毛细管电泳法检测多瘤抑制基因p16点突变
作者：袁小林 张秀林 葛凤霞 王小伟 栾凤云 靳艳 林炳承 周革
单位：袁小林 张秀林 葛凤霞 王小伟 栾凤云 周革(大连市肿瘤医院 116033)；靳艳 林炳承(中国科学院大连化学物理研究所)
关键词：
中华检验医学杂志000619 多瘤抑制基因(MTS-1/p16 )的突变、 缺失广泛存在于多种类型的肿瘤细胞中，对该基因的检测可为肿瘤的诊断提供参考。目前，大多采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术进行基因点突变的检测，此法存在着操作繁琐费时和非自动检测的弊端。我们将毛细管电泳(CE)技术应用于MTS-1基因突变的检测之中，并对该法检测MTS-1基因点突变的可行性进行了初步的验证。
一、材料
1.标本：MTS-1基因1，2外显子正常对照(北京医科大学病理学教研室提供)；乳腺组织标本取自我院1995～1998年病理科保存的蜡块包埋组织，所有标本均经临床病理学诊断为恶性乳腺肿瘤。
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2.试剂与仪器：蛋白酶K、Taq DNA聚合酶(Promega, 美国)，四甲基乙胺(日本)，FGENE EHD型PCR仪(英国)，高效毛细管电泳仪(Bio-Rad，美国)。
二、方法
1.DNA提取方法：石蜡包埋组织切片，置于55℃二甲苯中脱蜡。HE染色后，光学显微镜定位肿瘤细胞，在定位部加溶解液，刮下细胞并将其与溶解液混合，将混合物移入离心管中，加含PK溶解液，置55℃过夜。分别用氯乙烷和乙醇分离和沉淀DNA。
2.引物序列：引物1：1GCTGCGGAGAGGGGGAGAGCAG-GC，2GCGCTACCTGATTCCAATTC，280 bp；引物2：1 TCTGACCATTCTGTTCTCTC，2CTCAGCTTTGGAAGCTCTCA，385 bp；引物3：1 GATGTTCCACACATCTTTG，2ATGAAAACTACGAAAGCG-CGGG，189 bp。
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3.PAGE及硝酸银染色法：见参考文献[1]。
4.毛细管电泳：被检标本PCR产物，经漂洗除盐，和变性处理后与正常对照混合上样。毛细管(290 mm×0.75 mm)经包被处理，进样电压10 kV，进样时间4 s，运行电压4 kV，检测波长260 nm，运行温度25℃。结果判断：将被检毛细管电泳结果与正常对照比较，混合标本峰数，峰形与正常对照相同者为阴性；峰数增多或峰形与正常对照有差异者为阳性。
三、结果
1.PCR产物毛细管电泳检测结果：本项研究对40份乳腺癌标本进行了MTS-1基因工程3个外显子的PCR扩增，除3例无扩增产物外，其他标本扩增良好。37例标本中，1例1外显子突变，2例2外显子突变。1、2外显子突变率分别为2.43%(1/37)和5.40%(2/37)。
2.CE 法与PAGE法灵敏度比较：将1∶2 、1∶4 、 1∶8倍稀释的正常1外显子变性产物分别用2种不同方法电泳。从电泳图上看，CE法在1∶8 倍稀释时仍可见吸收峰，而PAGE法在1∶4倍稀释时，条带已模糊不清。
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3.CE法与PAGE法检测结果比较：37例乳腺癌标本MTS-1基因3个外显子共111个检测样品结果显示，2种检测方法的检测结果符合率为100%。
四、讨论
基因点突变的检测，以DNA单链构象多态性(SSCP)检测的应用最为广泛。Rossiter等认为，单链DNA的空间构型是其内部化学健的引力和外界温度平衡的结果，DNA的一级结构决定了分子内部的引力，一级结构的差异在适当的温度下会导致空间构型的不同，这样突变与正常的DNA单链在凝胶上有不同的泳动速率，从而使正常与突变的基因分离开来。采用PAGE电泳进行SSCP检测，存在着操作步骤多和检测结果易受银染色效果干扰影响判定的弊端。毛细管电泳是近年迅速发展起来的生物大分子分离分析技术，该技术主要应用于蛋白质、多肽等生物大分子的分离、分析之中。Orita等率先尝试用CE法进行SSCP检测获得较好结果，并证实CE法检测DNA的SSCP灵敏度取决于凝胶浓度、电泳运行温度和PCR产物的长度。本项研究选用10%甲酰胺和25℃条件下进行电泳，从本组结果看，此运行条件对MTS-1基因的3个外显子的SSCP检测具有一定的普适性。
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37份乳腺癌组织标本MTS-1基因突变的检测结果显示，MTS-1基因突变率为8.1%，表明该基因突变在乳腺癌中属非常见事件。另外，从变性PCR产物稀释标本的检测结果上看，CE法最低检出量明显低于 PAGE法，表明CE法的灵敏度优于PAGE法，然而111份标本2种方法的检测结果并无差异，其原因可能因乳腺癌MTS-1基因突变率较低，阳性例数少，CE法灵敏度的特点没能体现出来。 尽管该实验结果不能完全判定在SSCP检测上CE法优于PAGE法，两种方法的检测结果无差异，表明CE法用于MTS-1基因突变的检测是可行的。
参考文献
1，陈柏华，王秀琴，林晨. 中国人食管癌 P16基因突变分析. 中华遗传学杂志，1997，14：139.
(收稿日期：2000-03-01), http://www.100md.com
单位：袁小林 张秀林 葛凤霞 王小伟 栾凤云 周革(大连市肿瘤医院 116033)；靳艳 林炳承(中国科学院大连化学物理研究所)
关键词：
中华检验医学杂志000619 多瘤抑制基因(MTS-1/p16 )的突变、 缺失广泛存在于多种类型的肿瘤细胞中，对该基因的检测可为肿瘤的诊断提供参考。目前，大多采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术进行基因点突变的检测，此法存在着操作繁琐费时和非自动检测的弊端。我们将毛细管电泳(CE)技术应用于MTS-1基因突变的检测之中，并对该法检测MTS-1基因点突变的可行性进行了初步的验证。
一、材料
1.标本：MTS-1基因1，2外显子正常对照(北京医科大学病理学教研室提供)；乳腺组织标本取自我院1995～1998年病理科保存的蜡块包埋组织，所有标本均经临床病理学诊断为恶性乳腺肿瘤。
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2.试剂与仪器：蛋白酶K、Taq DNA聚合酶(Promega, 美国)，四甲基乙胺(日本)，FGENE EHD型PCR仪(英国)，高效毛细管电泳仪(Bio-Rad，美国)。
二、方法
1.DNA提取方法：石蜡包埋组织切片，置于55℃二甲苯中脱蜡。HE染色后，光学显微镜定位肿瘤细胞，在定位部加溶解液，刮下细胞并将其与溶解液混合，将混合物移入离心管中，加含PK溶解液，置55℃过夜。分别用氯乙烷和乙醇分离和沉淀DNA。
2.引物序列：引物1：1GCTGCGGAGAGGGGGAGAGCAG-GC，2GCGCTACCTGATTCCAATTC，280 bp；引物2：1 TCTGACCATTCTGTTCTCTC，2CTCAGCTTTGGAAGCTCTCA，385 bp；引物3：1 GATGTTCCACACATCTTTG，2ATGAAAACTACGAAAGCG-CGGG，189 bp。
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3.PAGE及硝酸银染色法：见参考文献[1]。
4.毛细管电泳：被检标本PCR产物，经漂洗除盐，和变性处理后与正常对照混合上样。毛细管(290 mm×0.75 mm)经包被处理，进样电压10 kV，进样时间4 s，运行电压4 kV，检测波长260 nm，运行温度25℃。结果判断：将被检毛细管电泳结果与正常对照比较，混合标本峰数，峰形与正常对照相同者为阴性；峰数增多或峰形与正常对照有差异者为阳性。
三、结果
1.PCR产物毛细管电泳检测结果：本项研究对40份乳腺癌标本进行了MTS-1基因工程3个外显子的PCR扩增，除3例无扩增产物外，其他标本扩增良好。37例标本中，1例1外显子突变，2例2外显子突变。1、2外显子突变率分别为2.43%(1/37)和5.40%(2/37)。
2.CE 法与PAGE法灵敏度比较：将1∶2 、1∶4 、 1∶8倍稀释的正常1外显子变性产物分别用2种不同方法电泳。从电泳图上看，CE法在1∶8 倍稀释时仍可见吸收峰，而PAGE法在1∶4倍稀释时，条带已模糊不清。
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3.CE法与PAGE法检测结果比较：37例乳腺癌标本MTS-1基因3个外显子共111个检测样品结果显示，2种检测方法的检测结果符合率为100%。
四、讨论
基因点突变的检测，以DNA单链构象多态性(SSCP)检测的应用最为广泛。Rossiter等认为，单链DNA的空间构型是其内部化学健的引力和外界温度平衡的结果，DNA的一级结构决定了分子内部的引力，一级结构的差异在适当的温度下会导致空间构型的不同，这样突变与正常的DNA单链在凝胶上有不同的泳动速率，从而使正常与突变的基因分离开来。采用PAGE电泳进行SSCP检测，存在着操作步骤多和检测结果易受银染色效果干扰影响判定的弊端。毛细管电泳是近年迅速发展起来的生物大分子分离分析技术，该技术主要应用于蛋白质、多肽等生物大分子的分离、分析之中。Orita等率先尝试用CE法进行SSCP检测获得较好结果，并证实CE法检测DNA的SSCP灵敏度取决于凝胶浓度、电泳运行温度和PCR产物的长度。本项研究选用10%甲酰胺和25℃条件下进行电泳，从本组结果看，此运行条件对MTS-1基因的3个外显子的SSCP检测具有一定的普适性。
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37份乳腺癌组织标本MTS-1基因突变的检测结果显示，MTS-1基因突变率为8.1%，表明该基因突变在乳腺癌中属非常见事件。另外，从变性PCR产物稀释标本的检测结果上看，CE法最低检出量明显低于 PAGE法，表明CE法的灵敏度优于PAGE法，然而111份标本2种方法的检测结果并无差异，其原因可能因乳腺癌MTS-1基因突变率较低，阳性例数少，CE法灵敏度的特点没能体现出来。 尽管该实验结果不能完全判定在SSCP检测上CE法优于PAGE法，两种方法的检测结果无差异，表明CE法用于MTS-1基因突变的检测是可行的。
参考文献
1，陈柏华，王秀琴，林晨. 中国人食管癌 P16基因突变分析. 中华遗传学杂志，1997，14：139.
(收稿日期：2000-03-01), http://www.100md.com