formation, (3) Up-regulation of bcl-Xs mRNA.Conclusion: TWG induced apoptosis and inhibited the proliferation of COLO-16 cells. TWG might achieve this effect by up-regulation the bcl-X genes.
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KEY WORDS Tript wilf polyglycosidum/pharmacol; Keratinocytic； Apoptosis/drug eff; Proliferation
(J Beijing Med Univ, 2000,32:343-346)
雷公藤多甙作为一种免疫抑制剂，在皮肤科多用于结缔组织病及银屑病等与免疫相关的疾病治疗，雷公藤的提取物——雷公藤内酯醇已制成软膏外用治疗银屑病，并取得良好的疗效。至于雷公藤作用机制，研究较多的是其对外周血淋巴细胞的增殖抑制及抑制细胞因子的产生和分泌，如一些体外实验发现雷公藤制剂可抑制活化的人外周血T、B淋巴细胞增殖，降低IL-2、IL-4及Ig的产生[1～4];雷公藤内酯醇及T2能诱导活化T细胞及人肥大细胞白血病细胞系HMC-1凋亡[3，5，6]。
研究表明，角朊细胞在维持皮肤免疫自稳中有重要作用[7]，如果角朊细胞的增殖、分化及凋亡的平衡失调则可导致皮肤病。如常见的皮肤病——银屑病，作为一种免疫性疾病，其免疫发病机制可能为抗原呈递细胞将抗原呈递给表皮内的CD4 T细胞，启动疾病；活化的CD4 T细胞释放细胞因子，直接刺激角朊细胞增生及诱导角朊细胞活化并分泌细胞因子及表达粘附分子；然后角朊细胞通过自泌作用及与T细胞的细胞因子的旁泌作用，进一步促进角朊细胞不断增生，使此过程周而复始。
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雷公藤制剂内服及外用治疗皮肤病时，除具有对活化的外周血淋巴细胞产生免疫抑制及诱导凋亡的作用，是否尚具有直接抑制角朊细胞增殖，并诱导其凋亡的作用机制，本文拟对此进行探讨。
1 材料与方法
1.1 药品
雷公藤多甙(TWG，湖南株洲制药三厂生产)由我校实验药厂从片剂中提取有效成分，DMSO助溶，60Co照射灭菌，实验前用培养基分别配制成所需浓度。
1.2 试剂及仪器
1.2.1 试剂 RPMI-1640培养基(GIBCO公司)；MTT(噻唑篮)及PI(碘化丙啶)(Sigma公司)；Trizol(RNA提取剂)(北京京师生物工程技术公司)；dNTPs，DTT，RNA酶抑制剂，AMV-RT及Taq酶(Promega公司)；二苯胺试剂(中国上海南翔试剂厂)；以下引物由美国Cybersyn公司合成。
, http://www.100md.com
人bcl-2引物(219bp)：
5′GGAACTGTACGGCCCCAGCATGCG3′
5′TGCAGCTTTGTTTCATGGTAGATC3′
人bcl-Xs引物(151bp)：
5′CGGGCATTCAGTGACCTGAC3′
5′TCAGGAACCAGCGGTTGAAG3′
人(-actin引物(548bp)：
5′GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3′
5′CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3′
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1.2.2 仪器 450型ELISA-RADER仪(Bio-Rad公司)，FACScan流式细胞计(美国Becto-Dickinson 公司)，ThermojeT PCR仪(EquiBio公司)，数字化凝胶成像分析仪(天津市帝格科技公司)，DU-640(BECKMAN公司)。
1.3 细胞株及细胞培养
角朊细胞株COLO16(我校免疫学系保存)培养于含10%(体积分数)灭活小牛血清的完全RPMI-1640培养基中；置5%(体积分数)CO2孵箱，37℃。
1.4 MTT法测细胞增殖[8，9]
角朊细胞1×105 ml-1加96孔平板，每孔200 μl，培养18～24 h，半量更换培养液后加药，以溶媒做对照，对照及终(质量)浓度为0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10、50、100 mg.L-1的TWG各设三复孔，继续培养72 h；实验结束前4 h弃去培养液，加MTT，37℃继续孵育4 h，弃去MTT，加DMSO，室温振荡0.5 h，ELISA-RADER仪读取波长595 nm光密度(D)；D与活细胞数成正比。
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1.5 TWG对角朊细胞凋亡的影响
角朊细胞以每瓶1×106，培养在50 ml培养瓶中18～24 h，更换培养液，每瓶10 ml，同时加药并以其溶媒做对照。
细胞片段化DNA百分含量测定[10]：对照及加入终(质量)浓度为1、2.5、5 mg.L-1的TWG，培养72 h，消化细胞，加400 μl细胞溶解液，4℃，30 min；离心13 000×g，10min；上清中含片段化DNA，沉淀为完整的高相对分子质量DNA。于200 μl沉淀及200 μl上清中分别加入400 μl二苯胺试剂30℃，20 h；取200 μl加96孔平底细胞培养板，用酶标仪测590 nm光吸收值(D)。片段化DNA百分含量=2×D上清/(2×D上清+D沉淀)×100%
, 百拇医药
流式细胞仪分析亚二倍体细胞含量：对照及加入终(质量)浓度为1、2.5、5 mg.L-1的TWG加入，培养72 h，消化细胞，离心1000×g，10 min，弃上清，悬于1 ml PI染液4℃过夜；上机前过200目尼龙网，去除细胞团块，然后上FACScan分析(104细胞中)亚二倍体细胞含量。
RT-PCR方法测TWG作用后角朊细胞bcl-2及bcl-Xs mRNA表达：加入终(质量)浓度为5 mg.L-1的TWG，培养24、48、72 h；0 h为未加药正常对照。按Trizol试剂盒所示方法提取细胞总RNA，并在DU-640仪上测定RNA浓度，然后进行RT-PCR；实验中设无RNA成分阴性对照，设β-actin引物同步扩增；扩增产物用20 g.L-1琼脂糖凝胶(含0.5 mg.L-1EB)电泳，于紫外检测仪及数字化凝胶成像分析仪上观察并测电泳条带灰度值(IOD)作为半定量指标，用β-actin校准。
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1.6 统计
EXCEL软件做t检验。
2 结果
2.1 TWG对COLO-16细胞增殖抑制作用
TWG为0.1 mg.L-1时，其D高于对照(P>0.05)；TWG质量浓度≥0.25 mg.L-1后，随TWG质量浓度增高，D降低，提示其抑制细胞增殖的能力随药物质量浓度增加而增加；TWG为0.25 mg.L-1时，P<0.01；质量浓度≥0.5mg.L-1以后，P<0.001。
2.2 TWG对COLO-16细胞凋亡的影响
, 百拇医药
片段化DNA含量的测定(表1)：TWG在1 mg.L-1时，片段化DNA含量即高于对照(P<0.05)，且随药物浓度的增加，片段化DNA含量亦增加，提示TWG诱导细胞凋亡的能力随药物(质量)浓度的增加而增加。TWG为5mg.L-1时，P<0.001。
表1 二苯胺法及PI染色检测雷公藤多甙对
角朊细胞株诱导凋亡作用
Table 1 Percentage of DNA fragmention and hypodiploid
of keratinocyte cell induced by TWG ρ(TWG)/
(mg.L-1)
, 百拇医药
DNA fragmention
(%)
Hypodiploid cell
(%)
Control
15.3±3.0
21.4±1.7
1
17.1±2.2*
25.3±1.8*
2.5
, 百拇医药 20.4±3.0**
30.0±1.6**
5
33.6±5.4**
37.4±2.3**
n=5, * P<0.05, ** P<0.001 vs control. 流式细胞仪分析亚二倍体细胞含量(表1，图1)：TWG在1 mg.L-1时，亚二倍体细胞含量即高于对照(P<0.05)，且随药物质量浓度的增加，亚二倍体细胞含量亦增加，提示TWG诱导细胞凋亡的能力随药物质量浓度的增加而增加；TWG为5 mg.L-1时，P<0.001。
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A， control； B， TWG(1 μg.ml-2) 72h;
C, TWG(2.5 mg.L-1)； D， TWG(5 mg.L-1) 72 h.
图1 PI染色测TWG诱导的亚二倍细胞百分数
Figure 1 Percentage of hypodiploid cell of Colo-16 induced by TWG
TWG(5 mg.L-1)作用于角朊细胞不同时间，对bcl-2及bcl-Xs mRNA表达的影响(表2，图2)：未加药及加药24、48及72 h，角朊细胞bcl-2 mRNA的灰度值均无大变化；而bcl-Xs mRNA表达则随药物作用时间延长而逐渐加强。
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表2 RT-PCR法测雷公藤多甙对角朊细胞株COLO-16 bcl-2及bcl-Xs mRNA表达的影响
Table 2 The effect of TWG on expression of bcl-2 and bcl-Xs mRNA
in COLO-16 cells—the result of RT-PCR (IOD value) TWG(5 mg.L-1)
β-actin
IOD
Bcl-2
Bcl-Xs
IOD
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Relative value
IOD
Relative value
Normal control
15 863
466.9
0.029
669.21
0.042
24 h
32 475
738.9
, 百拇医药
0.022
8 140.1
0.251
48 h
24 850
629.3
0.025
10 225
0.411
72 h
30 951
917.5
0.030
, 百拇医药
13 244
0.428
IOD， integrated optical density.
1, marker; 2, TWG,24 h; 3, TWG,48 h; 4, TWG,72 h;
5, normal control; 6, negative control.
图2 TWG(5 mg.L-1)对角朊细胞bcl-Xs及bcl-2 mRNA表达的影响
Figure 2 Expression of bcl-Xs and bcl-2 mRNA affected by TWG(5 mg.L-1)
, 百拇医药
3 讨论
免疫抑制剂雷公藤多甙由于全身用药的副作用常限制其用药范围，针对皮肤病的特点及角朊细胞在皮肤免疫生理及病理中的作用，若能应用药物直接作用于角朊细胞,既可避免全身用药的副作用，又可达到治疗效应。
本文通过MTT实验证实：TWG具抑制角朊细胞增殖的能力，此抑制作用具药物(质量)浓度依赖性；而由二苯胺法及PI染色法显示：TWG具诱导角朊细胞凋亡的能力，且凋亡细胞百分率随药物(质量)浓度的增加而递增；进一步研究此药诱导细胞凋亡的机制时发现：TWG为5 mg.L-1，24、48及72 h，角朊细胞株bcl-Xs mRNA表达则随药物作用时间延长而逐渐加强；此结果与TWG引起的细胞片段化DNA增多及亚二倍体细胞百分率增加相平行；提示TWG可能通过上调促凋亡基因 bcl-Xs 而产生诱导角朊细胞凋亡的作用。
TWG抑制角朊细胞增殖的细胞内生化过程，尚待近一步研究。但可推断角朊细胞增殖受抑则将影响其细胞因子的产生，膜表面分子的表达等功能，此必将直接影响疾病的发生和发展。
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在生理条件下表皮角朊细胞维持自稳，需要细胞增殖、分化及死亡之间的平衡调节。因此，角朊细胞凋亡是机体表皮正常生理活动之一，一旦角朊细胞出现凋亡异常(过度或不足)即可引起各种疾病，包括免疫性皮肤病及皮肤肿瘤，如银屑病、皮肤鳞状细胞癌等。调节皮肤免疫细胞凋亡已成为免疫性皮肤病治疗的研究热点之一。本实验研究发现TWG可能上调促凋亡基因bcl-Xs，诱导角朊细胞凋亡。bcl-Xs是bcl-2基因家族的成员，因缺少某个bcl-2蛋白家族共有的保守肽段而成为促凋亡因子。
雷公藤制剂所产生的抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡的作用之间是否有联系，国外在研究雷公藤制剂对T细胞增殖抑制及诱导凋亡之间的关系时，有人认为此类药诱导的生长抑制不是源于细胞凋亡，因为在bcl-2转染细胞，药物不能诱导DNA片段化，但可抑制DNA复制及抑制活化诱导的IL-2的产生[11]；有人认为此药在非细胞毒性剂量下可能通过PKC及钙依赖的信号通路产生生长抑制，而在细胞毒性剂量时，则通过诱导凋亡而产生抑制增殖作用[3]。总之，本实验发现TWG可直接抑制角朊细胞增殖，并在一定浓度下可诱导其凋亡，本实验结果为临床上雷公藤制剂内用及外用治疗皮肤病又提供一理论依据。
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(我校实验药厂舒永华教授提取雷公藤多甙，特此致谢)
参考文献
1，Tao XL, Davis LS, Lipsky PE. Effect of an extract of the Chinese herbal remedy Tripterygium wilfordii Hook F on human immune responsiveness[J]. Arthritis Rheum, 1991 ,34(10):1274-1281
2，邵静芳，朱慧芬，张悦，等. 雷公藤甲素对正常人细胞免疫功能的影响[J]. 免疫学杂志, 1994,10(3):162-164
3，Ho LJ, Chang DM, Chang ML， et al. Mechanism of immunosup-pression of the antirheumatic Herb TWHf in human T cells[J]. J Rheumatol ,1999,26(1):14-24
, http://www.100md.com
4，Chang DM, Chang WY, Kuo SY， et al. The effects of traditional antirheumatic herbal medicines on immune response cells[J]. J Rheumatol , 1997,24(3):436-41
5，杨俊伟，陈朝红，刘 栋，等. 雷公藤内酯醇通过细胞凋亡阻止人T细胞增殖[J]. 肾脏病与透析移植杂志, 1997,6(3):205-209
6，鲍一笑，余润泉，张登海，等. 雷公藤红素对人肥大细胞白学病细胞系HMC-1作用的实验研究[J]. 中华血液学杂志, 1999,20(3):146-148
7，王 刚.角朊细胞免疫学研究进展[A]. 见:张学军，刘维达，秦建中主编. 现代皮肤性病学进展[M].合肥:安徽科学技术出版社，1997,1-9
, 百拇医药
8，李翠玲，崔正言，李淑贞. MTT比色分析法的改良及初步应用[J].上海免疫学杂志，1996,16(5):306-309
9，Marionnet AV, Lizard G, Chignol MC， et al. Differences in reactivity to cyclosporin A and interferon-gamma of normal and HPV-transformed keratinocytes[J]. Anticancer Res, 1996,16:257-268
10，Illere VA, Perandones CE, Stunz LL, et al. Apoptosis in splenic B lymphocytes: regulation by protein kinase C and IL-4[J]. J Immunol, 1993, 151:2965
11，Yang LL, Liu ZH, Tolosa E， et al. Triptolide induces apoptotic death of T lymphocyte[J]. Immunopharmacology, 1998,40:139-149
(2000-03-31收稿), http://www.100md.com