仪器法与纸片协同法检测超广谱β-内酰胺酶的结果比较
作者：周铁丽 戴美杰 池胜英 周武
单位：温州医学院附属第一医院检验科 325000
关键词：β-内酰胺酶类；大肠杆菌；克雷伯氏菌；肺炎
中华检验医学杂志000611 【摘要】 目的 了解VITEK-AMS 检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产超广谱β-内酰胺酶 (ESBLs)的可靠性，并调查本院这两种菌的产ESBLs情况。方法 用VITEK-AMS专用药敏卡GNS-506进行ESBLs检测，并以头孢曲松、头孢噻肟、头孢他啶和氨曲南为底物，用纸片协同试验作对照。结果 仪器检测 48株肺炎克雷伯菌中有24株ESBLs为阳性，用纸片协同法对照结果一致。检测102株大肠埃希菌中，仪器检出41株阳性，纸片协同法对照也为阳性，但仪器检测的61株阴性菌中，纸片协同法对照有19株为阳性。结论 VITEK-AMS检测本地区产ESBLs菌株尚可能存在一定的局限性，建议各地根据感染菌株的特点及三代头孢菌素的使用情况，用多种底物检测 ESBLs。
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Detection of extended-spectrum-β-lactamases with VITEK-AMS and double-disk synergy test
ZHOU Tieli DAI Meijie CHI Shengying
(Department of Clinical Laboratory, First Affiliated Hospital, Wenzhou Medical College, Wenzhou 325000, China)
【Abstract】 Objectives To investigate the reliability of VITEK-AMS for the detection of strains of E.coil and K.pneumoniae that produce ESBLs, and to determine the prevalence in our hospital of the two strains producing ESBLs.Method VITEK GNS-506 was used to detect ESBLs, and was compared with double-disk synergy test. Results Among 48 strains of K.pneumoniase detected using VITEK GNS-506, 24 strains were found to be ESBLs positive, and 24 strains ESBLs negative. The result was consistent with that of double-disk synergy test. Among 102 strains of E.coli detected using VITEK GNS-506, 41 strains were found to be ESBLs positive. The result was consistent with that of double-disk synergy tests. 61 strains were found to be ESBLs negative detected using VITEK GNS-506. Among them, 19 strains were found to be ESBLs positive.Conclusion Detection ESBLs using VITEK-AMS has some limitations in our area. Simple and reliable method should be used more with indicates for detection of ESBLs suitable for routine screening.
, 百拇医药
【Key words】 beta-lactamases;Escheri chia coli;Klebsiella pneumoniae
自1983年德国首次报道产超广谱β -内酰胺酶(ESBLs)的臭鼻克雷伯菌以后，国内外不断有ESBLs流行情况的报道[1，2]，由于ESBLs可通过质粒传递给其他细菌，易造成医院感染的暴发流行，成为革兰阴性菌耐药的最危险因素之一。因此，临床微生物实验室选择简便、可靠的方法检测产ESBLs的菌株非常重要。近年来，越来越多的医院引进了VITEK-AMS，其专用药敏卡可以检测产ESBLs的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，我们就VITEK-AMS对ESBLs的检测与纸片协同试验结果作一比较，现报道如下。
材料和方法
一、材料
1.菌株来源：为我院1999年6～12月临床分离的菌株，其中大肠埃希菌102株，肺炎克雷伯菌48株。
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2.仪器和试剂：细菌鉴定和药敏试验使用生物梅里埃公司的VITEK-AMS，鉴定卡为GNI+，药敏卡为GNS-506，均为生物梅里埃公司产品。
3.药敏纸片：头孢噻肟(30 μg)，头孢他啶(30 μg)，氨曲南(30 μg)，购自浙江省军区后勤检疫所；头孢曲松(30 μg)，阿莫西林 /棒酸(奥格门汀 20 μg/10 μg)，购自生物梅里埃公司。
4.MH琼脂：购自浙江省军区后勤检疫所。
二、方法
1.细菌培养和鉴定：细菌分离培养按照《全国临床检验操作规程》进行，用VITEK-AMS专用卡GNI+鉴定结果。
2.VITEK-AMS检测ESBLs：采用GNS-506专用药敏卡，严格按说明书操作，在仪器专家系统的判断下，自动给出被测菌是否为产ESBLs菌株。
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3.纸片协同试验：按文献报道[2，4]操作和判断结果。
结果
1.用VITEK—AMS与纸片协同试验两种方法检测大肠埃希菌和肺炎克雷菌产ESBLs情况，结果表明，仪器检测的48株肺炎克雷伯菌中，24株显示ESBLs阳性，用纸片法检测也为阳性，两者结果一致；仪器检测的102株大肠埃希菌中，41株显示ESBLs阳性，纸片法也为阳性；而61株仪器报告ESBLs阴性菌株中，用纸片法检测19株为阳性，42株为阴性。
2.药敏试验结果：纸片协同试验检测为ESBLs阳性的60株大肠埃希菌对4种底物的耐药性比较见表1。
表1 纸片协同法检测为ESBLs阳性的60株大肠埃希菌
对4种底物的耐药性比较 抗生素
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仪器法阳性
(41株)
仪器法阴性
(19株)
χ2
P值
R
I
S
R
I
S
头孢噻肟
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25
15
1
17
2
0
5.02
<0.05
头孢他啶
4
1
36
3
4
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12
<3.84
>0.05
氨曲南
7
21
13
13
4
2
15.4
<0.005
头孢曲松
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33
6
2
16
3
0
<3.84
>0.05
S：敏感，I：中介，R：耐药，I在统计学处理时视为敏感；χ2(P=0.05)=3.84，χ2(P=0.005)=7.88 从表1中可以看出，纸片协同法检测ESBLs阳性的60株大肠埃希菌中，仪器检测为阴性的菌株对氨曲南的耐药率明显高于仪器检测为阳性的菌株，经统计学处理有非常显著性差异P<0.005，对头孢噻肟的耐药率有显著性差异P<0.05，对其他两种底物耐药率无显著差异P>0.05。
, 百拇医药
3.不同底物对大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产ESBLs的检出情况如表2。
表2 4种底物对ESBLs的检出情况(%) 抗生素
大肠埃希菌(株)
肺炎克雷伯
菌(24株)
合计
(84)
仪器阴性(19)
仪器阳性(41)
头孢曲松
100.0
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100.0
92.0
97.6
头孢他啶
31.6
39.0
83.0
50.0
氨曲南
84.2
71.0
100.0
82.1
, 百拇医药
头孢噻肟
78.9
100.0
100.0
95.2
表2结果显示，本地区检测产ESBLs的大肠埃希菌最好的底物为头孢曲松，检出率为100%，头孢他啶最差，仅能检出约三分之一的菌株；检测产ESBLs的肺炎克雷伯菌，4种底物均显示较好的效果，以头孢噻肟和氨曲南最好，检出率为100%。对两种菌的总检出率以头孢曲松最高。
4.从纸片协同法结果来看，我院ESBLs的检出率大肠埃希菌为58.8%(60/102)，高于国内外有关报道[3，6]；肺炎克雷伯菌检出率为50%(24/24)，高于国内报道[3，5]，但比国外某些报道要低[6]，说明各地ESBLs流行情况有较大的差异。
, 百拇医药
讨论
1.对ESBLs检测方法国内外已有较多报道，国内文献报道，双纸片协同试验检测ESBLs的特异性为100%[2]，国外文献报道VITEK-AMS检测ESBLs的特异性为100%，敏感性为99.5%[3]。在我们的结果中，仪器检测显示ESBLs阴性的60株细菌，用纸片协同法对照发现19株阳性。在这19株菌中，除1株对头孢他啶的抑菌环直径为25 mm外，其余均符合NCCLS(1999)规定筛选检测方法的阳性标准[4]，与纸片协同法检测结果相符。这19株菌中有16株对头孢他啶敏感，3株菌在纸片扩散法中对4种底物均无抑菌环，可能由于产酶量过高或过低，使VITEK检测卡中含与不含棒酸的反应孔浊度比达不到仪器判断的标准而造成漏检，而纸片协同法可以通过调整纸片间的距离来解决这个问题。
2.从表1结果看，仪器检测为ESBLs阴性的19株大肠埃希菌对氨曲南的耐药率明显高于仪器检测为阳性的41株菌，按NCCLS筛选标准，对这批菌用氨曲南检测ESBLs的成功率要高于其他底物，可能VITEK检测卡中加入该底物，能提高对这批菌的检出率。另外，仪器法与纸片协同法检测结果不一致是否有其他原因，尚待进一步研究。
, 百拇医药
3.表2结果提示，头孢曲松为本院检测ESBLs的最佳底物，与国内报道[2]一致，与国外报道[3]头孢他啶为检测ESBLs的最佳底物不同。而且仪器检测阴性的大肠埃希菌在纸片协同法中，用头孢他啶和头孢噻肟为底物的检出率低于仪器检测阳性的菌株，这可能是这批菌在以头孢他啶和头孢噻肟为底物的检测卡上造成漏检的主要原因之一。在检测肺炎克雷伯菌产ESBLs的试验中，4种底物的检出效果均较好，因此，在仪器鉴定卡上不易漏检。
总结上述结论，我们认为，用现有的VITEK鉴定卡ESBLs可能存在待研究解决的问题。建议仪器厂家改进ESBLs检测药敏卡，如在检测卡中增加底物，或用头孢曲松和氨曲南替代头孢他啶作底物，以求更好的检出ESBLs。
参考文献
1，Emery CL, Weymouth LA. Detection and clinial significance of extended-spectrum beta-lactamases in a tertiary-care medical center. J Clin Microbiol, 1997, 35:2061-2067.
, 百拇医药
2，孙长贵，陈汉美，毅秉兴，等. 评价三种筛选方法检测超广谱β-内酰胺酶及其临床应用. 中华医学检验杂志，1999,22:228-231.
3，Sanders CC, Bany AL, Washington JA, et al. Detection of extended-spectrum-beta-lactamases-produceing members of the family Enterobacteriaceae with tehe vitek ESBL test. J Clin Microbiol,1996,34:2997-3001.
4，倪语星. 质粒介导的β-内酰胺酶的耐药性问题及检测. 中华医学检验杂志,1999,23:316-317.
5，吕火祥，刘建栋，沈蓓琼，等. 全自动细菌分析系统在检测超广谱β-内酰胺酶细菌中的临床应用. 中华医学检验杂志，1999，22:284-286.
6，Jacoby G A, Han P. Detection of extented-spectrum beta-lactamases in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli .J Clin Microbiol, 1996,34:908-911.
(收稿日期：2000-01-17), 百拇医药
单位：温州医学院附属第一医院检验科 325000
关键词：β-内酰胺酶类；大肠杆菌；克雷伯氏菌；肺炎
中华检验医学杂志000611 【摘要】 目的 了解VITEK-AMS 检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产超广谱β-内酰胺酶 (ESBLs)的可靠性，并调查本院这两种菌的产ESBLs情况。方法 用VITEK-AMS专用药敏卡GNS-506进行ESBLs检测，并以头孢曲松、头孢噻肟、头孢他啶和氨曲南为底物，用纸片协同试验作对照。结果 仪器检测 48株肺炎克雷伯菌中有24株ESBLs为阳性，用纸片协同法对照结果一致。检测102株大肠埃希菌中，仪器检出41株阳性，纸片协同法对照也为阳性，但仪器检测的61株阴性菌中，纸片协同法对照有19株为阳性。结论 VITEK-AMS检测本地区产ESBLs菌株尚可能存在一定的局限性，建议各地根据感染菌株的特点及三代头孢菌素的使用情况，用多种底物检测 ESBLs。
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Detection of extended-spectrum-β-lactamases with VITEK-AMS and double-disk synergy test
ZHOU Tieli DAI Meijie CHI Shengying
(Department of Clinical Laboratory, First Affiliated Hospital, Wenzhou Medical College, Wenzhou 325000, China)
【Abstract】 Objectives To investigate the reliability of VITEK-AMS for the detection of strains of E.coil and K.pneumoniae that produce ESBLs, and to determine the prevalence in our hospital of the two strains producing ESBLs.Method VITEK GNS-506 was used to detect ESBLs, and was compared with double-disk synergy test. Results Among 48 strains of K.pneumoniase detected using VITEK GNS-506, 24 strains were found to be ESBLs positive, and 24 strains ESBLs negative. The result was consistent with that of double-disk synergy test. Among 102 strains of E.coli detected using VITEK GNS-506, 41 strains were found to be ESBLs positive. The result was consistent with that of double-disk synergy tests. 61 strains were found to be ESBLs negative detected using VITEK GNS-506. Among them, 19 strains were found to be ESBLs positive.Conclusion Detection ESBLs using VITEK-AMS has some limitations in our area. Simple and reliable method should be used more with indicates for detection of ESBLs suitable for routine screening.
, 百拇医药
【Key words】 beta-lactamases;Escheri chia coli;Klebsiella pneumoniae
自1983年德国首次报道产超广谱β -内酰胺酶(ESBLs)的臭鼻克雷伯菌以后，国内外不断有ESBLs流行情况的报道[1，2]，由于ESBLs可通过质粒传递给其他细菌，易造成医院感染的暴发流行，成为革兰阴性菌耐药的最危险因素之一。因此，临床微生物实验室选择简便、可靠的方法检测产ESBLs的菌株非常重要。近年来，越来越多的医院引进了VITEK-AMS，其专用药敏卡可以检测产ESBLs的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，我们就VITEK-AMS对ESBLs的检测与纸片协同试验结果作一比较，现报道如下。
材料和方法
一、材料
1.菌株来源：为我院1999年6～12月临床分离的菌株，其中大肠埃希菌102株，肺炎克雷伯菌48株。
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2.仪器和试剂：细菌鉴定和药敏试验使用生物梅里埃公司的VITEK-AMS，鉴定卡为GNI+，药敏卡为GNS-506，均为生物梅里埃公司产品。
3.药敏纸片：头孢噻肟(30 μg)，头孢他啶(30 μg)，氨曲南(30 μg)，购自浙江省军区后勤检疫所；头孢曲松(30 μg)，阿莫西林 /棒酸(奥格门汀 20 μg/10 μg)，购自生物梅里埃公司。
4.MH琼脂：购自浙江省军区后勤检疫所。
二、方法
1.细菌培养和鉴定：细菌分离培养按照《全国临床检验操作规程》进行，用VITEK-AMS专用卡GNI+鉴定结果。
2.VITEK-AMS检测ESBLs：采用GNS-506专用药敏卡，严格按说明书操作，在仪器专家系统的判断下，自动给出被测菌是否为产ESBLs菌株。
, 百拇医药
3.纸片协同试验：按文献报道[2，4]操作和判断结果。
结果
1.用VITEK—AMS与纸片协同试验两种方法检测大肠埃希菌和肺炎克雷菌产ESBLs情况，结果表明，仪器检测的48株肺炎克雷伯菌中，24株显示ESBLs阳性，用纸片法检测也为阳性，两者结果一致；仪器检测的102株大肠埃希菌中，41株显示ESBLs阳性，纸片法也为阳性；而61株仪器报告ESBLs阴性菌株中，用纸片法检测19株为阳性，42株为阴性。
2.药敏试验结果：纸片协同试验检测为ESBLs阳性的60株大肠埃希菌对4种底物的耐药性比较见表1。
表1 纸片协同法检测为ESBLs阳性的60株大肠埃希菌
对4种底物的耐药性比较 抗生素
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仪器法阳性
(41株)
仪器法阴性
(19株)
χ2
P值
R
I
S
R
I
S
头孢噻肟
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25
15
1
17
2
0
5.02
<0.05
头孢他啶
4
1
36
3
4
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12
<3.84
>0.05
氨曲南
7
21
13
13
4
2
15.4
<0.005
头孢曲松
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33
6
2
16
3
0
<3.84
>0.05
S：敏感，I：中介，R：耐药，I在统计学处理时视为敏感；χ2(P=0.05)=3.84，χ2(P=0.005)=7.88 从表1中可以看出，纸片协同法检测ESBLs阳性的60株大肠埃希菌中，仪器检测为阴性的菌株对氨曲南的耐药率明显高于仪器检测为阳性的菌株，经统计学处理有非常显著性差异P<0.005，对头孢噻肟的耐药率有显著性差异P<0.05，对其他两种底物耐药率无显著差异P>0.05。
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3.不同底物对大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产ESBLs的检出情况如表2。
表2 4种底物对ESBLs的检出情况(%) 抗生素
大肠埃希菌(株)
肺炎克雷伯
菌(24株)
合计
(84)
仪器阴性(19)
仪器阳性(41)
头孢曲松
100.0
, http://www.100md.com
100.0
92.0
97.6
头孢他啶
31.6
39.0
83.0
50.0
氨曲南
84.2
71.0
100.0
82.1
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头孢噻肟
78.9
100.0
100.0
95.2
表2结果显示，本地区检测产ESBLs的大肠埃希菌最好的底物为头孢曲松，检出率为100%，头孢他啶最差，仅能检出约三分之一的菌株；检测产ESBLs的肺炎克雷伯菌，4种底物均显示较好的效果，以头孢噻肟和氨曲南最好，检出率为100%。对两种菌的总检出率以头孢曲松最高。
4.从纸片协同法结果来看，我院ESBLs的检出率大肠埃希菌为58.8%(60/102)，高于国内外有关报道[3，6]；肺炎克雷伯菌检出率为50%(24/24)，高于国内报道[3，5]，但比国外某些报道要低[6]，说明各地ESBLs流行情况有较大的差异。
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讨论
1.对ESBLs检测方法国内外已有较多报道，国内文献报道，双纸片协同试验检测ESBLs的特异性为100%[2]，国外文献报道VITEK-AMS检测ESBLs的特异性为100%，敏感性为99.5%[3]。在我们的结果中，仪器检测显示ESBLs阴性的60株细菌，用纸片协同法对照发现19株阳性。在这19株菌中，除1株对头孢他啶的抑菌环直径为25 mm外，其余均符合NCCLS(1999)规定筛选检测方法的阳性标准[4]，与纸片协同法检测结果相符。这19株菌中有16株对头孢他啶敏感，3株菌在纸片扩散法中对4种底物均无抑菌环，可能由于产酶量过高或过低，使VITEK检测卡中含与不含棒酸的反应孔浊度比达不到仪器判断的标准而造成漏检，而纸片协同法可以通过调整纸片间的距离来解决这个问题。
2.从表1结果看，仪器检测为ESBLs阴性的19株大肠埃希菌对氨曲南的耐药率明显高于仪器检测为阳性的41株菌，按NCCLS筛选标准，对这批菌用氨曲南检测ESBLs的成功率要高于其他底物，可能VITEK检测卡中加入该底物，能提高对这批菌的检出率。另外，仪器法与纸片协同法检测结果不一致是否有其他原因，尚待进一步研究。
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3.表2结果提示，头孢曲松为本院检测ESBLs的最佳底物，与国内报道[2]一致，与国外报道[3]头孢他啶为检测ESBLs的最佳底物不同。而且仪器检测阴性的大肠埃希菌在纸片协同法中，用头孢他啶和头孢噻肟为底物的检出率低于仪器检测阳性的菌株，这可能是这批菌在以头孢他啶和头孢噻肟为底物的检测卡上造成漏检的主要原因之一。在检测肺炎克雷伯菌产ESBLs的试验中，4种底物的检出效果均较好，因此，在仪器鉴定卡上不易漏检。
总结上述结论，我们认为，用现有的VITEK鉴定卡ESBLs可能存在待研究解决的问题。建议仪器厂家改进ESBLs检测药敏卡，如在检测卡中增加底物，或用头孢曲松和氨曲南替代头孢他啶作底物，以求更好的检出ESBLs。
参考文献
1，Emery CL, Weymouth LA. Detection and clinial significance of extended-spectrum beta-lactamases in a tertiary-care medical center. J Clin Microbiol, 1997, 35:2061-2067.
, 百拇医药
2，孙长贵，陈汉美，毅秉兴，等. 评价三种筛选方法检测超广谱β-内酰胺酶及其临床应用. 中华医学检验杂志，1999,22:228-231.
3，Sanders CC, Bany AL, Washington JA, et al. Detection of extended-spectrum-beta-lactamases-produceing members of the family Enterobacteriaceae with tehe vitek ESBL test. J Clin Microbiol,1996,34:2997-3001.
4，倪语星. 质粒介导的β-内酰胺酶的耐药性问题及检测. 中华医学检验杂志,1999,23:316-317.
5，吕火祥，刘建栋，沈蓓琼，等. 全自动细菌分析系统在检测超广谱β-内酰胺酶细菌中的临床应用. 中华医学检验杂志，1999，22:284-286.
6，Jacoby G A, Han P. Detection of extented-spectrum beta-lactamases in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli .J Clin Microbiol, 1996,34:908-911.
(收稿日期：2000-01-17), 百拇医药