端粒酶基因在人肿瘤组织中的表达
作者：苑昕 张波 应建明 金燕燕 侯琳
单位：苑昕(北京医科大学病理学系 100083)；张波(北京医科大学病理学系 100083)；应建明(北京医科大学病理学系 100083)；侯琳(北京医科大学病理学系 100083)；金燕燕(浙江省绍兴市人民医院)
关键词：端粒；末端转移酶；肿瘤；基因表达
中华病理学杂志000106 摘 要 目的 探讨端粒酶基因表达与肿瘤恶性表型及其与端粒酶活性的关系；评价端粒酶基因表达检测在肿瘤诊断中的价值。方法 用原位杂交的方法检测端粒酶基因hTR和hTRT在78例人常见癌组织，20例癌前病变，28例良性病变中的表达及分布情况。结果 78例癌中hTR阳性率为85%(66/78)，hTRT阳性率为82%(64/78); 在癌旁组织中hTR、hTRT的表达阳性率分别为3%(2/78)、5%(4/78);20例癌前病变中hTR、hTRT阳性率分别为20%(4/20)、15%(3/20); 28例良性病变中hTR、hTRT阳性率分别为0%、4%(1/28)。癌组织中hTR和 hTRT的表达与癌旁、癌前病变、良性病变比较差异有显著性(P<0.01)。在常见癌组织中hTR, hTRT的阳性检出情况分别为：乳腺癌15/16,14/16；结直肠癌17/20，18/20；膀胱癌8/10，8/10；肺癌6/8，6/8；胃癌6/8，6/8；食管癌5/6，5/6。在乳腺癌、结直肠癌、膀胱癌，hTR和 hTRT基因的表达水平随癌分化降低或淋巴结转移而呈上升趋势。结果还显示hTR 和hTRT表达有正相关性(P<0.01)。结论 端粒酶基因表达与肿瘤的恶性表型相关，提示端粒酶基因表达检测在回顾性研究中可能具有一定的价值。
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Expression of telomerase genes in human tumors
YUAN Xin ZHANG Bo YING Jianming JIN Yanyan HOU Lin
(Department of Pathology, Beijing Medical University, Beijing 100083, China)
Abstract Objective To investigate the correlation between the expression of telomerase genes and malignant phenotypes of human tumors and to compare the expression of telomerase genes and its activity reported in order to evaluate the role of detection of telomerase genes in tumor diagnosis. Methods With in situ hybridization, the expression and distribution of telomerase hTR and hTRT genes were observed in 78 cases of human cancer tissues, 20 cases of precancerous lesions and 28 of benign lesions. The results were statistically analyzed. Results hTR and hTRT were detected in 85% (66/78) and 82% (64/78) of the primary cancers. While in the adjacent tissues, the positive rates were only 3% (2/78) and 5% (4/78). In 20 precancerous cases, the positive rate for hTR and hTRT were 20% (4/20) and 15% (3/20) and the positive cases in 28 benign lesions were 0 and 1/28 (4%), respectively. The positive detection of hTR and hTRT expression in cancer group were significantly different from those in the adjacent tissues, precancerous cases and benign lesion group (P<0.01). In analysing main types of the human cancers, the positive frequency of hTR and hTRT were 94%(15/16) and 88%(14/16) for the breast cancer, 85%(17/20) and 90%(18/20) for the colon cancer, 80%(8/10) and 80%(8/10) for the gallbladder cancer, 75%(6/8)and 75%(6/8) for the lung cancer, 75%(6/8) and 75%(6/8)for the stomach cancer, and 83%(5/6) and 83%(5/6) for the esophagus cancer, respectively. The expression level of telomerase hTR and hTRT correlated well with the malignancy and metastatic potentials in breast cancer, colon cancer and bladder cancer. Besides, the expressions of hTR and hTRT were noticed to be also highly correlated (P<0.01). Conclusions The expression of telomerase genes correlates with tumor malignant phenotypes, and may reflect the progression of tumors, and the detection of telomerase gene expression may be useful in a retrospective cancer research. It is worthwhile for further study to clarify whether screening of telomerase gene expression is able to become a new index for tumor diagnosis and prognosis.
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Key words Telomerase;Tumors;Gene expression
端粒-端粒酶作为调节细胞分裂寿命的基础，近年来日益成为癌生物学界关注的热点[1]。本室曾克隆人端粒酶逆转录酶基因(hTRT)并初步研究其与端粒酶RNA基因(hTR)表达的一致性，以及与人肿瘤的关系[2]。我们进一步对常见的人肿瘤组织进行了hTR、hTRT基因表达的检测，并比较其在良性病变和癌前病变的表达情况，探讨端粒酶基因表达与癌变、癌细胞生物学行为及其端粒酶活性的关系；评价在石蜡标本上端粒酶基因表达检测对肿瘤诊断的价值。
材料和方法
1.材料：北京医科大学病理学系1997年1月～10月的存档蜡块，共126例。其中18例为内镜活检标本。按WHO统一分类标准，癌症78例，其中乳腺癌16例，结直肠癌20例，膀胱癌10例，肺癌8例，胃癌8例，食管癌6例，子宫内膜癌、宫颈癌各3例，前列腺癌、阴茎鳞癌各2例。癌前病变20例，其中结直肠腺瘤(Ⅰ～Ⅲ级)13例，伴不典型增生的乳腺增生症6例，乳腺导管内乳头状瘤1例。良性肿瘤、良性病变28例，其中乳腺纤维腺瘤、卵巢畸胎瘤、子宫内膜增生症、子宫内膜息肉、声带息肉、慢性胆囊炎各3例，结肠慢性炎、胃粘膜慢性炎各4例，腮腺混合瘤2例。病例均经2名以上病理专家诊断核实。所有标本组织经4%甲醛固定，常规石蜡包埋,切片。
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2.主要试剂:pGRN83hTR 含全长人端粒酶RNA基因cDNA,由美国Cold Spring Harbor实验室Greider C.W. 教授惠赠。pBSTRT含人端粒酶催化亚单位部分基因cDNA,由本实验室克隆构建[2]。BamHⅠ,SalⅠ，MluⅠ,XbaⅠ(华美公司)，T3，T7 RNA聚合酶(Promega公司)，RNasin(GIBCO-BRL公司)。 甲酰胺，鲑精 DNA(ssDNA),硫酸葡聚糖,DTT(1,4-二巯苏糖醇), 购自Sigma公司。10×Dig-rNTPs，氮蓝四唑/五溴-四氯-三吲哚磷酸酯(NBT/ BCIP),Anti-digoxigenin-AP(BM公司)，蛋白酶 K (Merck公司)。
3.探针制备：地高辛标记的hTR-cRNA探针: pGRN83hTR的MluⅠ酶切线性化片段 1 μg，5×RNA多聚酶缓冲液4 μl，100 mmol/L DTT 1 μl，10×Dig-rNTPs 2 μl, RNasin 0.5 μl,T7 RNA 聚合酶 1 μl,37 ℃孵育1 h，1%琼脂糖凝胶电泳检测转录产物， 然后经乙醇沉淀，于80%甲酰胺融解，-20℃保存。 hTRT-cRNA探针：pBSTRT经SalⅠ酶切线性化，用T3 RNA 聚合酶同上制备。hTR,hTRT-sense RNA探针：分别以SalⅠ, BamHⅠ线性化质粒，同上以Sp6,T7 RNA 聚合酶转录制备。
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4.原位杂交：常规石蜡切片二甲苯脱蜡，乙醇水化。0.2 mmol/L HCl作用15 min。蛋白酶K消化(200 μg/ml)，37 ℃，15～20 min。4%多聚甲醛处理10 min。95%冰乙醇脱水1～2 min。滴加杂交液20 μl/片(杂交液成分:50%甲酰胺,ssDNA 100 μg/ml,探针20 ng,50 mmol/L DTT,5×Denhardt液,5%硫酸葡聚糖,4×SSC),42℃反应16～20 h。2×SSC洗3次，55 ℃,每次20 min。0.2×SSC洗2次，室温，每次15 min。马血清(1∶100)封闭30 min，Anti-Digoxingenin-AP(1∶500)37 ℃孵育1 h。缓冲液Ⅰ(pH 7.5，Tris-HCl 100 mmol/L,NaCl 150 mmol/L)洗涤20 min,缓冲液Ⅲ(pH 9.5 Tris-HCl 100 mmol/L, NaCl 100 mmol/L,MgCl2 50 mmol/L)处理5 min。NBT/BCIP显色(175～450 μg/ml)30 min，终止,蛋白甘油封片。
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5.结果判断：阳性信号为蓝紫色颗粒，hTR为胞核和胞质着色，而hTRT为胞质显色。阴性：细胞不显色。分级：弱阳性(+)：阳性信号面积<25%；阳性(++)：阳性信号面积达25%～50%；强阳性(+++)：阳性信号面积>50%。阴性对照：分别以sense探针，不加探针及RNA酶处理切片为空白对照。
6.统计学处理：χ2检验。
结果
1.hTR的表达:hTR阳性信号位于胞质或胞核内，呈蓝紫色颗粒。78 例癌标本中，66例hTR表达，阳性率为85%。其中阳性检出分别为乳腺癌15/16(图1)，结直肠癌17/20(图2),膀胱癌8/10,肺癌6/8,胃癌6/8,食管癌5/6。癌旁组织：78例癌中，2例结直肠癌癌旁病变为阳性，阳性率为3%。其余均阴性。20例癌前病变中，4例hTR表达，阳性率为20%,其中，13例肠腺瘤(Ⅰ～Ⅲ级)中阳性3例(图3)。6例伴不典型增生的乳腺增生症为阴性，1例乳腺导管内乳头状瘤阳性。28例良性肿瘤及良性病变中，均无hTR表达。经统计学分析： 癌组织中hTR的表达阳性率较癌前病变，良性病变差异有显著性(P<0.01)。而各癌组间差异无显著性(P>0.05)。与癌的分期、分级的关系见表1～3。端粒酶基因表达水平与癌的分级，分期及淋巴结转移呈正相关趋势。
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2.hTRT的表达：hTRT阳性信号位于胞质内。78例癌标本中，64 例hTRT表达，阳性率为82%。其中阳性检出分别为乳腺癌14/16(图4)，结直肠癌18/20(图5),膀胱癌8/10,肺癌6/8,胃癌6/8,食管癌5/6例。癌旁组织：78例癌中，3例结直肠癌、1例子宫内膜癌的癌旁病变中有阳性信号，阳性率占5%。其余癌组织周围的正常组织为阴性。20例癌前病变中，3例hTRT阳性，其中，13例肠腺瘤(Ⅰ～Ⅲ级)中有2例阳性(图6),6例伴不典型增生的乳腺增生症阴性，1例乳腺导管内乳头状瘤阳性。28例良性肿瘤及良性病变中，hTRT总阳性率为6%。经统计学分析：癌组织中hTRT的表达阳性率较癌前病变、良性病变差异有显著性(P<0.01)。而各癌组间差异无显著性(P>0.05)。与癌的分期、分级的关系见表1～3。随着癌的分级、分期和淋巴结转移端粒酶基因表达有增高的趋势。
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图1，2 乳腺浸润性导管癌，癌细胞胞质阳性着色，图1为hTR基因表达，图2为hTRT基因表达 ×100 图3，4 结肠癌，癌细胞质及部分胞核阳性着色，图3为hTRT基因表达，图4为hTR基因表达 ×100 图5，6 结肠腺瘤，部分瘤细胞质阳性着色，图5为hTR基因表达，图6为hTRT基因表达 ×40(图1～6方法均为原位杂交)
3.端粒酶基因hTR与hTRT表达的相关性:在70例hTR阳性病例中hTRT有68例阳性，而hTR和hTRT阴性均为56例。经统计学分析两基因表达有相关性(P<0.01)。在78例癌标本,20例癌前病变及28例良性病变中，hTR和hTRT的阳性率也无明显差异。说明hTR, hTRT表达具有一致性。
讨论
近2年,对上千例的不同来源的原发肿瘤进行端粒酶的活性测定，恶性肿瘤组织中阳性率高达85%～90%，在良性病变中，阳性率为4.2%。其中，肠腺瘤、结直肠癌中端粒酶的阳性率分别为45%、89%，邻近组织的阳性率为25%；乳腺原位癌和浸润导管或小叶癌中阳性率分别为75%、88%，乳腺纤维囊性病、乳腺纤维腺瘤的阳性率分别为28%、0%；膀胱的异型增生、膀胱癌中的阳性率分别为43%、92%[3，4]。无论从总体或各类病变，我们用原位杂交的方法所得到的端粒酶基因表达与文献报道的检出率十分相近，在同一来源的肿瘤组织中端粒酶活性与端粒酶基因的表达有较明显的平行关系。显示基因表达检测与酶活性分析具有一致性。与端粒酶活性检测一样，在癌、癌前病变和良性病变中，端粒酶基因的表达差异有显著性。表明端粒酶的激活与肿瘤的恶性表型相关。
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表1 hTR和hTRT表达与结直肠癌分级、分期的关系 种类
例数
hTR
hTRT
+
++
+++
+
++
+++
病理分级
高分化
2
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2
0
0
2
0
0
中分化
17
3
11
0
4
11
0
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低分化
1
0
0
1
0
0
1
淋巴结转移
+
11
2
8
1
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2
8
1
-
9
3
3
0
4
3
0
表2 hTR、hTRT表达与乳腺癌分型、分期的关系 种类
例数
, 百拇医药
hTR
hTRT
+
++
+++
+
++
+++
病理类型
导管内癌
4
3
1
0
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2
1
0
浸润癌
12
3
4
4
3
3
5
淋巴结转移
+
6
, 百拇医药
1
2
3
1
1
4
-
8
4
3
0
3
3
0
, 百拇医药
表3 hTR、hTRT表达与膀胱癌分级的关系 分级
例数
hTR
hTRT
+
++
+++
+
++
+++
Ⅰ 级
2
1
, 百拇医药
0
0
1
0
0
Ⅱ 级
6
3
2
0
1
4
0
Ⅲ 级
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2
0
2
0
0
2
0
有较多文献报道，在一些癌前病变中有弱到中度的端粒酶活性的表达[3-7]。因此提示，端粒酶的基因激活表达可能发生在细胞癌变的早期阶段。
许多研究资料显示端粒酶的活性与肿瘤的演进相关[8]。在本研究中，结直肠癌、乳腺癌、膀胱癌中，随着肿瘤组织学分级和肿瘤恶性度的增高，hTR、hTRT的表达也有增高的趋势；在发生浸润转移的癌中端粒酶hTR、hTRT的表达均高于未发生转移的肿瘤。提示：端粒酶hTR、hTRT基因表达的水平可能与肿瘤的演进一致，与肿瘤细胞的生物学行为有一定的关系。
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实验表明hTR和hTRT的产物同时存在才可获得端粒酶活性，两者的单方突变均可丧失酶活性[9，10]。这可解释本研究中所观察到的hTR、hTRT表达具有相关性，并在分布范围、信号强度上的一致性。也可以推测hTR和hTRT与细胞癌变过程端粒酶的激活具有同步性。
端粒酶活性测定为肿瘤研究的主要方法[11]，但其需要新鲜组织及同位素标记，且操作复杂，无法用于病理学回顾性研究和检测。我们采用原位杂交检测石蜡组织端粒酶基因表达，克服上述缺点并获得了与生化活性测定方法相一致的结果。
本研究结果表明：恶性肿瘤端粒酶基因表达与良性肿瘤，癌前病变及癌旁组织有显著不同，并与肿瘤分级，转移有一定相关性。因此，有必要进一步研究确定：端粒酶基因表达检测是否可作为肿瘤诊断及鉴别诊断的依据及预后指标。 通信作者：张波(Email:zhangbo@mail.bjmu.edu.cn)
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参考文献：
[1]Shay JW,Wright WE.Telomerase activity in human cancer, Curr Opin Oncol,1996,8:66-71.
[2]应建明，金燕燕，王衡，等.hTRT基因催化功能区克隆及其在人肿瘤中的表达.中华病理学杂志，1999，28: 85-88.
[3]Shay JW,Bacchetti S.A survey of telomerase activity in human cancer.Eur J Cancer,1997,33:787-791.
[4]Yashima K,Milchgrub S,Gollahon LS,et al.Telomerase enzyme activity and RNA expression during the multistage pathogenesis of breast carcinoma. Clin Cancer Res,1998,4:229-234.
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[5]Yashima K,Litzky LA,Kaiser L,et al.Telomerase expression in respiratory epithelium during the multistage pathogenesis of lung carcinoma. Cancer Res,1997,57:2373-2377.
[6]Tahara H,Kuniyasu H,Yasui W,et al.Telomerase activity in preneoplstic and neoplastic gastric and colorectal lesions. Clin Caner Res,1995,1:1245-1251.
[7]Lin Y,Miyamoto H,Fujinami K,et al.Telomerase activity in human bladder cancer. Clin Cancer Res,1996,2:929-932.
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[8]Healy KC.Telomere dynamics and telomerase activation in tumor progression:prospects for prognosis and therapy. Oncol Res,1995,7:121-130.
[9]Weinrich SL, Pruzan R,Ma L,et al.Reconstitution of human telomerase with the template RNA component and the catalytic protein subunit hTRT. Nat Genet, 1997, 17: 498-502.
[10]McEachern MJ，Blackburn EH.Runaway telomere elongation caused by telomerase RNA gene mutations. Nature,1995,376:403-409.
[11]Kim NW,Piatyszek MA,Prowse KR,et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science,1994,266:2011-2015.
收稿日期：1999-05-24, 百拇医药
单位：苑昕(北京医科大学病理学系 100083)；张波(北京医科大学病理学系 100083)；应建明(北京医科大学病理学系 100083)；侯琳(北京医科大学病理学系 100083)；金燕燕(浙江省绍兴市人民医院)
关键词：端粒；末端转移酶；肿瘤；基因表达
中华病理学杂志000106 摘 要 目的 探讨端粒酶基因表达与肿瘤恶性表型及其与端粒酶活性的关系；评价端粒酶基因表达检测在肿瘤诊断中的价值。方法 用原位杂交的方法检测端粒酶基因hTR和hTRT在78例人常见癌组织，20例癌前病变，28例良性病变中的表达及分布情况。结果 78例癌中hTR阳性率为85%(66/78)，hTRT阳性率为82%(64/78); 在癌旁组织中hTR、hTRT的表达阳性率分别为3%(2/78)、5%(4/78);20例癌前病变中hTR、hTRT阳性率分别为20%(4/20)、15%(3/20); 28例良性病变中hTR、hTRT阳性率分别为0%、4%(1/28)。癌组织中hTR和 hTRT的表达与癌旁、癌前病变、良性病变比较差异有显著性(P<0.01)。在常见癌组织中hTR, hTRT的阳性检出情况分别为：乳腺癌15/16,14/16；结直肠癌17/20，18/20；膀胱癌8/10，8/10；肺癌6/8，6/8；胃癌6/8，6/8；食管癌5/6，5/6。在乳腺癌、结直肠癌、膀胱癌，hTR和 hTRT基因的表达水平随癌分化降低或淋巴结转移而呈上升趋势。结果还显示hTR 和hTRT表达有正相关性(P<0.01)。结论 端粒酶基因表达与肿瘤的恶性表型相关，提示端粒酶基因表达检测在回顾性研究中可能具有一定的价值。
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Expression of telomerase genes in human tumors
YUAN Xin ZHANG Bo YING Jianming JIN Yanyan HOU Lin
(Department of Pathology, Beijing Medical University, Beijing 100083, China)
Abstract Objective To investigate the correlation between the expression of telomerase genes and malignant phenotypes of human tumors and to compare the expression of telomerase genes and its activity reported in order to evaluate the role of detection of telomerase genes in tumor diagnosis. Methods With in situ hybridization, the expression and distribution of telomerase hTR and hTRT genes were observed in 78 cases of human cancer tissues, 20 cases of precancerous lesions and 28 of benign lesions. The results were statistically analyzed. Results hTR and hTRT were detected in 85% (66/78) and 82% (64/78) of the primary cancers. While in the adjacent tissues, the positive rates were only 3% (2/78) and 5% (4/78). In 20 precancerous cases, the positive rate for hTR and hTRT were 20% (4/20) and 15% (3/20) and the positive cases in 28 benign lesions were 0 and 1/28 (4%), respectively. The positive detection of hTR and hTRT expression in cancer group were significantly different from those in the adjacent tissues, precancerous cases and benign lesion group (P<0.01). In analysing main types of the human cancers, the positive frequency of hTR and hTRT were 94%(15/16) and 88%(14/16) for the breast cancer, 85%(17/20) and 90%(18/20) for the colon cancer, 80%(8/10) and 80%(8/10) for the gallbladder cancer, 75%(6/8)and 75%(6/8) for the lung cancer, 75%(6/8) and 75%(6/8)for the stomach cancer, and 83%(5/6) and 83%(5/6) for the esophagus cancer, respectively. The expression level of telomerase hTR and hTRT correlated well with the malignancy and metastatic potentials in breast cancer, colon cancer and bladder cancer. Besides, the expressions of hTR and hTRT were noticed to be also highly correlated (P<0.01). Conclusions The expression of telomerase genes correlates with tumor malignant phenotypes, and may reflect the progression of tumors, and the detection of telomerase gene expression may be useful in a retrospective cancer research. It is worthwhile for further study to clarify whether screening of telomerase gene expression is able to become a new index for tumor diagnosis and prognosis.
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Key words Telomerase;Tumors;Gene expression
端粒-端粒酶作为调节细胞分裂寿命的基础，近年来日益成为癌生物学界关注的热点[1]。本室曾克隆人端粒酶逆转录酶基因(hTRT)并初步研究其与端粒酶RNA基因(hTR)表达的一致性，以及与人肿瘤的关系[2]。我们进一步对常见的人肿瘤组织进行了hTR、hTRT基因表达的检测，并比较其在良性病变和癌前病变的表达情况，探讨端粒酶基因表达与癌变、癌细胞生物学行为及其端粒酶活性的关系；评价在石蜡标本上端粒酶基因表达检测对肿瘤诊断的价值。
材料和方法
1.材料：北京医科大学病理学系1997年1月～10月的存档蜡块，共126例。其中18例为内镜活检标本。按WHO统一分类标准，癌症78例，其中乳腺癌16例，结直肠癌20例，膀胱癌10例，肺癌8例，胃癌8例，食管癌6例，子宫内膜癌、宫颈癌各3例，前列腺癌、阴茎鳞癌各2例。癌前病变20例，其中结直肠腺瘤(Ⅰ～Ⅲ级)13例，伴不典型增生的乳腺增生症6例，乳腺导管内乳头状瘤1例。良性肿瘤、良性病变28例，其中乳腺纤维腺瘤、卵巢畸胎瘤、子宫内膜增生症、子宫内膜息肉、声带息肉、慢性胆囊炎各3例，结肠慢性炎、胃粘膜慢性炎各4例，腮腺混合瘤2例。病例均经2名以上病理专家诊断核实。所有标本组织经4%甲醛固定，常规石蜡包埋,切片。
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2.主要试剂:pGRN83hTR 含全长人端粒酶RNA基因cDNA,由美国Cold Spring Harbor实验室Greider C.W. 教授惠赠。pBSTRT含人端粒酶催化亚单位部分基因cDNA,由本实验室克隆构建[2]。BamHⅠ,SalⅠ，MluⅠ,XbaⅠ(华美公司)，T3，T7 RNA聚合酶(Promega公司)，RNasin(GIBCO-BRL公司)。 甲酰胺，鲑精 DNA(ssDNA),硫酸葡聚糖,DTT(1,4-二巯苏糖醇), 购自Sigma公司。10×Dig-rNTPs，氮蓝四唑/五溴-四氯-三吲哚磷酸酯(NBT/ BCIP),Anti-digoxigenin-AP(BM公司)，蛋白酶 K (Merck公司)。
3.探针制备：地高辛标记的hTR-cRNA探针: pGRN83hTR的MluⅠ酶切线性化片段 1 μg，5×RNA多聚酶缓冲液4 μl，100 mmol/L DTT 1 μl，10×Dig-rNTPs 2 μl, RNasin 0.5 μl,T7 RNA 聚合酶 1 μl,37 ℃孵育1 h，1%琼脂糖凝胶电泳检测转录产物， 然后经乙醇沉淀，于80%甲酰胺融解，-20℃保存。 hTRT-cRNA探针：pBSTRT经SalⅠ酶切线性化，用T3 RNA 聚合酶同上制备。hTR,hTRT-sense RNA探针：分别以SalⅠ, BamHⅠ线性化质粒，同上以Sp6,T7 RNA 聚合酶转录制备。
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4.原位杂交：常规石蜡切片二甲苯脱蜡，乙醇水化。0.2 mmol/L HCl作用15 min。蛋白酶K消化(200 μg/ml)，37 ℃，15～20 min。4%多聚甲醛处理10 min。95%冰乙醇脱水1～2 min。滴加杂交液20 μl/片(杂交液成分:50%甲酰胺,ssDNA 100 μg/ml,探针20 ng,50 mmol/L DTT,5×Denhardt液,5%硫酸葡聚糖,4×SSC),42℃反应16～20 h。2×SSC洗3次，55 ℃,每次20 min。0.2×SSC洗2次，室温，每次15 min。马血清(1∶100)封闭30 min，Anti-Digoxingenin-AP(1∶500)37 ℃孵育1 h。缓冲液Ⅰ(pH 7.5，Tris-HCl 100 mmol/L,NaCl 150 mmol/L)洗涤20 min,缓冲液Ⅲ(pH 9.5 Tris-HCl 100 mmol/L, NaCl 100 mmol/L,MgCl2 50 mmol/L)处理5 min。NBT/BCIP显色(175～450 μg/ml)30 min，终止,蛋白甘油封片。
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5.结果判断：阳性信号为蓝紫色颗粒，hTR为胞核和胞质着色，而hTRT为胞质显色。阴性：细胞不显色。分级：弱阳性(+)：阳性信号面积<25%；阳性(++)：阳性信号面积达25%～50%；强阳性(+++)：阳性信号面积>50%。阴性对照：分别以sense探针，不加探针及RNA酶处理切片为空白对照。
6.统计学处理：χ2检验。
结果
1.hTR的表达:hTR阳性信号位于胞质或胞核内，呈蓝紫色颗粒。78 例癌标本中，66例hTR表达，阳性率为85%。其中阳性检出分别为乳腺癌15/16(图1)，结直肠癌17/20(图2),膀胱癌8/10,肺癌6/8,胃癌6/8,食管癌5/6。癌旁组织：78例癌中，2例结直肠癌癌旁病变为阳性，阳性率为3%。其余均阴性。20例癌前病变中，4例hTR表达，阳性率为20%,其中，13例肠腺瘤(Ⅰ～Ⅲ级)中阳性3例(图3)。6例伴不典型增生的乳腺增生症为阴性，1例乳腺导管内乳头状瘤阳性。28例良性肿瘤及良性病变中，均无hTR表达。经统计学分析： 癌组织中hTR的表达阳性率较癌前病变，良性病变差异有显著性(P<0.01)。而各癌组间差异无显著性(P>0.05)。与癌的分期、分级的关系见表1～3。端粒酶基因表达水平与癌的分级，分期及淋巴结转移呈正相关趋势。
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2.hTRT的表达：hTRT阳性信号位于胞质内。78例癌标本中，64 例hTRT表达，阳性率为82%。其中阳性检出分别为乳腺癌14/16(图4)，结直肠癌18/20(图5),膀胱癌8/10,肺癌6/8,胃癌6/8,食管癌5/6例。癌旁组织：78例癌中，3例结直肠癌、1例子宫内膜癌的癌旁病变中有阳性信号，阳性率占5%。其余癌组织周围的正常组织为阴性。20例癌前病变中，3例hTRT阳性，其中，13例肠腺瘤(Ⅰ～Ⅲ级)中有2例阳性(图6),6例伴不典型增生的乳腺增生症阴性，1例乳腺导管内乳头状瘤阳性。28例良性肿瘤及良性病变中，hTRT总阳性率为6%。经统计学分析：癌组织中hTRT的表达阳性率较癌前病变、良性病变差异有显著性(P<0.01)。而各癌组间差异无显著性(P>0.05)。与癌的分期、分级的关系见表1～3。随着癌的分级、分期和淋巴结转移端粒酶基因表达有增高的趋势。
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图1，2 乳腺浸润性导管癌，癌细胞胞质阳性着色，图1为hTR基因表达，图2为hTRT基因表达 ×100 图3，4 结肠癌，癌细胞质及部分胞核阳性着色，图3为hTRT基因表达，图4为hTR基因表达 ×100 图5，6 结肠腺瘤，部分瘤细胞质阳性着色，图5为hTR基因表达，图6为hTRT基因表达 ×40(图1～6方法均为原位杂交)
3.端粒酶基因hTR与hTRT表达的相关性:在70例hTR阳性病例中hTRT有68例阳性，而hTR和hTRT阴性均为56例。经统计学分析两基因表达有相关性(P<0.01)。在78例癌标本,20例癌前病变及28例良性病变中，hTR和hTRT的阳性率也无明显差异。说明hTR, hTRT表达具有一致性。
讨论
近2年,对上千例的不同来源的原发肿瘤进行端粒酶的活性测定，恶性肿瘤组织中阳性率高达85%～90%，在良性病变中，阳性率为4.2%。其中，肠腺瘤、结直肠癌中端粒酶的阳性率分别为45%、89%，邻近组织的阳性率为25%；乳腺原位癌和浸润导管或小叶癌中阳性率分别为75%、88%，乳腺纤维囊性病、乳腺纤维腺瘤的阳性率分别为28%、0%；膀胱的异型增生、膀胱癌中的阳性率分别为43%、92%[3，4]。无论从总体或各类病变，我们用原位杂交的方法所得到的端粒酶基因表达与文献报道的检出率十分相近，在同一来源的肿瘤组织中端粒酶活性与端粒酶基因的表达有较明显的平行关系。显示基因表达检测与酶活性分析具有一致性。与端粒酶活性检测一样，在癌、癌前病变和良性病变中，端粒酶基因的表达差异有显著性。表明端粒酶的激活与肿瘤的恶性表型相关。
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表1 hTR和hTRT表达与结直肠癌分级、分期的关系 种类
例数
hTR
hTRT
+
++
+++
+
++
+++
病理分级
高分化
2
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2
0
0
2
0
0
中分化
17
3
11
0
4
11
0
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低分化
1
0
0
1
0
0
1
淋巴结转移
+
11
2
8
1
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2
8
1
-
9
3
3
0
4
3
0
表2 hTR、hTRT表达与乳腺癌分型、分期的关系 种类
例数
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hTR
hTRT
+
++
+++
+
++
+++
病理类型
导管内癌
4
3
1
0
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2
1
0
浸润癌
12
3
4
4
3
3
5
淋巴结转移
+
6
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1
2
3
1
1
4
-
8
4
3
0
3
3
0
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表3 hTR、hTRT表达与膀胱癌分级的关系 分级
例数
hTR
hTRT
+
++
+++
+
++
+++
Ⅰ 级
2
1
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0
0
1
0
0
Ⅱ 级
6
3
2
0
1
4
0
Ⅲ 级
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2
0
2
0
0
2
0
有较多文献报道，在一些癌前病变中有弱到中度的端粒酶活性的表达[3-7]。因此提示，端粒酶的基因激活表达可能发生在细胞癌变的早期阶段。
许多研究资料显示端粒酶的活性与肿瘤的演进相关[8]。在本研究中，结直肠癌、乳腺癌、膀胱癌中，随着肿瘤组织学分级和肿瘤恶性度的增高，hTR、hTRT的表达也有增高的趋势；在发生浸润转移的癌中端粒酶hTR、hTRT的表达均高于未发生转移的肿瘤。提示：端粒酶hTR、hTRT基因表达的水平可能与肿瘤的演进一致，与肿瘤细胞的生物学行为有一定的关系。
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实验表明hTR和hTRT的产物同时存在才可获得端粒酶活性，两者的单方突变均可丧失酶活性[9，10]。这可解释本研究中所观察到的hTR、hTRT表达具有相关性，并在分布范围、信号强度上的一致性。也可以推测hTR和hTRT与细胞癌变过程端粒酶的激活具有同步性。
端粒酶活性测定为肿瘤研究的主要方法[11]，但其需要新鲜组织及同位素标记，且操作复杂，无法用于病理学回顾性研究和检测。我们采用原位杂交检测石蜡组织端粒酶基因表达，克服上述缺点并获得了与生化活性测定方法相一致的结果。
本研究结果表明：恶性肿瘤端粒酶基因表达与良性肿瘤，癌前病变及癌旁组织有显著不同，并与肿瘤分级，转移有一定相关性。因此，有必要进一步研究确定：端粒酶基因表达检测是否可作为肿瘤诊断及鉴别诊断的依据及预后指标。 通信作者：张波(Email:zhangbo@mail.bjmu.edu.cn)
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参考文献：
[1]Shay JW,Wright WE.Telomerase activity in human cancer, Curr Opin Oncol,1996,8:66-71.
[2]应建明，金燕燕，王衡，等.hTRT基因催化功能区克隆及其在人肿瘤中的表达.中华病理学杂志，1999，28: 85-88.
[3]Shay JW,Bacchetti S.A survey of telomerase activity in human cancer.Eur J Cancer,1997,33:787-791.
[4]Yashima K,Milchgrub S,Gollahon LS,et al.Telomerase enzyme activity and RNA expression during the multistage pathogenesis of breast carcinoma. Clin Cancer Res,1998,4:229-234.
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[5]Yashima K,Litzky LA,Kaiser L,et al.Telomerase expression in respiratory epithelium during the multistage pathogenesis of lung carcinoma. Cancer Res,1997,57:2373-2377.
[6]Tahara H,Kuniyasu H,Yasui W,et al.Telomerase activity in preneoplstic and neoplastic gastric and colorectal lesions. Clin Caner Res,1995,1:1245-1251.
[7]Lin Y,Miyamoto H,Fujinami K,et al.Telomerase activity in human bladder cancer. Clin Cancer Res,1996,2:929-932.
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[8]Healy KC.Telomere dynamics and telomerase activation in tumor progression:prospects for prognosis and therapy. Oncol Res,1995,7:121-130.
[9]Weinrich SL, Pruzan R,Ma L,et al.Reconstitution of human telomerase with the template RNA component and the catalytic protein subunit hTRT. Nat Genet, 1997, 17: 498-502.
[10]McEachern MJ，Blackburn EH.Runaway telomere elongation caused by telomerase RNA gene mutations. Nature,1995,376:403-409.
[11]Kim NW,Piatyszek MA,Prowse KR,et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science,1994,266:2011-2015.
收稿日期：1999-05-24, 百拇医药