人肝细胞癌中整合素α5、β1 亚基和纤维连接蛋白mRNAs的表达
作者：赵景民 翟为溶 张月娥 周筱梅 朱虹光 张锦生
单位：200032 上海医科大学病理学教研室[赵景民(100039 解放军第三○二医院病理科)、翟为溶、张月娥、朱虹光、张锦生]，上海市肿瘤研究所癌基因及其相关基因国家重点实验室(周筱梅)
关键词：肝肿瘤；细胞外基质蛋白类；胞间粘附分子；RNA，信使；转录，遗传
中华病理学杂志980204 【摘要】 目的 研究肝细胞癌(HCC)中整合素α5、β1亚基和纤维连接蛋白(FN) mRNAs表达的生物学意义。方法 应用Northern印迹杂交和核酸原位杂交技术，对15例HCC癌组织、5例癌旁肝硬化和3例正常肝组织中整合素α5、β1 亚基和FN mRNAs表达作杂交分析。结果 高分化HCC癌组织中三种mRNAs表达水平与癌旁及正常肝组织相近，而低、中分化HCC癌组织内明显减少，甚至消失(分别P<0.01)；整合素α5 亚基和FN mRNAs主要见于癌细胞胞浆内；HCC伴肝内浸润和/或转移组癌组织内三种mRNAs水平较无浸润转移组显著下降(P<0.05)；5例伴肝内转移的HCC癌组织中FN mRNA呈异质性表达。结论 HCC中整合素α5、β1 和FN蛋白的表达变化系癌细胞基因转录水平下调的结果，可能与HCC细胞分化、浸润和转移相关；异质性FN mRNA及其编码的FN蛋白可能在HCC转移中有意义。
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Expression of integrin α5,β1 subunit and fibronectin mRNAs in human hepatocellular carcinoma Zhao Jingmin, Zhai Weirong, Zhang Yue′e, et al. Department of Pathology, Shanghai Medical University, Shanghai 200032
【Abstract】 Objective To sutdy the biologic significance of the expression of integrin α5, β1 subunit and fibronectin (FN) mRNAs in hepatocellular carcinoma (HCC). Methods Integrin α5,β1 subunit and FN mRNAs were detected by using Northern blot (α-32P-labeled cDNA probes) and in situ hybridization (Dig-labeled cDNA probes) in 15 cases of HCC, 5 cases of paracancerous cirrhotic liver and 3 cases of normal liver tissue. Results In well-differentiated HCC, the level of integrin α5, β1 or FN mRNA expression was similar to those in normal liver and paracancerous cirrhotic liver tissues, but was markedly decreased, even absent in the poorly-and moderatedly-differentiated HCC tissues (P<0.01, respectively). The expression of integrin α5 and FN mRNAs was mainly detected in the cytoplasm of HCC cells. In all the HCC cases tested, the expression of integrin α5,β1 and FN mRNAs was lower in 8 cases of HCC with focal invasion and/or intrahepatic metastasis than that in the others without invasion or metastasis(P<0.05). In addition, the heterogeneous expression of FN mRNA was found in 5 cases of HCC with intrahepatic metastasis. Conclusions Combined with the immunohistochemical observation before, it might be deduced that the changes of integrin α5β1 and FN protein expression in HCC tissues are because of changing of the mRNA levels related, which might deeply influence the cell differentiation, tumour invasion and metastasis of HCC. The appearance of the heterogeneous FN mRNA and its encoded FN protein might be associated with the development of HCC metastasis.
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【Key words】 Liver neoplasms Extracellular matrix proteins Intercellular adhesion molecule-1 RNA, messenger Transcription, genetic
从蛋白水平对人体肝细胞癌(HCC)组织中整合素α5、β1和纤维连接蛋白(fibronectin,FN)定位和定量观察显示，两种蛋白表达的变化可能与HCC分化、浸润及转移关系密切[1] 。鉴于HCC中整合素α5、β1 亚基和FN基因转录方面的研究少见，我们应用Northern印迹杂交和核酸原位杂交技术作HCC及癌旁肝组织中整合素α5、β1 亚基和FN mRNAs表达的研究，旨在从分子生物学角度探讨其基因转录水平的变化在HCC生物学特性中的意义。
材料与方法
1.标本来源、处理及分组：15例HCC癌组织、5例癌旁肝硬化组织(3例活动性，2例非活动性)和3例正常肝组织(肝血管瘤远离部位)取自我校中山医院1994年4月～1995年6月手术切除标本，取一份于干冰-异戊烷内速冻后，-70℃保存抽提RNA用；一份入10%缓冲福马林固定，常规石蜡包埋后，连续切片，作核酸原位杂交及HE染色。在15例HCC中，高、中和低分化组各5例。另据有、无镜下肝内浸润和转移，将HCC分成两组：HCC伴肝内浸润和/或转移组8例；无肝内浸润转移组7例。
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2.Northern印迹杂交：按Chomczynski等[2]方法抽提组织总RNA，所得RNA样品各取15 μg，经甲醛变性凝胶电泳后作Northern印迹转膜。用α-32P-dCTP 随机引物法标记α5 、β1 cDNA探针(长度分别为3.1kb和3.0kb，重组质粒由美国Ruoslahti E教授馈赠[3]，所制备探针鉴定见图1)和FN cDNA探针(探针长度1.4kb，Gibco BRL公司)作Northern印迹杂交[4]。杂交膜片经去除目的杂交探针处理后，用同位素标记的磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH) cDNA探针(中科院细胞生物研究所提供)再次杂交作阳性参照。
注：M：标准分子量(λ DNA/Hind Ⅲ)，1：α5重组质粒，2：α5重组质粒酶切片段，3：α5 cDNA探针，4：β1 cDNA探针，5：β1重组质粒酶切片段，6：β1重组质粒图1 整合素α5、β1 cDNA探针酶切鉴定
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3.核酸原位杂交：以随机引物法Dig标记整合素α5 cDNA探针(0.9 kb，Gibco BRL公司)和FN cDNA探针(同上)，用漂片法作原位杂交。主要步骤为：石蜡切片厚8 μm，用新鲜二甲苯及酒精脱蜡水化，4%多聚甲醛，0.1 mol/L PBS后固定。依次入0.1 mol/L PBS(pH7.2)、含0.1 mol/L甘氨酸的0.1 mol/L PBS、含0.4% Triton X-100的0.1 mol/L PBS漂洗。1.5 μg/ml蛋白酶K，37℃孵育30分钟，含4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS 5分钟，0.1 mol/L PBS洗片后入0.25%乙酸酐(0.1 mol/L三乙醇胺配制)10分钟， 2×SSC 10分钟，将切片移入杂交液(50%去离子甲酰胺，0.1% 十二烷基肌氨酸、0.02% SDS、0.2% Blocking Reagent和250 g/ml变性鲑鱼精 DNA)，杂交液内探针浓度均为0.5 μg/ml，42℃，振荡杂交16小时。切片经梯度SSC和0.05 mol/L PBS漂洗后，加AP标记的抗Dig抗体Fab片段(浓度1∶800)，37℃，40分钟，室温1小时，分别用TSM1液(0.1 mol/L pH8.0 Tris-HCl、0.1 mol/L NaCl、10 mmol/L MgCl2 )和TSM2液(0.1 mol/L pH9.5 Tris-HCl、0.1 mol/L NaCl、50 mmol/L MgCl2 )漂洗，NBT/BCIP显色，裱片后，恒温箱干燥，二甲苯透明，中性树胶封片，阳性杂交信号为蓝色颗粒。设阴性对照：(1)25 μg/ml RNA酶预处理切片后杂交；(2)无探针杂交。
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4.图像分析及统计学处理：采用MIAS-300图像分析系统及TJTY-300(同济太阳公司)图像分析软件，对Northern印迹杂交后X光片上的杂交信号作面积和平均光密度测定，并用同一样品的GAPDH阳性信号值加以校正。计算公式为：阳性信号校正指数=样品阳性信号面积×样品阳性信号灰度值/GAPDH阳性信号面积×GAPDH样品阳性信号灰度值。参照以前的免疫组化定量方法[1]，测定整合素α5 和FN mRNAs原位杂交阳性指数(positive index，PI)。采用方差分析作统计学处理。
结果
1.整合素α5 、β1和FN mRNAs表达的Northern印迹杂交结果：整合素α5 mRNA位于28S稍后4.9 kb处呈一阳性条带(图2)；整合素β1 mRNA 在28S前4.2 kb处呈一阳性条带(图3)；FN mRNA主要在28S后8 kb处呈一阳性条带，但5例HCC组织除8 kb处外，在5 kb处可见另一清晰的阳性条带(图4)。HCC癌组织中整合素α5 、β1和FN mRNAs表达水平因分化程度而异(图5)。低、中分化组整合素α5 、β1和FN mRNAs含量均值皆明显低于高分化组及癌旁和正常对照组(分别P<0.01)，而后两组间无显著性差异。低分化组与癌旁和正常对照组比较，整合素α5 、β1 和FN mRNAs下降幅度分别为86.5%、60.3%和90.8%。HCC伴肝内浸润和/或转移组三种mRNAs表达水平均明显低于不伴肝内浸润转移组(分别P<0.05)。 此外，Northern印迹杂交显示5例 HCC组织在5kb位置FN mRNA呈异质性表达，组织学观察发现该5例HCC虽然分化程度不同(2例高分化和3例低分化)，但均有肝内门静脉内癌栓形成。
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H：高分化，M：中分化，L：低分化，C：癌旁肝组织
图2 HCC、癌旁肝硬化及正常肝组织整合素
α5 mRNA Northern印迹杂交结果
H：高分化，M：中分化，L：低分化，C：癌旁肝，N：正常肝
图3 HCC、癌旁肝硬化及正常肝组织整合素
β1 mRNA Northern印迹杂交结果
H：高分化，M：中分化，L：低分化，C：癌旁肝，N：正常肝
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图4 HCC、癌旁肝硬化及正常肝组织整合素
FN mRNA Northern印迹杂交结果
2.整合素α5 和FN mRNAs表达的原位杂交结果：正常肝组织中表达较高水平的整合素α5和FN mRNAs，两者杂交信号阳性肝细胞分布基本相似，于肝小叶内呈散在分布，小叶周边区略多于中央区。少数肝血窦壁细胞亦表达α5和FN mRNAs。癌旁肝硬化组织内，除再生结节中部分肝细胞表达整合素α5和FN mRNAs外，于活动性间隔内可见较多FN mRNA阳性梭形细胞，其中部分细胞连续切片显示亦表达整合素α5 mRNA。HCC组织内整合素α5 和FN mRNAs表达基本一致。其杂交阳性信号主要位于HCC细胞胞浆内，少数间质细胞和血管内皮细胞也见整合素α5 和FN mRNAs表达。整合素α5和FN mRNAs表达因癌组织分化程度而异(附表)。高分化HCC中整合素α5和FN mRNAs阳性癌细胞数及阳性强度与正常及癌旁肝细胞相近(图6)，而低、中分化组两者表达明显减弱(图7)，与正常及癌旁肝组织PI均值比较分别P<0.05，甚至仅见个别阳性癌细胞。
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附表 原位杂交检测不同分化程度HCC中整合素α5和
FN mRNA表达水平(PI值，
±s) 组 别
整合素α5 mRNA
FN mRNA
癌旁和正常
5.6±1.0
6.4±1.7
高分化
4.8±0.8
5.7±1.1
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中分化
2.4±0.6
2.9±0.5
低分化
0.7±0.2
1.0±0.4
注：中、低分化HCC组分别与正常和癌旁组、高分化HCC组比较，均P<0.01，中、低分化HCC组间比较P<0.01
图5 整合素α5、β1亚基和FN mRNA的含量变化情况
, 百拇医药 图6 高分化HCC中见较多整合素α5 mRNA杂交阳性细胞
原位杂交×200
图7 低分化HCC中见个别整合素α5 mRNA阳性
细胞癌细胞 原位杂交×400
定量分析还显示，15例HCC中8例伴肝内浸润和/或转移者，其原发灶内整合素α5 mRNA(1.6±0.3)和 FN mRNA (2.1±0.7)表达水平明显低于无浸润转移组(α5 mRNA 4.2±0.9，FN mRNA5.0±1.0)，两组PI均值比较P<0.05。
讨论
1.整合素α5和FN mRNAs表达变化与HCC细胞分化的关系：FN是一种重要的细胞表面糖蛋白。研究发现，FN通过细胞膜受体整合素α5、β1 等参与细胞粘附、形态维持、生长控制、信息传递以及细胞分化等多种生物学过程。近年来，整合素及其配体蛋白对肿瘤多种生物学特性的重要性已初露端倪。观察已发现，FN及其受体整合素α5、β1表达水平随着HCC细胞分化程度的减低而减少，而高分化HCC细胞中两种蛋白表达则与正常及癌变肝组织相近[1]。有关乳腺癌、结肠癌和胰腺癌等的研究报道也显示了相似的结果[5，6]。虽然目前FN及其受体表达在某些肿瘤的变化已获得一些证据，但迄今为止有关其蛋白水平改变的分子生物学机制尚不清楚。我们研究显示，高分化HCC中α5 、β1和FN mRNAs表达水平与正常及癌旁肝组织相近，而中、低分化HCC组织中三种mRNAs表达均减少，甚至难以检测到(分别P<0.05)。原位杂交证实，中、低分化 HCC中整合素α5、β1和FN mRNAs表达水平的下调主要系HCC细胞本身所致，而癌组织内间质细胞变化不明显。结果表明：不同分化程度HCC细胞整合素α5、β1 和FN mRNAs表达水平的变化与蛋白水平的改变相平行，提示整合素α5β1和FN蛋白表达的减少主要是其相应基因转录水平下调的结果。结果还显示，低分化HCC中整合素α5和FN mRNAs下调幅度大于整合素β1mRNA，造成整合素α5 、β1亚基转录水平不平衡的原因可能与HCC组织中尚表达其它含β1亚基的整合素受体有关，至于两个整合素亚基间及受、配体间合成的调节机制有待进一步研究。
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2.整合素α5 、β1和FN mRNAs表达变化与HCC浸润和转移的关系：肿瘤浸润和转移被认为是某些基因表达改变的累积后果。Hynes曾提出了针对细胞外基质(ECM)成份的细胞粘附受体的缺失影响肿瘤浸润和转移能力的假说[7]。我们以前的观察结果已提示，整合素蛋白水平的改变可能影响HCC的浸润和转移行为。最近Fearon等[8]发现，70%的直肠癌中编码神经细胞粘附分子的基因缺失或突变。本文结果显示：HCC伴肝内浸润和/或转移组原发灶内整合素α5和FN mRNAs 转录水平低于无肝内浸润和转移组(P<0.05)；HCC浸润部位癌细胞中整合素α5和FN mRNAs杂交阳性信号弱于非浸润部位，甚至难以检测到阳性信号。该结果与我们以前的免疫组化检测结果一致。表明HCC中整合素α5、β1和FN mRNAs表达变化与HCC浸润和转移生物学行为密切相关，FN其受体转录及翻译水平的下调可能意味着HCC细胞浸润和转移潜能的增高。
3.FN mRNA异质性表达与HCC生物学特性的关系：FN是由单一或最多两对外显子所编码的蛋白质，最近对FN基因序列分析发现，由于前mRNA在三个不同部位的选择性拼接不同，单一的FN基因能够编码20余种不同的FN异质体，而且这些FN异质体具有一定的组织细胞特异性。在人体肝癌中可以出现相对特异的FN mRNA表达[9]。我们应用Northern印迹杂交发现，5例HCC组织除在公认的28S后8kb处呈阳性杂交带外，并在5kb左右的位置呈现清晰的异常FN mRNA阳性信号带，结合组织学观察，该5例HCC均发生肝内门静脉癌栓形成，提示5kb位置的异质性mRNA可能编码结构及功能异常的瘤性FN蛋白，从而影响HCC细胞间以及HCC细胞与ECM间的粘附乃至信号传递作用，这在HCC细胞生长，尤其是浸润转移生物学行为中可能具有某些意义。
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4.有关HCC细胞合成FN和整合素α5、β1 的问题：关于FN的来源，体外培养已发现肝细胞具有合成血浆型FN的能力[10]，至于细胞表面及ECM中的FN可能源自血管内皮细胞，成纤维细胞，单核细胞及其它间质细胞。某些HCC细胞系在体外具有合成和分泌FN的能力，但有关体内肝细胞及HCC细胞合成FN的文献报道多限于免疫组化观察结果。我们采用原位杂交技术，观察到体内部分肝细胞及血窦壁细胞表达FN和整合素α5 mRNA，证明这些细胞具有合成FN及其受体的能力。值得注意的是，高分化HCC细胞能够表达与正常及癌旁肝组织相近的FN和整合素α5 mRNAs，表明体内HCC细胞是肝癌组织中主要的FN来源细胞。同时还发现肝硬化活动性间隔内多数梭形间质细胞呈FN mRNA强阳性杂交信号，部分细胞可见整合素α5 mRNA表达，提示这些间隔细胞在FN等ECM合成中可能具有重要作用，这在肝硬化的发生机制中可能有意义。
本课题为“九五”国家攻关项目课题(编号96-906-01-15)并受美国中华医学基金会基金资助(基金编号85838)
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参考文献
1 赵景民, 翟为溶, 张月娥, 等.肝细胞癌整合蛋白α5 β1、纤维连接蛋白及其降解片段的表达.中华病理学杂志, 1997, 26：65-69.
2 Chomczynski P, Sacchi N. Singlestep method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987, 162：156-159.
3 Giancotti F,Ruoslahti E. Elevated levels of the α5 β1fibronectin receptor suppress the transformed phenotype of chinese hamster ovary cells. Cell, 1990, 60：849-859.
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4 Cervella P, Silenge L, Pastore C, et al. Human beta-integrin gene expression is regulated by two promoter regions. J Biol Chem, 1993, 268：5148-5155.
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9 Ogama F, Hirohashi S, Shimosato Y, et al. Deregulation of alternative splicing of fibronectin pre-mRNA in malignant human liver tumors. J Biol Chem, 1989, 264：10331-10334.
10 Tamkun JW,Hynes RO. Plasma fibronectin is synthesized and secreted by hepatocytes. J Biol Chem, 1983, 258：4641-4647.
(收稿：1997-05-19 修回：1997-10-06), http://www.100md.com
单位：200032 上海医科大学病理学教研室[赵景民(100039 解放军第三○二医院病理科)、翟为溶、张月娥、朱虹光、张锦生]，上海市肿瘤研究所癌基因及其相关基因国家重点实验室(周筱梅)
关键词：肝肿瘤；细胞外基质蛋白类；胞间粘附分子；RNA，信使；转录，遗传
中华病理学杂志980204 【摘要】 目的 研究肝细胞癌(HCC)中整合素α5、β1亚基和纤维连接蛋白(FN) mRNAs表达的生物学意义。方法 应用Northern印迹杂交和核酸原位杂交技术，对15例HCC癌组织、5例癌旁肝硬化和3例正常肝组织中整合素α5、β1 亚基和FN mRNAs表达作杂交分析。结果 高分化HCC癌组织中三种mRNAs表达水平与癌旁及正常肝组织相近，而低、中分化HCC癌组织内明显减少，甚至消失(分别P<0.01)；整合素α5 亚基和FN mRNAs主要见于癌细胞胞浆内；HCC伴肝内浸润和/或转移组癌组织内三种mRNAs水平较无浸润转移组显著下降(P<0.05)；5例伴肝内转移的HCC癌组织中FN mRNA呈异质性表达。结论 HCC中整合素α5、β1 和FN蛋白的表达变化系癌细胞基因转录水平下调的结果，可能与HCC细胞分化、浸润和转移相关；异质性FN mRNA及其编码的FN蛋白可能在HCC转移中有意义。
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Expression of integrin α5,β1 subunit and fibronectin mRNAs in human hepatocellular carcinoma Zhao Jingmin, Zhai Weirong, Zhang Yue′e, et al. Department of Pathology, Shanghai Medical University, Shanghai 200032
【Abstract】 Objective To sutdy the biologic significance of the expression of integrin α5, β1 subunit and fibronectin (FN) mRNAs in hepatocellular carcinoma (HCC). Methods Integrin α5,β1 subunit and FN mRNAs were detected by using Northern blot (α-32P-labeled cDNA probes) and in situ hybridization (Dig-labeled cDNA probes) in 15 cases of HCC, 5 cases of paracancerous cirrhotic liver and 3 cases of normal liver tissue. Results In well-differentiated HCC, the level of integrin α5, β1 or FN mRNA expression was similar to those in normal liver and paracancerous cirrhotic liver tissues, but was markedly decreased, even absent in the poorly-and moderatedly-differentiated HCC tissues (P<0.01, respectively). The expression of integrin α5 and FN mRNAs was mainly detected in the cytoplasm of HCC cells. In all the HCC cases tested, the expression of integrin α5,β1 and FN mRNAs was lower in 8 cases of HCC with focal invasion and/or intrahepatic metastasis than that in the others without invasion or metastasis(P<0.05). In addition, the heterogeneous expression of FN mRNA was found in 5 cases of HCC with intrahepatic metastasis. Conclusions Combined with the immunohistochemical observation before, it might be deduced that the changes of integrin α5β1 and FN protein expression in HCC tissues are because of changing of the mRNA levels related, which might deeply influence the cell differentiation, tumour invasion and metastasis of HCC. The appearance of the heterogeneous FN mRNA and its encoded FN protein might be associated with the development of HCC metastasis.
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【Key words】 Liver neoplasms Extracellular matrix proteins Intercellular adhesion molecule-1 RNA, messenger Transcription, genetic
从蛋白水平对人体肝细胞癌(HCC)组织中整合素α5、β1和纤维连接蛋白(fibronectin,FN)定位和定量观察显示，两种蛋白表达的变化可能与HCC分化、浸润及转移关系密切[1] 。鉴于HCC中整合素α5、β1 亚基和FN基因转录方面的研究少见，我们应用Northern印迹杂交和核酸原位杂交技术作HCC及癌旁肝组织中整合素α5、β1 亚基和FN mRNAs表达的研究，旨在从分子生物学角度探讨其基因转录水平的变化在HCC生物学特性中的意义。
材料与方法
1.标本来源、处理及分组：15例HCC癌组织、5例癌旁肝硬化组织(3例活动性，2例非活动性)和3例正常肝组织(肝血管瘤远离部位)取自我校中山医院1994年4月～1995年6月手术切除标本，取一份于干冰-异戊烷内速冻后，-70℃保存抽提RNA用；一份入10%缓冲福马林固定，常规石蜡包埋后，连续切片，作核酸原位杂交及HE染色。在15例HCC中，高、中和低分化组各5例。另据有、无镜下肝内浸润和转移，将HCC分成两组：HCC伴肝内浸润和/或转移组8例；无肝内浸润转移组7例。
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2.Northern印迹杂交：按Chomczynski等[2]方法抽提组织总RNA，所得RNA样品各取15 μg，经甲醛变性凝胶电泳后作Northern印迹转膜。用α-32P-dCTP 随机引物法标记α5 、β1 cDNA探针(长度分别为3.1kb和3.0kb，重组质粒由美国Ruoslahti E教授馈赠[3]，所制备探针鉴定见图1)和FN cDNA探针(探针长度1.4kb，Gibco BRL公司)作Northern印迹杂交[4]。杂交膜片经去除目的杂交探针处理后，用同位素标记的磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH) cDNA探针(中科院细胞生物研究所提供)再次杂交作阳性参照。
注：M：标准分子量(λ DNA/Hind Ⅲ)，1：α5重组质粒，2：α5重组质粒酶切片段，3：α5 cDNA探针，4：β1 cDNA探针，5：β1重组质粒酶切片段，6：β1重组质粒图1 整合素α5、β1 cDNA探针酶切鉴定
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3.核酸原位杂交：以随机引物法Dig标记整合素α5 cDNA探针(0.9 kb，Gibco BRL公司)和FN cDNA探针(同上)，用漂片法作原位杂交。主要步骤为：石蜡切片厚8 μm，用新鲜二甲苯及酒精脱蜡水化，4%多聚甲醛，0.1 mol/L PBS后固定。依次入0.1 mol/L PBS(pH7.2)、含0.1 mol/L甘氨酸的0.1 mol/L PBS、含0.4% Triton X-100的0.1 mol/L PBS漂洗。1.5 μg/ml蛋白酶K，37℃孵育30分钟，含4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS 5分钟，0.1 mol/L PBS洗片后入0.25%乙酸酐(0.1 mol/L三乙醇胺配制)10分钟， 2×SSC 10分钟，将切片移入杂交液(50%去离子甲酰胺，0.1% 十二烷基肌氨酸、0.02% SDS、0.2% Blocking Reagent和250 g/ml变性鲑鱼精 DNA)，杂交液内探针浓度均为0.5 μg/ml，42℃，振荡杂交16小时。切片经梯度SSC和0.05 mol/L PBS漂洗后，加AP标记的抗Dig抗体Fab片段(浓度1∶800)，37℃，40分钟，室温1小时，分别用TSM1液(0.1 mol/L pH8.0 Tris-HCl、0.1 mol/L NaCl、10 mmol/L MgCl2 )和TSM2液(0.1 mol/L pH9.5 Tris-HCl、0.1 mol/L NaCl、50 mmol/L MgCl2 )漂洗，NBT/BCIP显色，裱片后，恒温箱干燥，二甲苯透明，中性树胶封片，阳性杂交信号为蓝色颗粒。设阴性对照：(1)25 μg/ml RNA酶预处理切片后杂交；(2)无探针杂交。
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4.图像分析及统计学处理：采用MIAS-300图像分析系统及TJTY-300(同济太阳公司)图像分析软件，对Northern印迹杂交后X光片上的杂交信号作面积和平均光密度测定，并用同一样品的GAPDH阳性信号值加以校正。计算公式为：阳性信号校正指数=样品阳性信号面积×样品阳性信号灰度值/GAPDH阳性信号面积×GAPDH样品阳性信号灰度值。参照以前的免疫组化定量方法[1]，测定整合素α5 和FN mRNAs原位杂交阳性指数(positive index，PI)。采用方差分析作统计学处理。
结果
1.整合素α5 、β1和FN mRNAs表达的Northern印迹杂交结果：整合素α5 mRNA位于28S稍后4.9 kb处呈一阳性条带(图2)；整合素β1 mRNA 在28S前4.2 kb处呈一阳性条带(图3)；FN mRNA主要在28S后8 kb处呈一阳性条带，但5例HCC组织除8 kb处外，在5 kb处可见另一清晰的阳性条带(图4)。HCC癌组织中整合素α5 、β1和FN mRNAs表达水平因分化程度而异(图5)。低、中分化组整合素α5 、β1和FN mRNAs含量均值皆明显低于高分化组及癌旁和正常对照组(分别P<0.01)，而后两组间无显著性差异。低分化组与癌旁和正常对照组比较，整合素α5 、β1 和FN mRNAs下降幅度分别为86.5%、60.3%和90.8%。HCC伴肝内浸润和/或转移组三种mRNAs表达水平均明显低于不伴肝内浸润转移组(分别P<0.05)。 此外，Northern印迹杂交显示5例 HCC组织在5kb位置FN mRNA呈异质性表达，组织学观察发现该5例HCC虽然分化程度不同(2例高分化和3例低分化)，但均有肝内门静脉内癌栓形成。
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H：高分化，M：中分化，L：低分化，C：癌旁肝组织
图2 HCC、癌旁肝硬化及正常肝组织整合素
α5 mRNA Northern印迹杂交结果
H：高分化，M：中分化，L：低分化，C：癌旁肝，N：正常肝
图3 HCC、癌旁肝硬化及正常肝组织整合素
β1 mRNA Northern印迹杂交结果
H：高分化，M：中分化，L：低分化，C：癌旁肝，N：正常肝
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图4 HCC、癌旁肝硬化及正常肝组织整合素
FN mRNA Northern印迹杂交结果
2.整合素α5 和FN mRNAs表达的原位杂交结果：正常肝组织中表达较高水平的整合素α5和FN mRNAs，两者杂交信号阳性肝细胞分布基本相似，于肝小叶内呈散在分布，小叶周边区略多于中央区。少数肝血窦壁细胞亦表达α5和FN mRNAs。癌旁肝硬化组织内，除再生结节中部分肝细胞表达整合素α5和FN mRNAs外，于活动性间隔内可见较多FN mRNA阳性梭形细胞，其中部分细胞连续切片显示亦表达整合素α5 mRNA。HCC组织内整合素α5 和FN mRNAs表达基本一致。其杂交阳性信号主要位于HCC细胞胞浆内，少数间质细胞和血管内皮细胞也见整合素α5 和FN mRNAs表达。整合素α5和FN mRNAs表达因癌组织分化程度而异(附表)。高分化HCC中整合素α5和FN mRNAs阳性癌细胞数及阳性强度与正常及癌旁肝细胞相近(图6)，而低、中分化组两者表达明显减弱(图7)，与正常及癌旁肝组织PI均值比较分别P<0.05，甚至仅见个别阳性癌细胞。
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附表 原位杂交检测不同分化程度HCC中整合素α5和
FN mRNA表达水平(PI值，
±s) 组 别整合素α5 mRNA
FN mRNA
癌旁和正常
5.6±1.0
6.4±1.7
高分化
4.8±0.8
5.7±1.1
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中分化
2.4±0.6
2.9±0.5
低分化
0.7±0.2
1.0±0.4
注：中、低分化HCC组分别与正常和癌旁组、高分化HCC组比较，均P<0.01，中、低分化HCC组间比较P<0.01
图5 整合素α5、β1亚基和FN mRNA的含量变化情况
, 百拇医药 图6 高分化HCC中见较多整合素α5 mRNA杂交阳性细胞
原位杂交×200
图7 低分化HCC中见个别整合素α5 mRNA阳性
细胞癌细胞 原位杂交×400
定量分析还显示，15例HCC中8例伴肝内浸润和/或转移者，其原发灶内整合素α5 mRNA(1.6±0.3)和 FN mRNA (2.1±0.7)表达水平明显低于无浸润转移组(α5 mRNA 4.2±0.9，FN mRNA5.0±1.0)，两组PI均值比较P<0.05。
讨论
1.整合素α5和FN mRNAs表达变化与HCC细胞分化的关系：FN是一种重要的细胞表面糖蛋白。研究发现，FN通过细胞膜受体整合素α5、β1 等参与细胞粘附、形态维持、生长控制、信息传递以及细胞分化等多种生物学过程。近年来，整合素及其配体蛋白对肿瘤多种生物学特性的重要性已初露端倪。观察已发现，FN及其受体整合素α5、β1表达水平随着HCC细胞分化程度的减低而减少，而高分化HCC细胞中两种蛋白表达则与正常及癌变肝组织相近[1]。有关乳腺癌、结肠癌和胰腺癌等的研究报道也显示了相似的结果[5，6]。虽然目前FN及其受体表达在某些肿瘤的变化已获得一些证据，但迄今为止有关其蛋白水平改变的分子生物学机制尚不清楚。我们研究显示，高分化HCC中α5 、β1和FN mRNAs表达水平与正常及癌旁肝组织相近，而中、低分化HCC组织中三种mRNAs表达均减少，甚至难以检测到(分别P<0.05)。原位杂交证实，中、低分化 HCC中整合素α5、β1和FN mRNAs表达水平的下调主要系HCC细胞本身所致，而癌组织内间质细胞变化不明显。结果表明：不同分化程度HCC细胞整合素α5、β1 和FN mRNAs表达水平的变化与蛋白水平的改变相平行，提示整合素α5β1和FN蛋白表达的减少主要是其相应基因转录水平下调的结果。结果还显示，低分化HCC中整合素α5和FN mRNAs下调幅度大于整合素β1mRNA，造成整合素α5 、β1亚基转录水平不平衡的原因可能与HCC组织中尚表达其它含β1亚基的整合素受体有关，至于两个整合素亚基间及受、配体间合成的调节机制有待进一步研究。
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2.整合素α5 、β1和FN mRNAs表达变化与HCC浸润和转移的关系：肿瘤浸润和转移被认为是某些基因表达改变的累积后果。Hynes曾提出了针对细胞外基质(ECM)成份的细胞粘附受体的缺失影响肿瘤浸润和转移能力的假说[7]。我们以前的观察结果已提示，整合素蛋白水平的改变可能影响HCC的浸润和转移行为。最近Fearon等[8]发现，70%的直肠癌中编码神经细胞粘附分子的基因缺失或突变。本文结果显示：HCC伴肝内浸润和/或转移组原发灶内整合素α5和FN mRNAs 转录水平低于无肝内浸润和转移组(P<0.05)；HCC浸润部位癌细胞中整合素α5和FN mRNAs杂交阳性信号弱于非浸润部位，甚至难以检测到阳性信号。该结果与我们以前的免疫组化检测结果一致。表明HCC中整合素α5、β1和FN mRNAs表达变化与HCC浸润和转移生物学行为密切相关，FN其受体转录及翻译水平的下调可能意味着HCC细胞浸润和转移潜能的增高。
3.FN mRNA异质性表达与HCC生物学特性的关系：FN是由单一或最多两对外显子所编码的蛋白质，最近对FN基因序列分析发现，由于前mRNA在三个不同部位的选择性拼接不同，单一的FN基因能够编码20余种不同的FN异质体，而且这些FN异质体具有一定的组织细胞特异性。在人体肝癌中可以出现相对特异的FN mRNA表达[9]。我们应用Northern印迹杂交发现，5例HCC组织除在公认的28S后8kb处呈阳性杂交带外，并在5kb左右的位置呈现清晰的异常FN mRNA阳性信号带，结合组织学观察，该5例HCC均发生肝内门静脉癌栓形成，提示5kb位置的异质性mRNA可能编码结构及功能异常的瘤性FN蛋白，从而影响HCC细胞间以及HCC细胞与ECM间的粘附乃至信号传递作用，这在HCC细胞生长，尤其是浸润转移生物学行为中可能具有某些意义。
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4.有关HCC细胞合成FN和整合素α5、β1 的问题：关于FN的来源，体外培养已发现肝细胞具有合成血浆型FN的能力[10]，至于细胞表面及ECM中的FN可能源自血管内皮细胞，成纤维细胞，单核细胞及其它间质细胞。某些HCC细胞系在体外具有合成和分泌FN的能力，但有关体内肝细胞及HCC细胞合成FN的文献报道多限于免疫组化观察结果。我们采用原位杂交技术，观察到体内部分肝细胞及血窦壁细胞表达FN和整合素α5 mRNA，证明这些细胞具有合成FN及其受体的能力。值得注意的是，高分化HCC细胞能够表达与正常及癌旁肝组织相近的FN和整合素α5 mRNAs，表明体内HCC细胞是肝癌组织中主要的FN来源细胞。同时还发现肝硬化活动性间隔内多数梭形间质细胞呈FN mRNA强阳性杂交信号，部分细胞可见整合素α5 mRNA表达，提示这些间隔细胞在FN等ECM合成中可能具有重要作用，这在肝硬化的发生机制中可能有意义。
本课题为“九五”国家攻关项目课题(编号96-906-01-15)并受美国中华医学基金会基金资助(基金编号85838)
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参考文献
1 赵景民, 翟为溶, 张月娥, 等.肝细胞癌整合蛋白α5 β1、纤维连接蛋白及其降解片段的表达.中华病理学杂志, 1997, 26：65-69.
2 Chomczynski P, Sacchi N. Singlestep method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, 1987, 162：156-159.
3 Giancotti F,Ruoslahti E. Elevated levels of the α5 β1fibronectin receptor suppress the transformed phenotype of chinese hamster ovary cells. Cell, 1990, 60：849-859.
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4 Cervella P, Silenge L, Pastore C, et al. Human beta-integrin gene expression is regulated by two promoter regions. J Biol Chem, 1993, 268：5148-5155.
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7 Albelda SM. Biology of disease: role of integrins and other cell adhesion molecules in tumor progression and metastasis. Lab Invest, 1993, 68：4-17.
8 Fearon ER, Cho KR, Nigro JM, et al. Identification of a chromosome 18q gene that is altered in colorectal cancers. Science, 1990, 247：49-56.
9 Ogama F, Hirohashi S, Shimosato Y, et al. Deregulation of alternative splicing of fibronectin pre-mRNA in malignant human liver tumors. J Biol Chem, 1989, 264：10331-10334.
10 Tamkun JW,Hynes RO. Plasma fibronectin is synthesized and secreted by hepatocytes. J Biol Chem, 1983, 258：4641-4647.
(收稿：1997-05-19 修回：1997-10-06), http://www.100md.com