原发性高血压病人红细胞L-精氨酸/一氧化氮系统的改变
作者：祖竑 周国鹏 姚兴海 唐朝枢
单位：祖竑 周国鹏(北京大学第一医院老年内科，北京 100034)；姚兴海(首都医科大学生理教研组)；唐朝枢(北京大学第一医院中心实验室)
关键词：高血压；红细胞；精氨酸；代谢；一氧化氮；代谢
北京医科大学学报000622 [摘 要]目的：探讨原发性高血压病人红细胞精氨酸/一氧化氮系统的改变。方法：通过核素标记测定红细胞3H-L-Arg转运的特征；一氧化氮合酶(NO synthase,NOS)改良法测定红细胞NOS活性；放射免疫法测定环磷酸鸟苷(cGMP)的含量。结果：高血压组红细胞L-Arg摄入的最大转运速率(Vmax)较正常组明显降低，但两组L-Arg转运的亲合力(Km)无差异。其中高血压组经过Y+通道的Vmax与正常对照组比较明显下降，Km与正常组无差别。经过Y+L通道的Vmax与正常对照组比较无变化，Km升高。高血压组红细胞NOS生成量及NOS活性均降低。高血压时红细胞中的cGMP的含量也较正常人明显减少。结论：高血压时红细胞利用精氨酸生成一氧化氮的能力下降。
, 百拇医药
[中图分类号]R544.1 [文献标识码]A
[文章编号]1000-1530(2000)06-0557-04
Change of L-Arg/NO system in erythrocytes of essential hypertension patients
ZU Hong，ZHOU Guo-Peng
(Department of Gerontology,Peking University First Hospital,Beijing 100034)
YAO Xing-Hai
(Department of Physiology,Capital University of Medical Science)
, 百拇医药
TANG Chao-Shu
(Central Laboratory,Peking Universing First Hospital)
ABSTRACT Objective:To study the change of L-Arg/NO system in erythrocytes of essential hypertension patients.Methods:The 3H-L-Arg transport,NO synthase (NOS) production,NOS activity and the contents of cGMP were measured.Results:The Vmax for total transport of L-Arg via system Y+ deceased in erythrocytes of hypertension patients compared with control subjects,while the Vmax for the transport of L-Arg via system Y+L was unaffected in erythrocytes of hypertension patients.Km values for total L-Arg influx via Y+ system were not significantly different in erythrocytes in control or hypertension groups.The NOS activity produced and cGMP decreased significantly compared with those of the control and hypertension groups.Conclusion:The ability of erythrocytes utilizing L-Arg to produce NO is reduced when blood pressure rises.
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KEY WORDS Hypertension；Erythrocyte；Arginine/metab;Nitric oxide/metab
目前对高血压发病机制尚未完全阐明。已发现内皮细胞可以通过释放一些血管因子来调节血管张力，其中内皮细胞释放的内皮衍生舒张因子/一氧化氮(endothelium-derived relaxing factor/nitric oxide，EDRF/NO)具有维持血管张力，调节血压的作用。近来发现红细胞也有精氨酸/一氧化氮系统[1]，可以生成一氧化氮，具有调节自身及其周围组织生理功能的作用。目前对原发性高血压病人红细胞精氨酸/一氧化氮系统研究很少，本文通过观察高血压时红细胞膜精氨酸的转运、细胞内NOS活性、生成量的变化，探讨红细胞精氨酸/—氧化氮系统的改变在高血压发病学上的意义。
1 材料与方法
1.1 研究对象
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病例选择及分组：(1)原发高血压组 按WHO高血压诊断标准(收缩压≥140 mmHg，和/或舒张压≥90 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa)，选择14例原发性高血压病患者，按WHO分期，Ⅰ期6人，Ⅱ期8人，平均年龄(57.2±8.0)岁，其中男性12名，女性2名，均除外高脂血症、糖尿病、心肌梗死、心绞痛、脑血管病、原发性肾疾病等。平均动脉压(120.6±12.7) mmHg。(2)对照组 10名，体检身体健康的成年人10例，男7例，女3例，平均年龄(52.0±5.2) 岁，平均动脉压(86.5±6.4)mmHg。
1.2 红细胞采集及制备
晨起肘正中静脉取血5 ml，38 g.L-1枸椽酸钠(体积比1∶9)抗凝，离心(1 400×g，10 min)后去上清，再加入4倍体积的(mmol.L-1) NaCl 140；KCl 5；D-glucose 5；Mops10(pH7.4)，离心(4 ℃ 1 400×g，10 min)洗3次，吸去上清及上层淡黄色层，再重新离心洗3遍。之后红细胞悬浮于改良的Hank's平衡盐溶液中(MHBSS)(1 mmol.L-1，pH7.4)，取部分悬液用于红细胞计数。
, 百拇医药
1.3 红细胞L-精氨酸转运
为了去除细胞内物质浓度变化通过跨膜刺激对跨膜转运的影响，将红细胞在无任何底物的环境中37 ℃孵育3 h，以达到零转运状态。在零转运状态下，可以通过用N-ethylmalmide(NEM)抑制Y+载体，从而将转运分为Y+和Y+L两种。将红细胞悬液用0.2 mmol.L-1NEM在25 ℃下抑制15 min，后用2-mercaptoethanol(10 mmol.L-1)终止反应。后将红细胞洗涤、沉淀，以供转运测定。
取1 ml MHBSS红细胞悬液(1×107 cells/ml)，放入成对的离心管中，分别加入不同浓度的3H-L-精氨酸(5～400 mol.L-1)，37 ℃孵育5 min，测量L-精氨酸的初始摄入。之后用冷等张溶液MgCl2 107；Mops 10(pH7.4)冲洗细胞，用0.1%(体积比)三硝基甲苯X-100 0.5 ml，超声10 s溶解细胞。用5%(体积比)三氯乙酸1 ml沉淀蛋白，之后用β-液闪烁计数仪测定放射活性。细胞悬液中的蛋白含量用改良的Micro-lowry法测定。经NEM处理后的红细胞[3H]-L-精氨酸摄入由Y+L系统介导，未被NEM抑制的[3H]-L-精氨酸摄入减去Y+L介导的摄入即可得Y+介导的摄入。
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1.4 红细胞NOS的提纯及NOS活性的测定
1.4.1 NOS提纯 将红细胞(5×107 cells)反复冻融及超声5 s溶解，离心，获得溶血产物，再加入50 mmol.L-1 Tris-HCl，取10 ml加入2 ml 2′，5′-ADP-agarose平衡缓冲液，孵育10 min后，经过加热柱提纯。NOS经过DEAE-BioGel A离子交换柱提取，再经过50 mmol.L-1 Tris-HCl，1 mmol.L-1DDT，120 mmol.L-1 NAC洗提。蛋白浓度用改良的micro-Lowry法测定，以牛血清白蛋白为标准。
1.4.2 NOS活性测定 在100 μl提纯的NOS(20 μg)中，加入0.5 mmol.L-1 NADPH，1.5 mol.L-1 CaCl2，50 μmol.L-1 Tetrahydr-bioptein，74×103 Bq[3H]-L-精氨酸，总容积120 ml，空白对照用MHSS代替，37 ℃孵育15 min，加入2 ml冷终止液30 mmol.L-1 HEPES，3 mmol.L-1 EDTA pH5.5，经Dowex AG 50W-X8(Ns+型)阳离子交换层析柱，4 ml水提取，加入闪烁液，用β-液闪烁计数仪测定[3H]-胍氨酸浓度。
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1.5 红细胞cGMP含量测定
红细胞悬液与0.1 mmol.L-1 L-精氨酸共同孵育30 min，22 900×g离心10 s，去上清，加入50 μ1乙醇，真空离心去除溶剂，红细胞重新悬浮于300 μ1缓冲液中，50 mmol.L-1 Tris-HCL，4 mmol.L-1 EDTA，pH7.5，振荡10 min，离心，取100 μl上清用放免法测cGMP。红细胞cGMP含量以每5×107红细胞中cGMP的量(pmol)表示。
1.6 统计学方法
实验结果以
±s表示，用非配对t检验，及相关回归进行统计学处理，以P<0.05为差异有显著性，以P<0.01为差异有极显著性。
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2 结果
2.1 原发性高血压患者一般情况
14例高血压患者的平均动脉压明显高于对照组[(120.6±12.7)mmHg比(86.5±6.4)mmHg，P<0.05]，但两组间年龄无明显区别[(57.2±8.0)岁比(52.0±5.2)岁，P>0.05]。
2.2 高血压时红细胞L-Arg的转运
从表1可以看到，红细胞膜L-Arg的转运呈高亲和型，高血压时红细胞L-Arg的总摄入的最大转运速率(Vmax)较正常对照组明显降低[每107细胞(3.64±0.14)nmol.min-1比(5.43±0.20)nmol.min-1，P<0.01]，但两组L-Arg转运的亲和力(Km)无差异。正常对照组通过Y+通道介导的最大转运速率为每107细胞(4.50±0.27)nmol.min-1，底物与载体的亲和力为(35.5±4.7)μm，高血压组Vmax明显下降为每107细胞(2.62±0.19)nmol.min-1，与正常对照组差异有显著性(P<0.001)，底物与载体的Km为(34.0±7.0)μm，与正常组差别无显著性，说明Y+通道介导的L-Arg转运在高血压时下降。比较Y+L通道的活性，发现在正常组及高血压组转运的Vmax差别没有显著性，而Km在高血压时是增加的。
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2.3 高血压红细胞NOS的活性及cGMP含量
高血压组红细胞NOS生成量及NOS活性都是降低的。每5×107细胞NOS生成量从正常时(0.540±0.016) mg protein降至(0.489±0.062) mg protein，两者比较P<0.01，NOS的活性也由正常时的每毫克蛋白(21.79±4.26) nmol.min-1，降至(10.99±2.73) nmol.min-1(P<0.001)。高血压时红细胞中的cGMP含量为每5×107细胞(0.168±0.047) pmol，较正常人的(0.234±0.046) pmol明显减少(P<0.05)。说明高血压时红细胞L-Arg/NO系统出现障碍，NO合成下降。
表1 正常组与高血压组红细胞3H-L-Arg转运特征
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(±s,nmol.min-1*10-7 cell)
Table 1 Kinetics of 3H-L-Arg transport in normal and essential hypertension erythrocyte
(±s,nmol.min-1*10-7 cell) c(3H-L-Arg)
/μmol.L-1
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Control (n=10)
EH (n=14)
Total influx
Y+L influx
Y+ influx
Total influx
Y+L influx
Y+ influx
5
0.74±0.10
0.17±0.03
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0.57±0.08
0.47±0.06*
0.13±0.03+
0.34±0.05*
10
1.24±0.12
0.25±0.03
0.99±0.10
0.83±0.13*
0.24±0.04
0.59±0.14*
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20
2.11±0.14
0.43±0.05
1.68±0.15
1.42±0.13*
0.43±0.04
1.00±0.13*
40
2.67±0.23
0.54±0.03
2.14±0.23
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1.88±0.085*
0.53±0.04
1.35±0.10*
80
3.47±0.35
0.67±0.06
2.19±0.31
2.44±0.26*
0.72±0.07
1.73±0.28*
100
, 百拇医药
3.36±0.35
0.76±0.05
3.6±0.37
2.83±0.12*
0.79±0.06
2.04±0.15+
200
4.76±0.38
0.84±0.04
3.92±0.39
3.17±0.09*
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0.83±0.06
2.34±0.12*
300
5.11±0.29
0.92±0.03
4.19±0.28
3.39±0.09*
0.92±0.05
2.48±0.13*
400
5.16±0.21
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0.97±0.04
4.19±1.92
3.39±0.10*
0.93±0.66
2.46±0.13*
c,concentration;*EH vs control:P<0.001;+EH vs control，P<0.05.3 讨论
因为红细胞是人体中少数几种容易获得的细胞类型，所以可作为研究膜转运功能的有利工具。过去一直认为血红蛋白是NO的清除载体，所以限制了对红细胞NO系统的研究。最近在人类及一些动物模型中发现红细胞上也存在L-Arg/NO系统，也有合成NO的能力[1]。红细胞生成NO的生理作用目前还不是很清楚。通过对S-亚硝基血红蛋白转导NO的相关活动的机制研究，发现红细胞上的硫氢键(thiol)可以将红细胞上的NO转移到内皮细胞受体上，引起血管床的舒张[3]。红细胞通过释放NO还可以影响血小板的聚集功能[4]。
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红细胞L-Arg的转运已知包含3种方式(通过Y+、Y+L通道介导和弥散)，细胞内底物浓度的变化可影响转运的结果，本实验通过观察14例原发性高血压患者红细胞膜上L-Arg转运系统，发现细胞外L-Arg主要通过高亲和性非Na+依赖性Y+蛋白氨基酸载体转运到细胞内比例占总转运的70%，另30%为Y+L载体转运。实验观察到原发性高血压时红细胞摄取L-Arg的能力降低，表现为L-Arg浓度转运曲线下移，在相同浓度下，L-Arg总转运Vmax及Y+通道介导的转运Vmax较正常对照组明显下降33%及40%，还观察到红细胞L-Arg的转运速率与细胞外精氨酸浓度升高呈正比，当精氨酸浓度达到300 μmol.L-1后，转运速率不再升高。高血压时Y+通道与L-Arg的亲和力(Km)无改变。Y+L通道介导的运转Vmax与正常组无变化，Km略有增加。故可以认为Y+通道在原发性高血压者红细胞的L-Arg转运中起着决定性作用。实验还发现原发性高血压时红细胞NOS的生成量及NOS的活性下降，与正常对照组相比差异有显著性，最终导致红细胞中cGMP的生成量下降，表明NO的生成减少。已有报道发现在原发性高血压时血小板L-Arg-NO途径存在障碍[5]。
, 百拇医药
在慢性肾功能衰竭及慢性心功能衰竭患者中，人们发现血浆中L-Arg的浓度下降[6]，而红细胞中L-Arg总的转运速率是升高的，认为这是一种代偿反应——当血浆L-Arg浓度降低时，增加转运速率以保持NO的产量。
目前已知，研究L-Arg的转运是探讨疾病时L-Arg/NO系统改变的重要环节，红细胞作为NO代谢过程中的“清除剂”，同时也在产生自己的NO，其L-Arg系统变化及这种变化的生理意义就更值得人们注意。另外，红细胞因其容易获得，所以可作为疾病发生、发展的一个有效监测窗口。
参考文献
1，Jubelin BC,Gierman JL.Erythrocytes may synthesize their own nitric oxide[J].Am J Hyperten,1996,9:1214-1219
, 百拇医药 2，Li J,Bonaventura C,Bonaventura J,et al.S-Nitrosohaemoglobin:a dynamic activity of blood involved in vascular control[J].Nature,1996,380:221-226
3，Stamler JS,Jaraki O,Osborne J,et al.Nitric oxide circulates in mammalian plasma primarily as an S-nitroso adduct of serum albumin[J].Proc Natl Acad Sci USA,1992，89:7674-7677
4，Chen LY,Mehta JL.Evidence for the presence of L-Arginine-Nitric oxide pathway in human red blood cells:Relevance in the effects of red blood cells on platelet function[J].Journal of Cardiovasc Pharmacol,1998,32:57-61
, 百拇医药
5，王 军，徐洪涛，姚兴海，等.高血压病人血小板L-精氨酸/一氧化氮系统的改变[J].高血压杂志,1998,6(1)：22-24
6，Mendes Ribeiro AC,Hanssen H,Kiessling K,et al.Transport of L-arginine and the nitric oxide inhibitor NG-monomethyl-L-arginine in human erythrocytes in chronic renal failure[J].Clinical Science,1997,93:57-64
7，Hanssen H,Brunini TMC,Conway M,et al.Increased L-arginine transport in human erythrocytes in chronic heart failure[J].Clin Sci,1997,94:43-48
收稿日期：1999-06-11, 百拇医药
单位：祖竑 周国鹏(北京大学第一医院老年内科，北京 100034)；姚兴海(首都医科大学生理教研组)；唐朝枢(北京大学第一医院中心实验室)
关键词：高血压；红细胞；精氨酸；代谢；一氧化氮；代谢
北京医科大学学报000622 [摘 要]目的：探讨原发性高血压病人红细胞精氨酸/一氧化氮系统的改变。方法：通过核素标记测定红细胞3H-L-Arg转运的特征；一氧化氮合酶(NO synthase,NOS)改良法测定红细胞NOS活性；放射免疫法测定环磷酸鸟苷(cGMP)的含量。结果：高血压组红细胞L-Arg摄入的最大转运速率(Vmax)较正常组明显降低，但两组L-Arg转运的亲合力(Km)无差异。其中高血压组经过Y+通道的Vmax与正常对照组比较明显下降，Km与正常组无差别。经过Y+L通道的Vmax与正常对照组比较无变化，Km升高。高血压组红细胞NOS生成量及NOS活性均降低。高血压时红细胞中的cGMP的含量也较正常人明显减少。结论：高血压时红细胞利用精氨酸生成一氧化氮的能力下降。
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[中图分类号]R544.1 [文献标识码]A
[文章编号]1000-1530(2000)06-0557-04
Change of L-Arg/NO system in erythrocytes of essential hypertension patients
ZU Hong，ZHOU Guo-Peng
(Department of Gerontology,Peking University First Hospital,Beijing 100034)
YAO Xing-Hai
(Department of Physiology,Capital University of Medical Science)
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TANG Chao-Shu
(Central Laboratory,Peking Universing First Hospital)
ABSTRACT Objective:To study the change of L-Arg/NO system in erythrocytes of essential hypertension patients.Methods:The 3H-L-Arg transport,NO synthase (NOS) production,NOS activity and the contents of cGMP were measured.Results:The Vmax for total transport of L-Arg via system Y+ deceased in erythrocytes of hypertension patients compared with control subjects,while the Vmax for the transport of L-Arg via system Y+L was unaffected in erythrocytes of hypertension patients.Km values for total L-Arg influx via Y+ system were not significantly different in erythrocytes in control or hypertension groups.The NOS activity produced and cGMP decreased significantly compared with those of the control and hypertension groups.Conclusion:The ability of erythrocytes utilizing L-Arg to produce NO is reduced when blood pressure rises.
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KEY WORDS Hypertension；Erythrocyte；Arginine/metab;Nitric oxide/metab
目前对高血压发病机制尚未完全阐明。已发现内皮细胞可以通过释放一些血管因子来调节血管张力，其中内皮细胞释放的内皮衍生舒张因子/一氧化氮(endothelium-derived relaxing factor/nitric oxide，EDRF/NO)具有维持血管张力，调节血压的作用。近来发现红细胞也有精氨酸/一氧化氮系统[1]，可以生成一氧化氮，具有调节自身及其周围组织生理功能的作用。目前对原发性高血压病人红细胞精氨酸/一氧化氮系统研究很少，本文通过观察高血压时红细胞膜精氨酸的转运、细胞内NOS活性、生成量的变化，探讨红细胞精氨酸/—氧化氮系统的改变在高血压发病学上的意义。
1 材料与方法
1.1 研究对象
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病例选择及分组：(1)原发高血压组 按WHO高血压诊断标准(收缩压≥140 mmHg，和/或舒张压≥90 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa)，选择14例原发性高血压病患者，按WHO分期，Ⅰ期6人，Ⅱ期8人，平均年龄(57.2±8.0)岁，其中男性12名，女性2名，均除外高脂血症、糖尿病、心肌梗死、心绞痛、脑血管病、原发性肾疾病等。平均动脉压(120.6±12.7) mmHg。(2)对照组 10名，体检身体健康的成年人10例，男7例，女3例，平均年龄(52.0±5.2) 岁，平均动脉压(86.5±6.4)mmHg。
1.2 红细胞采集及制备
晨起肘正中静脉取血5 ml，38 g.L-1枸椽酸钠(体积比1∶9)抗凝，离心(1 400×g，10 min)后去上清，再加入4倍体积的(mmol.L-1) NaCl 140；KCl 5；D-glucose 5；Mops10(pH7.4)，离心(4 ℃ 1 400×g，10 min)洗3次，吸去上清及上层淡黄色层，再重新离心洗3遍。之后红细胞悬浮于改良的Hank's平衡盐溶液中(MHBSS)(1 mmol.L-1，pH7.4)，取部分悬液用于红细胞计数。
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1.3 红细胞L-精氨酸转运
为了去除细胞内物质浓度变化通过跨膜刺激对跨膜转运的影响，将红细胞在无任何底物的环境中37 ℃孵育3 h，以达到零转运状态。在零转运状态下，可以通过用N-ethylmalmide(NEM)抑制Y+载体，从而将转运分为Y+和Y+L两种。将红细胞悬液用0.2 mmol.L-1NEM在25 ℃下抑制15 min，后用2-mercaptoethanol(10 mmol.L-1)终止反应。后将红细胞洗涤、沉淀，以供转运测定。
取1 ml MHBSS红细胞悬液(1×107 cells/ml)，放入成对的离心管中，分别加入不同浓度的3H-L-精氨酸(5～400 mol.L-1)，37 ℃孵育5 min，测量L-精氨酸的初始摄入。之后用冷等张溶液MgCl2 107；Mops 10(pH7.4)冲洗细胞，用0.1%(体积比)三硝基甲苯X-100 0.5 ml，超声10 s溶解细胞。用5%(体积比)三氯乙酸1 ml沉淀蛋白，之后用β-液闪烁计数仪测定放射活性。细胞悬液中的蛋白含量用改良的Micro-lowry法测定。经NEM处理后的红细胞[3H]-L-精氨酸摄入由Y+L系统介导，未被NEM抑制的[3H]-L-精氨酸摄入减去Y+L介导的摄入即可得Y+介导的摄入。
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1.4 红细胞NOS的提纯及NOS活性的测定
1.4.1 NOS提纯 将红细胞(5×107 cells)反复冻融及超声5 s溶解，离心，获得溶血产物，再加入50 mmol.L-1 Tris-HCl，取10 ml加入2 ml 2′，5′-ADP-agarose平衡缓冲液，孵育10 min后，经过加热柱提纯。NOS经过DEAE-BioGel A离子交换柱提取，再经过50 mmol.L-1 Tris-HCl，1 mmol.L-1DDT，120 mmol.L-1 NAC洗提。蛋白浓度用改良的micro-Lowry法测定，以牛血清白蛋白为标准。
1.4.2 NOS活性测定 在100 μl提纯的NOS(20 μg)中，加入0.5 mmol.L-1 NADPH，1.5 mol.L-1 CaCl2，50 μmol.L-1 Tetrahydr-bioptein，74×103 Bq[3H]-L-精氨酸，总容积120 ml，空白对照用MHSS代替，37 ℃孵育15 min，加入2 ml冷终止液30 mmol.L-1 HEPES，3 mmol.L-1 EDTA pH5.5，经Dowex AG 50W-X8(Ns+型)阳离子交换层析柱，4 ml水提取，加入闪烁液，用β-液闪烁计数仪测定[3H]-胍氨酸浓度。
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1.5 红细胞cGMP含量测定
红细胞悬液与0.1 mmol.L-1 L-精氨酸共同孵育30 min，22 900×g离心10 s，去上清，加入50 μ1乙醇，真空离心去除溶剂，红细胞重新悬浮于300 μ1缓冲液中，50 mmol.L-1 Tris-HCL，4 mmol.L-1 EDTA，pH7.5，振荡10 min，离心，取100 μl上清用放免法测cGMP。红细胞cGMP含量以每5×107红细胞中cGMP的量(pmol)表示。
1.6 统计学方法
实验结果以
±s表示，用非配对t检验，及相关回归进行统计学处理，以P<0.05为差异有显著性，以P<0.01为差异有极显著性。, http://www.100md.com
2 结果
2.1 原发性高血压患者一般情况
14例高血压患者的平均动脉压明显高于对照组[(120.6±12.7)mmHg比(86.5±6.4)mmHg，P<0.05]，但两组间年龄无明显区别[(57.2±8.0)岁比(52.0±5.2)岁，P>0.05]。
2.2 高血压时红细胞L-Arg的转运
从表1可以看到，红细胞膜L-Arg的转运呈高亲和型，高血压时红细胞L-Arg的总摄入的最大转运速率(Vmax)较正常对照组明显降低[每107细胞(3.64±0.14)nmol.min-1比(5.43±0.20)nmol.min-1，P<0.01]，但两组L-Arg转运的亲和力(Km)无差异。正常对照组通过Y+通道介导的最大转运速率为每107细胞(4.50±0.27)nmol.min-1，底物与载体的亲和力为(35.5±4.7)μm，高血压组Vmax明显下降为每107细胞(2.62±0.19)nmol.min-1，与正常对照组差异有显著性(P<0.001)，底物与载体的Km为(34.0±7.0)μm，与正常组差别无显著性，说明Y+通道介导的L-Arg转运在高血压时下降。比较Y+L通道的活性，发现在正常组及高血压组转运的Vmax差别没有显著性，而Km在高血压时是增加的。
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2.3 高血压红细胞NOS的活性及cGMP含量
高血压组红细胞NOS生成量及NOS活性都是降低的。每5×107细胞NOS生成量从正常时(0.540±0.016) mg protein降至(0.489±0.062) mg protein，两者比较P<0.01，NOS的活性也由正常时的每毫克蛋白(21.79±4.26) nmol.min-1，降至(10.99±2.73) nmol.min-1(P<0.001)。高血压时红细胞中的cGMP含量为每5×107细胞(0.168±0.047) pmol，较正常人的(0.234±0.046) pmol明显减少(P<0.05)。说明高血压时红细胞L-Arg/NO系统出现障碍，NO合成下降。
表1 正常组与高血压组红细胞3H-L-Arg转运特征
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(
±s,nmol.min-1*10-7 cell)Table 1 Kinetics of 3H-L-Arg transport in normal and essential hypertension erythrocyte
(
±s,nmol.min-1*10-7 cell) c(3H-L-Arg)/μmol.L-1
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Control (n=10)
EH (n=14)
Total influx
Y+L influx
Y+ influx
Total influx
Y+L influx
Y+ influx
5
0.74±0.10
0.17±0.03
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0.57±0.08
0.47±0.06*
0.13±0.03+
0.34±0.05*
10
1.24±0.12
0.25±0.03
0.99±0.10
0.83±0.13*
0.24±0.04
0.59±0.14*
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20
2.11±0.14
0.43±0.05
1.68±0.15
1.42±0.13*
0.43±0.04
1.00±0.13*
40
2.67±0.23
0.54±0.03
2.14±0.23
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1.88±0.085*
0.53±0.04
1.35±0.10*
80
3.47±0.35
0.67±0.06
2.19±0.31
2.44±0.26*
0.72±0.07
1.73±0.28*
100
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3.36±0.35
0.76±0.05
3.6±0.37
2.83±0.12*
0.79±0.06
2.04±0.15+
200
4.76±0.38
0.84±0.04
3.92±0.39
3.17±0.09*
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0.83±0.06
2.34±0.12*
300
5.11±0.29
0.92±0.03
4.19±0.28
3.39±0.09*
0.92±0.05
2.48±0.13*
400
5.16±0.21
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0.97±0.04
4.19±1.92
3.39±0.10*
0.93±0.66
2.46±0.13*
c,concentration;*EH vs control:P<0.001;+EH vs control，P<0.05.3 讨论
因为红细胞是人体中少数几种容易获得的细胞类型，所以可作为研究膜转运功能的有利工具。过去一直认为血红蛋白是NO的清除载体，所以限制了对红细胞NO系统的研究。最近在人类及一些动物模型中发现红细胞上也存在L-Arg/NO系统，也有合成NO的能力[1]。红细胞生成NO的生理作用目前还不是很清楚。通过对S-亚硝基血红蛋白转导NO的相关活动的机制研究，发现红细胞上的硫氢键(thiol)可以将红细胞上的NO转移到内皮细胞受体上，引起血管床的舒张[3]。红细胞通过释放NO还可以影响血小板的聚集功能[4]。
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红细胞L-Arg的转运已知包含3种方式(通过Y+、Y+L通道介导和弥散)，细胞内底物浓度的变化可影响转运的结果，本实验通过观察14例原发性高血压患者红细胞膜上L-Arg转运系统，发现细胞外L-Arg主要通过高亲和性非Na+依赖性Y+蛋白氨基酸载体转运到细胞内比例占总转运的70%，另30%为Y+L载体转运。实验观察到原发性高血压时红细胞摄取L-Arg的能力降低，表现为L-Arg浓度转运曲线下移，在相同浓度下，L-Arg总转运Vmax及Y+通道介导的转运Vmax较正常对照组明显下降33%及40%，还观察到红细胞L-Arg的转运速率与细胞外精氨酸浓度升高呈正比，当精氨酸浓度达到300 μmol.L-1后，转运速率不再升高。高血压时Y+通道与L-Arg的亲和力(Km)无改变。Y+L通道介导的运转Vmax与正常组无变化，Km略有增加。故可以认为Y+通道在原发性高血压者红细胞的L-Arg转运中起着决定性作用。实验还发现原发性高血压时红细胞NOS的生成量及NOS的活性下降，与正常对照组相比差异有显著性，最终导致红细胞中cGMP的生成量下降，表明NO的生成减少。已有报道发现在原发性高血压时血小板L-Arg-NO途径存在障碍[5]。
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在慢性肾功能衰竭及慢性心功能衰竭患者中，人们发现血浆中L-Arg的浓度下降[6]，而红细胞中L-Arg总的转运速率是升高的，认为这是一种代偿反应——当血浆L-Arg浓度降低时，增加转运速率以保持NO的产量。
目前已知，研究L-Arg的转运是探讨疾病时L-Arg/NO系统改变的重要环节，红细胞作为NO代谢过程中的“清除剂”，同时也在产生自己的NO，其L-Arg系统变化及这种变化的生理意义就更值得人们注意。另外，红细胞因其容易获得，所以可作为疾病发生、发展的一个有效监测窗口。
参考文献
1，Jubelin BC,Gierman JL.Erythrocytes may synthesize their own nitric oxide[J].Am J Hyperten,1996,9:1214-1219
, 百拇医药 2，Li J,Bonaventura C,Bonaventura J,et al.S-Nitrosohaemoglobin:a dynamic activity of blood involved in vascular control[J].Nature,1996,380:221-226
3，Stamler JS,Jaraki O,Osborne J,et al.Nitric oxide circulates in mammalian plasma primarily as an S-nitroso adduct of serum albumin[J].Proc Natl Acad Sci USA,1992，89:7674-7677
4，Chen LY,Mehta JL.Evidence for the presence of L-Arginine-Nitric oxide pathway in human red blood cells:Relevance in the effects of red blood cells on platelet function[J].Journal of Cardiovasc Pharmacol,1998,32:57-61
, 百拇医药
5，王 军，徐洪涛，姚兴海，等.高血压病人血小板L-精氨酸/一氧化氮系统的改变[J].高血压杂志,1998,6(1)：22-24
6，Mendes Ribeiro AC,Hanssen H,Kiessling K,et al.Transport of L-arginine and the nitric oxide inhibitor NG-monomethyl-L-arginine in human erythrocytes in chronic renal failure[J].Clinical Science,1997,93:57-64
7，Hanssen H,Brunini TMC,Conway M,et al.Increased L-arginine transport in human erythrocytes in chronic heart failure[J].Clin Sci,1997,94:43-48
收稿日期：1999-06-11, 百拇医药