降钙素基因相关肽与银屑病Langerhans细胞的相关性
作者：何焱玲 丁桂凤 张波 邓玉兰 王宪 朱铁君 范少光
单位：何焱玲 朱铁君(北京大学人民医院皮肤科，北京 100044)；丁桂凤(北京大学基础医学院免疫学系)；张波(北京大学病理学系)；邓玉兰(北京大学基础医学院免疫学系)；王宪 范少光(北京大学生理学系)
关键词：银屑病；郎格汉斯细胞；降钙素基因相关肽；RNA；信使；代谢
北京医科大学学报000408 [摘 要] 目的：探讨神经递质降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP) 与银屑病皮损Langerhans细胞的相关性，研究银屑病的发病机制。方法：抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物法确定CGRP的靶细胞，用双相间接免疫荧光染色法，把CD1a单克隆抗体和CGRP抗体作用于寻常型银屑病斑块型皮损同一切片，用PE-αM IgG和FITC-αR IgG 抗体显示，通过激光扫描共焦显微镜观察，并利用RNA探针原位杂交技术，研究表皮树枝状细胞CGRP的来源。结果：免疫组化染色银屑病皮损显示CGRP阳性表皮树枝状细胞，经双相免疫荧光染色及激光扫描断层光切，可见CGRP存在于银屑病皮损表皮CD1a+ Langerhans细胞膜表面，Langerhans细胞内有CGRPmRNA的表达。结论：寻常型银屑病斑块型皮损表皮Langerhans细胞与神经肽CGRP密切接触，同时Langerhans细胞内有CGRPmRNA的表达。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R758.63 [文献标识码] A [文章编号] 1000-1530(2000)04-0313-03
Study on the relationship between calcitonin gene-related peptide
and Langerhans cells in psoriatic lesions
HE Yan-Ling
(Department of Dermatology, Peking University People's Hospital, Beijing 100044, China)
DING Gui-Feng
(Department of Immunology)
, http://www.100md.com
ZHANG Bo
(Department of Pathonogy)
DEN Yiu-Lan
(Department of Immunology)
WANG Xian
(Department of Physiology， Peking University School of Basic Medical Sciences)
ZHU Tie-Jun
(Department of Dermatology, Peking University People's Hospital, Beijing 100044, China)
, http://www.100md.com
FAN Shao-Guang
(Department of Physiology， Peking University School of Basic Medical Sciences)
ABSTRACT Objective:
To investigate the relationship between Langerhans cells and calcitonin gene-related peptide(CGRP). Methods: Immunohistochemistry was used to determine CGRP expression in cells. Double immunofluorenscence staining was used for staining the section of psoriatic lesion. Confocal laser microscope was emplayed to examine the psoriatic epidermal. The source of CGRP on the dendritic cell was studied by RNA probe of CGRP in situ hybridization. Results: CGRP existed on the surface of CD1a+ epidermal Langerhans cells in psoriatic lesions. Expression of CGRP mRNA in the Langerhans cells was also detected. Conclusion: The epidermal Langerhans cells of the psoriatic plague lesion contacted closely with neuropeptide CGRP. Langerhans cells expressed CGRP mRNA.
, http://www.100md.com
KEY WORDS Psoriasis； Langerhans cells; Calcitonin gene-related peptide; RNA, messenger/metab
(J Beijing Med Univ, 2000,32:313-315)
为了进一步研究银屑病的发病机制，探讨神经肽与神经免疫调节在银屑病发病中的作用，本实验应用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物法免疫组织化学染色，双相间接免疫荧光染色及激光共聚焦扫描观察，同时利用RNA探针原位杂交技术，研究降钙素基因相关肽与寻常型银屑病患者斑块型皮损病变的相关性，获得了有意义的结果。
1 材料与方法
1.1 材料
病例：寻常型银屑病12例(经临床和组织病理确诊)，男8例，女4例，年龄22～65岁，病程2～32年。取背及四肢伸侧肥厚斑块型皮损。并以8名正常人的皮肤组织作对照。 试剂与仪器：hCGRP抗体(由我校生理学系王宪教授惠赠)；ABC免疫组化试剂盒(购自中山生物试剂公司)；鼠抗人CD1a mAb (NA 1/34,IgG2a, 丹麦DAKD公司)，PE标记抗鼠IgG抗体(PE-αM IgG抗体，我系)，FITC标记抗兔IgG抗体(FITC-αR IgG抗体，军事医学科学院)。
, 百拇医药
CGRPcDNA质粒pBKSII-Exon 5 (由我校生理学系王宪教授惠赠)，限制性内切酶XhoI(宝泰克公司)，地高辛标记NTP (Dig-NTP)，抗地高辛-AP(抗Dig-AP)和NBT-BCIP(德国宝灵曼公司)，T7和T3 RNA聚合酶(GIBco公司)，内切酶XbaI (鼎国生物公司)，杂交液 (ssDNA、DTT、Denhardt、SSC、0.1g.L-1 Dextran Sulfate、甲酰胺 )。激光扫描共焦显微镜 (TCSNT型、德国Leica公司)，DMRIXA显微镜和荧光显微镜(德国Leica公司)。
1.2 方法
1.2.1 抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物法免疫组织化学染色 取斑块型皮损组织及正常对照组织，常规固定，石蜡包埋切片，脱蜡至80%(体积分数)酒精，3%(体积分数)H2O2甲醛封闭15 min，微波炉处理暴露抗原，血清封闭37℃孵育20 min，加入1∶500(体积比)兔抗人降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptid, CGRP)抗体，4℃孵育过夜，滴入1∶200(体积比)生物素化羊抗兔IgG抗体，37℃孵育30 min，常规TBS清洗，加1∶100(体积比)ABC液，37℃孵育50 min，DAB-H2O2染色，苏木素复染封片。阴性对照为PBS和未免疫兔血清。
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1.2.2 双相间接免疫荧光染色及激光共聚焦扫描观察 取银屑病斑块型皮损及正常皮肤组织新鲜标本，OCT包埋冰冻切片，丙酮固定后PBS清洗。加第一抗体，先用鼠抗人CD1a mAb 1∶100(体积比)，37℃孵育60 min，PBS清洗，后加兔抗人CGRP抗体1∶100(体积比)，37℃孵育60 min，PBS清洗；再加第二抗体，先用PE标记抗鼠IgG抗体1∶20(体积比)，37℃孵育60 min，PBS清洗，后加FITC标记抗兔IgG抗体1∶10(体积比)，37℃孵育60 min，PBS清洗，缓冲甘油封片，在荧光显微镜及激光扫描共焦显微镜下观察。并以PBS和正常兔血清替代一抗作阴性对照，以鼠脊神经节细胞作阳性对照。
1.3 CGRP原位杂交
1.3.1 制备CGRP的RNA探针 取CGRP质粒pBKSII- Exon5(3.2kb，含165bp的CGRP核苷酸系列)加入限制性内切酶XhoI，经37℃孵育，酶切使质粒线性化，用Tris酚：氯仿/异戊醇提取，乙醇沉淀及水重悬回收，以线性CGRPcDNA作为模板，转录RNA，加入地高辛标记NTP缓冲液(含Dig-NTP)和T7RNA聚合酶，混合后在37℃孵育2～3 h，利用T7启动子从5′端合成反义地高辛标记CGRP单链RNA探针，并用8 g.L-1琼脂糖凝胶电泳鉴定探针标记完成。另外，用内切酶XbaI在CGRP cDNA的另一端切开质粒，用T3RNA聚合酶，从3′端合成正义CGRP单链RNA探针做对照。
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1.3.2 组织切片原位杂交 寻常型银屑病斑块型皮损福尔马林固定，石蜡包埋切片，并将CGRP免疫组化阳性的皮损石蜡连续切片，常规脱蜡水化，TritonX-100室温孵育10 min，用1∶200 (体积比)蛋白酶K 37℃消化20 min，4%(体积分数)多聚甲醛固定，90%(体积分数)冰乙醇脱水。将杂交液与反义CGRP探针预处理，80℃加热10 min，把含探针的杂交液加入组织切片，置42℃孵育16～22 h，杂交后用50%(体积分数)甲酰胺SSC液在50℃洗2次，各20 min，马血清(1∶100体积比)封闭，37℃孵育30 min，加抗Dig-Ap (1∶500 体积比)，37℃孵育60 min ，Buffer I洗3次各5 min ，Buffer Ⅲ洗15 min ，NBT-BCIP染色，缓冲甘油封片，显微镜下观察。以脊神经节的神经细胞为阳性对照，无探针杂交液和PBS作阴性对照，并用正义CGRP单链RNA探针同时对照 。
2 结果
2.1 皮损组织中CGRP免疫组化染色形态学观察
, 百拇医药
在寻常型银屑病斑块型皮损中，可见CGRP分布于增厚的表皮和真皮乳头及浅层组织。在表皮见条索状排列的阳性表达颗粒穿过基底膜进入表皮细胞间(图1a)，并见呈树枝状的阳性细胞，细胞表面有分枝突起(图1b)，经连续切片做HE染色，未显示此阳性细胞。
图1a 免疫组化:寻常型银屑病斑块型皮损见条索状排列的
CGRP阳性表达颗粒穿过基底膜进入表皮细胞间ABC法 ×100
Fig.1a Immunohistochemistry:CGRP positive nervous fibers extended
into the epidermal in psoriatic plaque lesions.ABC ×100
, 百拇医药
图1b 免疫组化:银屑病斑块型皮损见呈树枝状的
CGRP阳性细胞，细胞表面有分枝突起ABC法 ×400
Fig.1a Immunohistochemistry:At epidermal dendrite cell surface in psoriatic
lesion was also found calcitonin gene-related peptide(CGRP) ABC ×400
2.2 双相间接免疫荧光染色及激光共焦扫描观察
在激光扫描共焦显微镜下可见，银屑病斑块型皮损增厚的表皮内，CD1a+的Langerhans细胞 与PE-αM IgG抗体结合发红色荧光，同时其表面有CGRP与FITC-αR IgG 抗体结合发绿色荧光，两种荧光信号同时在一个细胞上发出，经计算机处理显示呈黄棕色(图 2)，说明CGRP阳性的细胞为CD1a+的Langerhans细胞。经4个断层的光切扫描此双阳性细胞，可见CGRP和CD1a+都分布于Langerhans细胞的膜表面 ，深层光切面则显示细胞浆内呈阴性，而且细胞膜的阳性信号在边缘呈环状。正常皮肤组织及阴性对照未见此双阳性细胞。
, 百拇医药
CGRP and CD1a+ double positive particles were found
at the surface of epidermal Langerhans cell in psoriatic plaque lesion.
图2 双相免疫荧光染色及激光共聚焦扫描 ×400
Figure 2 Double immunofluorenscence staining and confocal
laser microscope scanning ×400
2.3 CGRP原位杂交
寻常型银屑病斑块型皮损组织石蜡连续切片，经反义CGRP的RNA探针原位杂交，增厚的皮损表皮树枝状细胞中可见CGRP的mRNA表达于细胞的核膜周围(图 3)，而PBS和无探针杂交液阴性对照则未见阳性表达，同时连续切片的银屑病皮损组织用正义CGRP探针作对照，同步进行原位杂交，也未见阳性表达。
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图3 原位阿交：银屑病皮损增厚的表皮Langerhans细胞内
CGRP的mRNA表达于核膜周围×400
Fig.3 In situ hybridization: The epidermal Langerhans cell in psoriatic
lesions expressed CGRP mRNA around nuclear membrane of the cell ×400
3 讨论
CGRP是一种含37个氨基酸残基的神经肽，1982年Amara等[1]首次在人和哺乳动物体内发现，由降钙素基因编码，转录后经不同的剪接修饰产生组织特异性的降钙素和CGRP，前者存在于甲状腺C细胞，而CGRP则广泛存在于中枢和外周神经系统。就人体皮肤所含神经肽而言，CGRP是含量最丰富的。表皮下有单个散在的CGRP反应阳性神经纤维，能穿透基底膜进入表皮，真皮深层CGRP阳性神经纤维可从神经束中伸出分枝，到达小血管和汗腺周围，释放CGRP，调节其功能，CGRP成为皮肤重要的感觉神经递质[2]。我们前一部分特异性放射免疫的研究工作结果表明，寻常型银屑病斑块型皮损局部组织神经肽CGRP的含量明显高于正常人，说明此类型患者皮损病变与局部CGRP的分泌密切相关。为了确定CGRP在皮损区分泌表达的部位和作用的靶细胞，我们用免疫组化染色观察，结果发现真皮毛细血管壁周围及内皮细胞表面有CGRP阳性颗粒分布，增厚的表皮内见条索状排列的神经纤维分泌表达的CGRP阳性颗粒和树枝状的阳性细胞，并经连续切片HE染色为阴性，提示可能为Langerhans细胞。Langerhans细胞是表皮重要的免疫细胞，属于抗原呈递细胞(antigen-presenting cell, APC),也是表皮唯一表达CD1a+抗原的细胞[3]。由于皮肤感觉神经末梢CGRP反应阳性神经纤维，可从真皮突触伸出穿过基底膜进入表皮内，释放神经递质——CGRP作用于表皮细胞[4]。因此，CGRP与表皮细胞，尤其是Langerhans细胞的相互关系，反映了皮肤神经系统与免疫系统之间的相互作用[5]。本实验用免疫组化显示CGRP表达于表皮的树枝状细胞。为鉴别这种CGRP阳性树枝状细胞的性质，本实验又用CGRP和CD1a抗体作用于银屑病斑块型皮损组织，并用PE-αM IgG和FITC-αR IgG 抗体进行双相免疫荧光染色，通过激光共聚焦扫描显微镜观察，CGRP存在于表皮CD1a+ Langerhans细胞上，表明寻常型银屑病斑块型皮损内神经肽CGRP与表皮Langerhans细胞密切接触，这种接触可能与CGRP受体的介导有关[6]。为进一步明确银屑病皮损表皮Langerhans细胞表面CGRP的来源，本实验用反义CGRP的RNA探针，作用于银屑病斑块型皮损组织，进行原位杂交研究，发现在表皮Langerhans细胞有CGRPmRNA的表达。但是，以双相免疫荧光染色及激光共聚焦扫描显微镜观察表皮Langerhans细胞不同断面发现，CGRP存在于细胞膜，胞浆内未见阳性着色。这一结果的原因还不完全清楚。可能Langerhans细胞CGRPmRNA的表达量很少，Langerhans细胞膜上的CGRP主要来源于神经纤维，银屑病斑块型皮损内神经肽CGRP对表皮Langerhans细胞的功能有何影响，有待进一步研究。
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参考文献
1，Amara SG, Jones V, Rosenfeld MG. Alternative RNA processing in calcitonin gene expression generates mRNAs encoding different polypeptide products[J]. Nature, 1982: 298 (5871): 240-244
2，Wallengren J. Vasoactive peptides in the skin[J]. J Invest Dermatol, 1997, 2(1):49-55
3，Prignano F. Immunophenotype analysis of normal human dendritic cells isolated from epidermis and dermis[J]. Int J Dermatol , 1998 , 37:116-119
, 百拇医药
4，Hosoi J, Murphy GE, Egan CL, et al. Regulation of Langerhans cell function by nerves containing calcitonin gene-related peptide[J]. Nature, 1993 , 363(13):159-162
5，Schelzen T, Armstrong CA, Bunnett NW, et al. Neuropeptides in the skin: Interaction between the neuroendocrine and the skin immune system[J]. Exp Dermatol , 1998, 7(2-3):81-96
6，Misery L. Langerhans cells in the neuro-immuno-cutaneous system[J]. J Neuroimmunol, 1998, 89(1-2) : 83-87
(2000-03-31收稿), 百拇医药
单位：何焱玲 朱铁君(北京大学人民医院皮肤科，北京 100044)；丁桂凤(北京大学基础医学院免疫学系)；张波(北京大学病理学系)；邓玉兰(北京大学基础医学院免疫学系)；王宪 范少光(北京大学生理学系)
关键词：银屑病；郎格汉斯细胞；降钙素基因相关肽；RNA；信使；代谢
北京医科大学学报000408 [摘 要] 目的：探讨神经递质降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP) 与银屑病皮损Langerhans细胞的相关性，研究银屑病的发病机制。方法：抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物法确定CGRP的靶细胞，用双相间接免疫荧光染色法，把CD1a单克隆抗体和CGRP抗体作用于寻常型银屑病斑块型皮损同一切片，用PE-αM IgG和FITC-αR IgG 抗体显示，通过激光扫描共焦显微镜观察，并利用RNA探针原位杂交技术，研究表皮树枝状细胞CGRP的来源。结果：免疫组化染色银屑病皮损显示CGRP阳性表皮树枝状细胞，经双相免疫荧光染色及激光扫描断层光切，可见CGRP存在于银屑病皮损表皮CD1a+ Langerhans细胞膜表面，Langerhans细胞内有CGRPmRNA的表达。结论：寻常型银屑病斑块型皮损表皮Langerhans细胞与神经肽CGRP密切接触，同时Langerhans细胞内有CGRPmRNA的表达。
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[中图分类号] R758.63 [文献标识码] A [文章编号] 1000-1530(2000)04-0313-03
Study on the relationship between calcitonin gene-related peptide
and Langerhans cells in psoriatic lesions
HE Yan-Ling
(Department of Dermatology, Peking University People's Hospital, Beijing 100044, China)
DING Gui-Feng
(Department of Immunology)
, http://www.100md.com
ZHANG Bo
(Department of Pathonogy)
DEN Yiu-Lan
(Department of Immunology)
WANG Xian
(Department of Physiology， Peking University School of Basic Medical Sciences)
ZHU Tie-Jun
(Department of Dermatology, Peking University People's Hospital, Beijing 100044, China)
, http://www.100md.com
FAN Shao-Guang
(Department of Physiology， Peking University School of Basic Medical Sciences)
ABSTRACT Objective:
To investigate the relationship between Langerhans cells and calcitonin gene-related peptide(CGRP). Methods: Immunohistochemistry was used to determine CGRP expression in cells. Double immunofluorenscence staining was used for staining the section of psoriatic lesion. Confocal laser microscope was emplayed to examine the psoriatic epidermal. The source of CGRP on the dendritic cell was studied by RNA probe of CGRP in situ hybridization. Results: CGRP existed on the surface of CD1a+ epidermal Langerhans cells in psoriatic lesions. Expression of CGRP mRNA in the Langerhans cells was also detected. Conclusion: The epidermal Langerhans cells of the psoriatic plague lesion contacted closely with neuropeptide CGRP. Langerhans cells expressed CGRP mRNA.
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KEY WORDS Psoriasis； Langerhans cells; Calcitonin gene-related peptide; RNA, messenger/metab
(J Beijing Med Univ, 2000,32:313-315)
为了进一步研究银屑病的发病机制，探讨神经肽与神经免疫调节在银屑病发病中的作用，本实验应用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物法免疫组织化学染色，双相间接免疫荧光染色及激光共聚焦扫描观察，同时利用RNA探针原位杂交技术，研究降钙素基因相关肽与寻常型银屑病患者斑块型皮损病变的相关性，获得了有意义的结果。
1 材料与方法
1.1 材料
病例：寻常型银屑病12例(经临床和组织病理确诊)，男8例，女4例，年龄22～65岁，病程2～32年。取背及四肢伸侧肥厚斑块型皮损。并以8名正常人的皮肤组织作对照。 试剂与仪器：hCGRP抗体(由我校生理学系王宪教授惠赠)；ABC免疫组化试剂盒(购自中山生物试剂公司)；鼠抗人CD1a mAb (NA 1/34,IgG2a, 丹麦DAKD公司)，PE标记抗鼠IgG抗体(PE-αM IgG抗体，我系)，FITC标记抗兔IgG抗体(FITC-αR IgG抗体，军事医学科学院)。
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CGRPcDNA质粒pBKSII-Exon 5 (由我校生理学系王宪教授惠赠)，限制性内切酶XhoI(宝泰克公司)，地高辛标记NTP (Dig-NTP)，抗地高辛-AP(抗Dig-AP)和NBT-BCIP(德国宝灵曼公司)，T7和T3 RNA聚合酶(GIBco公司)，内切酶XbaI (鼎国生物公司)，杂交液 (ssDNA、DTT、Denhardt、SSC、0.1g.L-1 Dextran Sulfate、甲酰胺 )。激光扫描共焦显微镜 (TCSNT型、德国Leica公司)，DMRIXA显微镜和荧光显微镜(德国Leica公司)。
1.2 方法
1.2.1 抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物法免疫组织化学染色 取斑块型皮损组织及正常对照组织，常规固定，石蜡包埋切片，脱蜡至80%(体积分数)酒精，3%(体积分数)H2O2甲醛封闭15 min，微波炉处理暴露抗原，血清封闭37℃孵育20 min，加入1∶500(体积比)兔抗人降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptid, CGRP)抗体，4℃孵育过夜，滴入1∶200(体积比)生物素化羊抗兔IgG抗体，37℃孵育30 min，常规TBS清洗，加1∶100(体积比)ABC液，37℃孵育50 min，DAB-H2O2染色，苏木素复染封片。阴性对照为PBS和未免疫兔血清。
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1.2.2 双相间接免疫荧光染色及激光共聚焦扫描观察 取银屑病斑块型皮损及正常皮肤组织新鲜标本，OCT包埋冰冻切片，丙酮固定后PBS清洗。加第一抗体，先用鼠抗人CD1a mAb 1∶100(体积比)，37℃孵育60 min，PBS清洗，后加兔抗人CGRP抗体1∶100(体积比)，37℃孵育60 min，PBS清洗；再加第二抗体，先用PE标记抗鼠IgG抗体1∶20(体积比)，37℃孵育60 min，PBS清洗，后加FITC标记抗兔IgG抗体1∶10(体积比)，37℃孵育60 min，PBS清洗，缓冲甘油封片，在荧光显微镜及激光扫描共焦显微镜下观察。并以PBS和正常兔血清替代一抗作阴性对照，以鼠脊神经节细胞作阳性对照。
1.3 CGRP原位杂交
1.3.1 制备CGRP的RNA探针 取CGRP质粒pBKSII- Exon5(3.2kb，含165bp的CGRP核苷酸系列)加入限制性内切酶XhoI，经37℃孵育，酶切使质粒线性化，用Tris酚：氯仿/异戊醇提取，乙醇沉淀及水重悬回收，以线性CGRPcDNA作为模板，转录RNA，加入地高辛标记NTP缓冲液(含Dig-NTP)和T7RNA聚合酶，混合后在37℃孵育2～3 h，利用T7启动子从5′端合成反义地高辛标记CGRP单链RNA探针，并用8 g.L-1琼脂糖凝胶电泳鉴定探针标记完成。另外，用内切酶XbaI在CGRP cDNA的另一端切开质粒，用T3RNA聚合酶，从3′端合成正义CGRP单链RNA探针做对照。
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1.3.2 组织切片原位杂交 寻常型银屑病斑块型皮损福尔马林固定，石蜡包埋切片，并将CGRP免疫组化阳性的皮损石蜡连续切片，常规脱蜡水化，TritonX-100室温孵育10 min，用1∶200 (体积比)蛋白酶K 37℃消化20 min，4%(体积分数)多聚甲醛固定，90%(体积分数)冰乙醇脱水。将杂交液与反义CGRP探针预处理，80℃加热10 min，把含探针的杂交液加入组织切片，置42℃孵育16～22 h，杂交后用50%(体积分数)甲酰胺SSC液在50℃洗2次，各20 min，马血清(1∶100体积比)封闭，37℃孵育30 min，加抗Dig-Ap (1∶500 体积比)，37℃孵育60 min ，Buffer I洗3次各5 min ，Buffer Ⅲ洗15 min ，NBT-BCIP染色，缓冲甘油封片，显微镜下观察。以脊神经节的神经细胞为阳性对照，无探针杂交液和PBS作阴性对照，并用正义CGRP单链RNA探针同时对照 。
2 结果
2.1 皮损组织中CGRP免疫组化染色形态学观察
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在寻常型银屑病斑块型皮损中，可见CGRP分布于增厚的表皮和真皮乳头及浅层组织。在表皮见条索状排列的阳性表达颗粒穿过基底膜进入表皮细胞间(图1a)，并见呈树枝状的阳性细胞，细胞表面有分枝突起(图1b)，经连续切片做HE染色，未显示此阳性细胞。
图1a 免疫组化:寻常型银屑病斑块型皮损见条索状排列的
CGRP阳性表达颗粒穿过基底膜进入表皮细胞间ABC法 ×100
Fig.1a Immunohistochemistry:CGRP positive nervous fibers extended
into the epidermal in psoriatic plaque lesions.ABC ×100
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图1b 免疫组化:银屑病斑块型皮损见呈树枝状的
CGRP阳性细胞，细胞表面有分枝突起ABC法 ×400
Fig.1a Immunohistochemistry:At epidermal dendrite cell surface in psoriatic
lesion was also found calcitonin gene-related peptide(CGRP) ABC ×400
2.2 双相间接免疫荧光染色及激光共焦扫描观察
在激光扫描共焦显微镜下可见，银屑病斑块型皮损增厚的表皮内，CD1a+的Langerhans细胞 与PE-αM IgG抗体结合发红色荧光，同时其表面有CGRP与FITC-αR IgG 抗体结合发绿色荧光，两种荧光信号同时在一个细胞上发出，经计算机处理显示呈黄棕色(图 2)，说明CGRP阳性的细胞为CD1a+的Langerhans细胞。经4个断层的光切扫描此双阳性细胞，可见CGRP和CD1a+都分布于Langerhans细胞的膜表面 ，深层光切面则显示细胞浆内呈阴性，而且细胞膜的阳性信号在边缘呈环状。正常皮肤组织及阴性对照未见此双阳性细胞。
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CGRP and CD1a+ double positive particles were found
at the surface of epidermal Langerhans cell in psoriatic plaque lesion.
图2 双相免疫荧光染色及激光共聚焦扫描 ×400
Figure 2 Double immunofluorenscence staining and confocal
laser microscope scanning ×400
2.3 CGRP原位杂交
寻常型银屑病斑块型皮损组织石蜡连续切片，经反义CGRP的RNA探针原位杂交，增厚的皮损表皮树枝状细胞中可见CGRP的mRNA表达于细胞的核膜周围(图 3)，而PBS和无探针杂交液阴性对照则未见阳性表达，同时连续切片的银屑病皮损组织用正义CGRP探针作对照，同步进行原位杂交，也未见阳性表达。
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图3 原位阿交：银屑病皮损增厚的表皮Langerhans细胞内
CGRP的mRNA表达于核膜周围×400
Fig.3 In situ hybridization: The epidermal Langerhans cell in psoriatic
lesions expressed CGRP mRNA around nuclear membrane of the cell ×400
3 讨论
CGRP是一种含37个氨基酸残基的神经肽，1982年Amara等[1]首次在人和哺乳动物体内发现，由降钙素基因编码，转录后经不同的剪接修饰产生组织特异性的降钙素和CGRP，前者存在于甲状腺C细胞，而CGRP则广泛存在于中枢和外周神经系统。就人体皮肤所含神经肽而言，CGRP是含量最丰富的。表皮下有单个散在的CGRP反应阳性神经纤维，能穿透基底膜进入表皮，真皮深层CGRP阳性神经纤维可从神经束中伸出分枝，到达小血管和汗腺周围，释放CGRP，调节其功能，CGRP成为皮肤重要的感觉神经递质[2]。我们前一部分特异性放射免疫的研究工作结果表明，寻常型银屑病斑块型皮损局部组织神经肽CGRP的含量明显高于正常人，说明此类型患者皮损病变与局部CGRP的分泌密切相关。为了确定CGRP在皮损区分泌表达的部位和作用的靶细胞，我们用免疫组化染色观察，结果发现真皮毛细血管壁周围及内皮细胞表面有CGRP阳性颗粒分布，增厚的表皮内见条索状排列的神经纤维分泌表达的CGRP阳性颗粒和树枝状的阳性细胞，并经连续切片HE染色为阴性，提示可能为Langerhans细胞。Langerhans细胞是表皮重要的免疫细胞，属于抗原呈递细胞(antigen-presenting cell, APC),也是表皮唯一表达CD1a+抗原的细胞[3]。由于皮肤感觉神经末梢CGRP反应阳性神经纤维，可从真皮突触伸出穿过基底膜进入表皮内，释放神经递质——CGRP作用于表皮细胞[4]。因此，CGRP与表皮细胞，尤其是Langerhans细胞的相互关系，反映了皮肤神经系统与免疫系统之间的相互作用[5]。本实验用免疫组化显示CGRP表达于表皮的树枝状细胞。为鉴别这种CGRP阳性树枝状细胞的性质，本实验又用CGRP和CD1a抗体作用于银屑病斑块型皮损组织，并用PE-αM IgG和FITC-αR IgG 抗体进行双相免疫荧光染色，通过激光共聚焦扫描显微镜观察，CGRP存在于表皮CD1a+ Langerhans细胞上，表明寻常型银屑病斑块型皮损内神经肽CGRP与表皮Langerhans细胞密切接触，这种接触可能与CGRP受体的介导有关[6]。为进一步明确银屑病皮损表皮Langerhans细胞表面CGRP的来源，本实验用反义CGRP的RNA探针，作用于银屑病斑块型皮损组织，进行原位杂交研究，发现在表皮Langerhans细胞有CGRPmRNA的表达。但是，以双相免疫荧光染色及激光共聚焦扫描显微镜观察表皮Langerhans细胞不同断面发现，CGRP存在于细胞膜，胞浆内未见阳性着色。这一结果的原因还不完全清楚。可能Langerhans细胞CGRPmRNA的表达量很少，Langerhans细胞膜上的CGRP主要来源于神经纤维，银屑病斑块型皮损内神经肽CGRP对表皮Langerhans细胞的功能有何影响，有待进一步研究。
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参考文献
1，Amara SG, Jones V, Rosenfeld MG. Alternative RNA processing in calcitonin gene expression generates mRNAs encoding different polypeptide products[J]. Nature, 1982: 298 (5871): 240-244
2，Wallengren J. Vasoactive peptides in the skin[J]. J Invest Dermatol, 1997, 2(1):49-55
3，Prignano F. Immunophenotype analysis of normal human dendritic cells isolated from epidermis and dermis[J]. Int J Dermatol , 1998 , 37:116-119
, 百拇医药
4，Hosoi J, Murphy GE, Egan CL, et al. Regulation of Langerhans cell function by nerves containing calcitonin gene-related peptide[J]. Nature, 1993 , 363(13):159-162
5，Schelzen T, Armstrong CA, Bunnett NW, et al. Neuropeptides in the skin: Interaction between the neuroendocrine and the skin immune system[J]. Exp Dermatol , 1998, 7(2-3):81-96
6，Misery L. Langerhans cells in the neuro-immuno-cutaneous system[J]. J Neuroimmunol, 1998, 89(1-2) : 83-87
(2000-03-31收稿), 百拇医药