胶质瘤bcl-2基因表达水平与其细胞增殖和凋亡关系的研究
作者：于士柱 浦佩玉 江德华 安同岭 管欣琴 杨露春
单位：于士柱(天津医科大学总医院 天津市神经病学研究所 300052)；浦佩玉(天津医科大学总医院 天津市神经病学研究所 300052)；江德华(天津医科大学总医院 天津市神经病学研究所 300052)；安同岭(天津医科大学总医院 天津市神经病学研究所 300052)；管欣琴(天津医科大学总医院 天津市神经病学研究所 300052)；杨露春(天津医科大学总医院 天津市神经病学研究所 300052)
关键词：神经胶质瘤；原致癌基因蛋白质c-bcl-2；增殖细胞核抗原；脱噬作用
摘 要 目的 探讨胶质瘤细胞bcl摘 要 目的 探讨胶质瘤细胞bcl-2基因表达水平与肿瘤恶性程度、细胞增殖活性及凋亡程度的关系。方法 以69例不同级别的人胶质瘤组织为研究对象，用原位杂交及免疫组化染色ABC法分别检测bcl-2 mRNA、bcl-2蛋白和增殖细胞核抗原(细胞增殖活性标记物)的表达，并用3′末端标记法做原位细胞凋亡检测。结果 64例(92.8%)表达bcl-2 mRNA，60例(87.0%)表达bcl-2蛋白，两者的表达水平呈正相关(rs=0.999，P<0.01)，并均显示Ⅰ～Ⅱ级组低于Ⅲ级组，Ⅳ级组最高(P<0.02～0.001)。随肿瘤细胞bcl-2蛋白表达水平升高其增殖活性相应增加，凋亡相应减少，bcl-2蛋白+++组与++组间(P<0.05)及前两组分别与-组和+组间(P<0.01)这两种指标的差异均有显著性。结论 胶质瘤细胞bcl-2基因高表达可抑制其凋亡，可能由此引起的细胞凋亡减少与其他基因异常所致的细胞过度增殖共同导致细胞无限蓄积，并在胶质瘤发生、发展中均起重要作用。
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Relationship of bcl-2 gene expression with cell proliferation and apoptosis in human gliomas
YU Shizhu PU Peiyu JIANG Dehua AN Tongling GUAN Xinqin YANG Luchun
(Department of Neuropathology, Neurology Institute, Tianjin Medical University General Hospital, Tianjin 300052, China)
Abstract Objective To investigate the relationship of bcl-2 gene expression level in human gliomas with the malignant degree, cell proliferative activity and apoptosis of the tumors. Methods The expression of bcl-2 mRNA, bcl-2 protein and proliferating cell antigen, and the apoptosis in sixty-nine human glioma specimens with different malignant grades were studied using in situ hybridization, in situ cell death detection (TUNEL method) and immunohistochemistry. Results Of the 69 gliomas, 64 (92.8%) and 60 (87.0%) expressed bcl-2 mRNA and bcl-2 protein, respectively. The expression levels of bcl-2 mRNA and bcl-2 protein were correlated positively with each other (rs=0.999, P<0.01). The expression levels of bcl-2 mRNA and bcl-2 protein were both higher in WHO grade IV gliomas than in grade III gliomas, and the expression was lowest in grade Ⅰ-Ⅱ gliomas (P<0.02～0.001). With the increase in the expression of bcl-2 protein, the cell proliferating activity increased and apoptosis decreased in the tumor cells. There was significant difference of cell proliferation and apoptosis between +++ group and ++ group of bcl-2 protein expression (P<0.05) as well as between both the former groups, and the negative and + group (P<0.01) respectively. Conclusions Over-expression of bcl-2 gene inhibits apoptosis of glioma cells, and the inhibitory intensity increases with the ascending of bcl-2 gene expression level in glioma cells. Both the decrease in apoptosis caused by bcl-2 gene over-expression and the excessive cell proliferation promoted by other gene abnormalities may result in unlimited cell accumulation, which may play an important role in the development and malignant progression of gliomas.
, 百拇医药
Key words Glioma;Proto-oncogene proteins c-bcl-2;Proliferating cell nuclear antigen;Apoptosis
bcl-2 基因是1985年在研究滤泡型B细胞性淋巴瘤染色体t(14；18) (q32；21)异位断裂点时发现的凋亡抑制基因[1-4]。已知bcl-2基因的t(14；18) (q32；21)异位和(或)过度表达所致的凋亡异常减少与多种颅外肿瘤的发生、发展密切相关[1，3，4]。胶质瘤bcl-2基因表达的研究多限于体外细胞系，但关于胶质瘤细胞bcl-2基因表达状况与肿瘤恶性程度、肿瘤细胞增殖活性及凋亡程度关系的大宗病例研究报道甚少。为进一步探讨上述问题，我们采用mRNA原位杂交、原位细胞凋亡检测及免疫组化染色等方法观察了69例人胶质瘤组织，报道如下。
材料与方法
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1.收集我院神经外科1995年手术切除的新鲜胶质瘤标本69份。患者年龄3～66岁。每份标本的一半立即用冷冻包埋剂(OCT)包埋，液氮快速冷冻，-70℃冰箱保存。另一半用3.7%中性甲醛固定，常规石蜡包埋，5 μm厚连续切片备用，并做HE染色确定诊断。按WHO标准进行分类和分级，其中Ⅰ～Ⅱ级组23例(毛细胞型星形细胞瘤1例、纤维型星形细胞瘤14例、原浆型星形细胞瘤8例)，Ⅲ级组21例(均为间变性星形细胞瘤)和Ⅳ级组25例(胶质母细胞瘤21例、髓母细胞瘤4例)。从冰箱取出冷藏标本复温至-23℃，用恒冷切片机做6 μm厚连续冷冻切片，室温干燥10 min，-70℃保存备用。
2.原位杂交：取每例冷冻切片，经4%多聚甲醛-0.1 mol/L PBS(pH 7.4)固定10 min，0.1 mol/L PBS (pH 7.4)摇洗5 min，共3次后，做bcl-2 mRNA原位杂交。bcl-2 cDNA模板购自北京中山生物技术公司，载体质粒为PBluescript ⅡSK，酶切位点为Hind Ⅲ/ EcoRⅠ，全长1.0 kb，经地高辛-dUTP随机引物标记法产生的标记探针与bcl-2第2外显子转录的mRNA翻译序列互补[1]。上述探针标记与检测试剂盒均购自德国宝灵曼公司，探针标记、杂交及杂交后检测程序均按该试剂盒说明进行。杂交设不加探针和不加抗地高辛抗体的对照片，作为阴性对照。
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3.用冷冻切片TUNEL法做原位细胞凋亡检测，切片固定方法与原位杂交相同。TUNEL试剂盒购自德国宝灵曼公司，检测程序按该试剂盒说明进行。检测时设不加TUNEL反应液的切片，作阴性对照。
4.免疫组化染色：取每例石蜡切片，常规脱蜡入水后，放入0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中，经微波加热(92～98℃)10 min，冷却到室温后用单克隆Ⅰ抗ABC法标记bcl-2蛋白(1∶60)和增殖细胞核抗原(PCNA，PC10，1∶30)。PCNA单抗购自丹麦DAKO公司，bcl-2蛋白单抗购自美国Santa Cruz公司，ABC试剂盒购自美国Vector公司。每种免疫组化染色均设阳性和阴性对照。
5.用装有目镜网格测微尺(6 400 μm2)的400倍视野计数8个网格中PCNA阳性和凋亡肿瘤细胞的总数即为其阳性细胞密度(个/0.05 mm2)。用上述同样方法计数8个网格中bcl-2 mRNA和蛋白阳性及阴性肿瘤细胞数，按bcl-2 mRNA和蛋白阳性肿瘤细胞占所得肿瘤细胞总数的百分比，将其分为4个等级：-，无阳性细胞；+，阳性细胞<30%；++，阳性细胞占30%～60%；+++，阳性细胞>60%。用零检验、H和t检验、F和q检验及直线相关分析和等级相关分析对相应数据进行统计学处理。
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结果
1.69例胶质瘤中，有64例(92.8%)不同程度地表达bcl-2 mRNA，其阳性率随肿瘤级别升高而相应增加，Ⅰ～Ⅱ级组与Ⅳ级组间差异有显著性。阳性等级构成比比较显示，+者随肿瘤级别升高而相应减少，+++者随肿瘤级别升高而相应增多，++者以Ⅲ级组最多，3组间差异均有显著性(表1)。bcl-2 mRNA阳性肿瘤细胞为胞质呈紫蓝色均匀着色，阳性肿瘤细胞呈均匀分布(图1)。
表1 不同级别胶质瘤组间bcl-2 mRNA阳性率和
阳性等级构成比的比较
分组
例数
阳性例数
(%)
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阳性等级构成比[例数(%)]**
+
++
+++
Ⅰ～Ⅱ级组
23
19(82.6)*
13(68.4)
3(15.8)
3(15.8)
Ⅲ级组
21
, 百拇医药
20(95.2)
1(5.0)
11(55.0)
8(40.0)
Ⅳ级组
25
25(100.0)
1(4.0)
2(8.0)
22(88.0)
合计
69
64(92.8)
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15(23.4)
16(25.0)
33(51.6)
注：*经零检验证实与Ⅳ级组比P<0.05；**经两两比较t检验证实3组间P<0.01～0.001 2.69例胶质瘤中，有60例(87.0%)不同程度的表达bcl-2蛋白，其阳性率随肿瘤级别升高而相应增加，Ⅰ～Ⅱ级组与Ⅳ级组间差异有显著性。阳性等级构成比比较显示，+者随肿瘤级别升高而相应减少，+++者随肿瘤级别升高而相应增多，++者以Ⅲ级组最多，3组间差异均有显著性(表2)。bcl-2 蛋白阳性肿瘤细胞为胞质呈棕黄色均匀着色，阳性肿瘤细胞呈散在分布(图2)。
表2 不同级别胶质瘤组间bcl-2蛋白阳性率和
阳性等级构成比的比较
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分组
例数
阳性例数
(%)
阳性等级构成比[例数(%)]**
+
++
+++
Ⅰ～Ⅱ级组
23
17(73.9)*
10(58.8)
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4(23.5)
3(17.7)
Ⅲ级组
21
18(85.7)
2(11.1)
11(61.1)
5(27.8)
Ⅳ级组
25
25(100.0)
1(4.0)
, 百拇医药 4(16.0)
20(80.0)
合计
69
60(87.0)
13(21.7)
19(31.7)
28(46.6)
*经零检验证实与Ⅳ级组比P<0.05；**经两两比较t检验证实3组间P<0.02～0.001 3.本组69例胶质瘤中，bcl-2 mRNA -、+、++、+++者分别占7.3% (5/69)、21.7% (15/69)、 23.2%(16/69)和47.8%(33/69)，bcl-2蛋白-、+、++、+++者分别占13.1% (9/69)、18.8% (13/69)、27.5% (19/69) 和40.6% (28/69)。经等级相关分析证实，bcl-2 mRNA和蛋白表达的等级间呈显著性正相关(rs=0.999,P<0.01)。
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4.69例胶质瘤PCNA表达和细胞凋亡的阳性率均为100%，总PCNA阳性肿瘤细胞密度为(165.5±91.8)个/0.05 mm2，总凋亡肿瘤细胞密度为(52.5±21.6)个/0.05 mm2，直线相关分析证实两者间呈显著性负相关(r=-0.761,P<0.01)。PCNA阳性肿瘤细胞密度随肿瘤细胞bcl-2蛋白表达水平升高而相应增加，凋亡肿瘤细胞密度随肿瘤细胞bcl-2蛋白表达水平升高而相应减少，除bcl-2蛋白-组与+组间P>0.05外，其余各组间PCNA阳性和凋亡肿瘤细胞密度的差异均有显著性(表3)。PCNA阳性肿瘤细胞为核呈棕黄色着色，凋亡肿瘤细胞为核呈紫蓝色着色，这两种肿瘤细胞均呈不均匀散在分布(图3,4)。
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图1 胶质母细胞瘤中表达bcl-2 mRNA的阳性肿瘤细胞，胞质呈紫蓝色着色，多数肿瘤细胞呈阳性表达，分布均匀 原位杂交×400 图2 胶质母细胞瘤中表达bcl-2蛋白的阳性肿瘤细胞，胞质呈棕黄色着色，阳性肿瘤细胞呈散在分布 ABC法×400 图3 纤维型星形细胞瘤中表达PCNA的阳性肿瘤细胞，胞核呈棕黄色着色，阳性肿瘤细胞呈不均匀散在分布 ABC法×200 图4 间变性星形细胞瘤中的凋亡肿瘤细胞，胞核呈紫蓝色着色，凋亡肿瘤细胞呈不均匀散在分布 TUNEL法×400表3 bcl-2蛋白表达水平不同胶质瘤组间PCNA阳性和
凋亡肿瘤细胞密度的比较(
±s)
bcl-2蛋白
表达
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总例数
细胞密度(个/0.05 mm2)
PCNA阳性
凋亡细胞
-
9
60.7±1.6
75.7±1.2
+
13
61.6±1.9
65.8±1.4
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++
19
147.9±1.6△
42.7±1.5△
+++
28
200.3±1.6△▲
30.2±1.6△▲
F值
24.99
18.61
, 百拇医药 P值
<0.01
<0.01
注：q检验：△与bcl-2蛋白-组和+组比较，P<0.01，▲与bcl-2蛋白++组比较，P<0.05讨论
正常情况下bcl-2基因定位于人染色体18q21[1]，其编码产物bcl-2蛋白可通过拮抗野生型p53蛋白的促凋亡作用、将c-myc蛋白由促凋亡逆转为抑制凋亡、稳定线粒体的结构和功能及阻断caspase酶类活化的上游信号传递通路等作用抑制多种因素诱发的细胞凋亡，参与细胞增殖与凋亡动态平衡的调控[2，3，5，6]。bcl-2基因表达异常增加可使已有基因异常改变的细胞逃避凋亡， 由此引起的基因异常事件的累积是导致细胞转化和肿瘤形成的必要前提[2，3，5]。浸润性生长是胶质瘤的一大特征，其浸润能力与肿瘤恶性程度呈正比。最近经体外细胞系研究发现，胶质瘤细胞表达的bcl-2蛋白可通过促进基质金属蛋白酶(MMPs)合成、分泌和活化提高胶质瘤细胞浸润性生长的能力[7]。本组69例胶质瘤中，bcl-2 mRNA和蛋白的阳性率分别为92.8%和87.0%，两者的阳性率均显示Ⅰ～Ⅱ级组低于Ⅳ级组，差异有显著性。bcl-2 mRNA和蛋白阳性肿瘤细胞的含量间呈显著性正相关，并均随肿瘤级别升高而相应增加，不同级别的3组胶质瘤间差异均有显著性。提示胶质瘤细胞普遍有bcl-2基因mRNA转录和蛋白翻译的一致性过度表达，且表达水平随肿瘤恶性程度升高而相应递增，并与胶质瘤的发生、恶性进展及浸润性生长能力的获得密切相关[2，4，5，7，8]。
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肿瘤的发生是多种基因异常综合作用，导致细胞过度增殖和(或)凋亡抑制，进而造成细胞无限蓄积的结果[2，4，5]。尽管这些基因异常介导的生物信号分别干扰细胞增殖和凋亡调控网络的不同环节，但它们的作用是相互协同，密切相关的[2，5，9，10]。近来发现，p53基因失活或突变及蛋白激酶C活化均可促进细胞增殖，并通过上调bcl-2基因表达抑制细胞凋亡[6，9，11，12]，而血小板源生长因子B链的纯合二聚体(PDGFBB)与其细胞膜受体结合后激发的一系列级联反应则是通过活化蛋白激酶C介导其促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的生物学效应[10，13]。本组69例胶质瘤增殖期细胞标记物PCNA表达及凋亡肿瘤细胞的阳性率均为100%，两种阳性肿瘤细胞密度间呈显著性负相关。随肿瘤细胞bcl-2蛋白表达水平升高PCNA阳性肿瘤细胞密度相应增加，凋亡肿瘤细胞密度则相应减少，除bcl-2蛋白-组与+组间外，bcl-2蛋白表达水平不同的其余组间PCNA阳性肿瘤细胞及凋亡肿瘤细胞密度的差异均有显著性。作者最近的研究表明，胶质瘤既有细胞过度增殖，又有细胞凋亡异常减少，肿瘤细胞普遍有突变型p53蛋白、PDGFBB及其受体高表达，后两者形成一个具有高效信号介导功能的异常自分泌环，且突变型p53蛋白表达水平及PDGFBB自分泌环活性均随肿瘤级别升高而相应增加，并均与肿瘤细胞增殖活性呈正相关，与肿瘤细胞凋亡程度呈负相关[9，10]，和本次研究中bcl-2 mRNA及bcl-2蛋白表达的趋势、以及bcl-2蛋白表达水平与肿瘤细胞增殖活性和凋亡程度的关系完全一致。结合他人及我们以往的研究结果提示，bcl-2基因表达异常增加可抑制胶质瘤细胞凋亡，抑制强度随肿瘤细胞bcl-2基因表达水平升高而相应增加，突变型p53蛋白过度表达及PDGFBB自分泌环活性异常增加可能是导致胶质瘤细胞过度增殖和bcl-2基因表达异常增加的直接因素[6，9-13]，虽然bcl-2基因表达异常增加可能不是胶质瘤细胞过度增殖的直接原因[2，3]，但两者之间的协同作用可引起细胞无限蓄积，并在胶质瘤发生及恶性进展过程中起重要作用[4，9，10]。
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基金项目：天津市教委重点学科科研基金资助项目
参考文献：
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收稿日期：1999-07-11, 百拇医药
单位：于士柱(天津医科大学总医院 天津市神经病学研究所 300052)；浦佩玉(天津医科大学总医院 天津市神经病学研究所 300052)；江德华(天津医科大学总医院 天津市神经病学研究所 300052)；安同岭(天津医科大学总医院 天津市神经病学研究所 300052)；管欣琴(天津医科大学总医院 天津市神经病学研究所 300052)；杨露春(天津医科大学总医院 天津市神经病学研究所 300052)
关键词：神经胶质瘤；原致癌基因蛋白质c-bcl-2；增殖细胞核抗原；脱噬作用
摘 要 目的 探讨胶质瘤细胞bcl摘 要 目的 探讨胶质瘤细胞bcl-2基因表达水平与肿瘤恶性程度、细胞增殖活性及凋亡程度的关系。方法 以69例不同级别的人胶质瘤组织为研究对象，用原位杂交及免疫组化染色ABC法分别检测bcl-2 mRNA、bcl-2蛋白和增殖细胞核抗原(细胞增殖活性标记物)的表达，并用3′末端标记法做原位细胞凋亡检测。结果 64例(92.8%)表达bcl-2 mRNA，60例(87.0%)表达bcl-2蛋白，两者的表达水平呈正相关(rs=0.999，P<0.01)，并均显示Ⅰ～Ⅱ级组低于Ⅲ级组，Ⅳ级组最高(P<0.02～0.001)。随肿瘤细胞bcl-2蛋白表达水平升高其增殖活性相应增加，凋亡相应减少，bcl-2蛋白+++组与++组间(P<0.05)及前两组分别与-组和+组间(P<0.01)这两种指标的差异均有显著性。结论 胶质瘤细胞bcl-2基因高表达可抑制其凋亡，可能由此引起的细胞凋亡减少与其他基因异常所致的细胞过度增殖共同导致细胞无限蓄积，并在胶质瘤发生、发展中均起重要作用。
, http://www.100md.com
Relationship of bcl-2 gene expression with cell proliferation and apoptosis in human gliomas
YU Shizhu PU Peiyu JIANG Dehua AN Tongling GUAN Xinqin YANG Luchun
(Department of Neuropathology, Neurology Institute, Tianjin Medical University General Hospital, Tianjin 300052, China)
Abstract Objective To investigate the relationship of bcl-2 gene expression level in human gliomas with the malignant degree, cell proliferative activity and apoptosis of the tumors. Methods The expression of bcl-2 mRNA, bcl-2 protein and proliferating cell antigen, and the apoptosis in sixty-nine human glioma specimens with different malignant grades were studied using in situ hybridization, in situ cell death detection (TUNEL method) and immunohistochemistry. Results Of the 69 gliomas, 64 (92.8%) and 60 (87.0%) expressed bcl-2 mRNA and bcl-2 protein, respectively. The expression levels of bcl-2 mRNA and bcl-2 protein were correlated positively with each other (rs=0.999, P<0.01). The expression levels of bcl-2 mRNA and bcl-2 protein were both higher in WHO grade IV gliomas than in grade III gliomas, and the expression was lowest in grade Ⅰ-Ⅱ gliomas (P<0.02～0.001). With the increase in the expression of bcl-2 protein, the cell proliferating activity increased and apoptosis decreased in the tumor cells. There was significant difference of cell proliferation and apoptosis between +++ group and ++ group of bcl-2 protein expression (P<0.05) as well as between both the former groups, and the negative and + group (P<0.01) respectively. Conclusions Over-expression of bcl-2 gene inhibits apoptosis of glioma cells, and the inhibitory intensity increases with the ascending of bcl-2 gene expression level in glioma cells. Both the decrease in apoptosis caused by bcl-2 gene over-expression and the excessive cell proliferation promoted by other gene abnormalities may result in unlimited cell accumulation, which may play an important role in the development and malignant progression of gliomas.
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Key words Glioma;Proto-oncogene proteins c-bcl-2;Proliferating cell nuclear antigen;Apoptosis
bcl-2 基因是1985年在研究滤泡型B细胞性淋巴瘤染色体t(14；18) (q32；21)异位断裂点时发现的凋亡抑制基因[1-4]。已知bcl-2基因的t(14；18) (q32；21)异位和(或)过度表达所致的凋亡异常减少与多种颅外肿瘤的发生、发展密切相关[1，3，4]。胶质瘤bcl-2基因表达的研究多限于体外细胞系，但关于胶质瘤细胞bcl-2基因表达状况与肿瘤恶性程度、肿瘤细胞增殖活性及凋亡程度关系的大宗病例研究报道甚少。为进一步探讨上述问题，我们采用mRNA原位杂交、原位细胞凋亡检测及免疫组化染色等方法观察了69例人胶质瘤组织，报道如下。
材料与方法
, 百拇医药
1.收集我院神经外科1995年手术切除的新鲜胶质瘤标本69份。患者年龄3～66岁。每份标本的一半立即用冷冻包埋剂(OCT)包埋，液氮快速冷冻，-70℃冰箱保存。另一半用3.7%中性甲醛固定，常规石蜡包埋，5 μm厚连续切片备用，并做HE染色确定诊断。按WHO标准进行分类和分级，其中Ⅰ～Ⅱ级组23例(毛细胞型星形细胞瘤1例、纤维型星形细胞瘤14例、原浆型星形细胞瘤8例)，Ⅲ级组21例(均为间变性星形细胞瘤)和Ⅳ级组25例(胶质母细胞瘤21例、髓母细胞瘤4例)。从冰箱取出冷藏标本复温至-23℃，用恒冷切片机做6 μm厚连续冷冻切片，室温干燥10 min，-70℃保存备用。
2.原位杂交：取每例冷冻切片，经4%多聚甲醛-0.1 mol/L PBS(pH 7.4)固定10 min，0.1 mol/L PBS (pH 7.4)摇洗5 min，共3次后，做bcl-2 mRNA原位杂交。bcl-2 cDNA模板购自北京中山生物技术公司，载体质粒为PBluescript ⅡSK，酶切位点为Hind Ⅲ/ EcoRⅠ，全长1.0 kb，经地高辛-dUTP随机引物标记法产生的标记探针与bcl-2第2外显子转录的mRNA翻译序列互补[1]。上述探针标记与检测试剂盒均购自德国宝灵曼公司，探针标记、杂交及杂交后检测程序均按该试剂盒说明进行。杂交设不加探针和不加抗地高辛抗体的对照片，作为阴性对照。
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3.用冷冻切片TUNEL法做原位细胞凋亡检测，切片固定方法与原位杂交相同。TUNEL试剂盒购自德国宝灵曼公司，检测程序按该试剂盒说明进行。检测时设不加TUNEL反应液的切片，作阴性对照。
4.免疫组化染色：取每例石蜡切片，常规脱蜡入水后，放入0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中，经微波加热(92～98℃)10 min，冷却到室温后用单克隆Ⅰ抗ABC法标记bcl-2蛋白(1∶60)和增殖细胞核抗原(PCNA，PC10，1∶30)。PCNA单抗购自丹麦DAKO公司，bcl-2蛋白单抗购自美国Santa Cruz公司，ABC试剂盒购自美国Vector公司。每种免疫组化染色均设阳性和阴性对照。
5.用装有目镜网格测微尺(6 400 μm2)的400倍视野计数8个网格中PCNA阳性和凋亡肿瘤细胞的总数即为其阳性细胞密度(个/0.05 mm2)。用上述同样方法计数8个网格中bcl-2 mRNA和蛋白阳性及阴性肿瘤细胞数，按bcl-2 mRNA和蛋白阳性肿瘤细胞占所得肿瘤细胞总数的百分比，将其分为4个等级：-，无阳性细胞；+，阳性细胞<30%；++，阳性细胞占30%～60%；+++，阳性细胞>60%。用零检验、H和t检验、F和q检验及直线相关分析和等级相关分析对相应数据进行统计学处理。
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结果
1.69例胶质瘤中，有64例(92.8%)不同程度地表达bcl-2 mRNA，其阳性率随肿瘤级别升高而相应增加，Ⅰ～Ⅱ级组与Ⅳ级组间差异有显著性。阳性等级构成比比较显示，+者随肿瘤级别升高而相应减少，+++者随肿瘤级别升高而相应增多，++者以Ⅲ级组最多，3组间差异均有显著性(表1)。bcl-2 mRNA阳性肿瘤细胞为胞质呈紫蓝色均匀着色，阳性肿瘤细胞呈均匀分布(图1)。
表1 不同级别胶质瘤组间bcl-2 mRNA阳性率和
阳性等级构成比的比较
分组
例数
阳性例数
(%)
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阳性等级构成比[例数(%)]**
+
++
+++
Ⅰ～Ⅱ级组
23
19(82.6)*
13(68.4)
3(15.8)
3(15.8)
Ⅲ级组
21
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20(95.2)
1(5.0)
11(55.0)
8(40.0)
Ⅳ级组
25
25(100.0)
1(4.0)
2(8.0)
22(88.0)
合计
69
64(92.8)
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15(23.4)
16(25.0)
33(51.6)
注：*经零检验证实与Ⅳ级组比P<0.05；**经两两比较t检验证实3组间P<0.01～0.001 2.69例胶质瘤中，有60例(87.0%)不同程度的表达bcl-2蛋白，其阳性率随肿瘤级别升高而相应增加，Ⅰ～Ⅱ级组与Ⅳ级组间差异有显著性。阳性等级构成比比较显示，+者随肿瘤级别升高而相应减少，+++者随肿瘤级别升高而相应增多，++者以Ⅲ级组最多，3组间差异均有显著性(表2)。bcl-2 蛋白阳性肿瘤细胞为胞质呈棕黄色均匀着色，阳性肿瘤细胞呈散在分布(图2)。
表2 不同级别胶质瘤组间bcl-2蛋白阳性率和
阳性等级构成比的比较
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分组
例数
阳性例数
(%)
阳性等级构成比[例数(%)]**
+
++
+++
Ⅰ～Ⅱ级组
23
17(73.9)*
10(58.8)
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4(23.5)
3(17.7)
Ⅲ级组
21
18(85.7)
2(11.1)
11(61.1)
5(27.8)
Ⅳ级组
25
25(100.0)
1(4.0)
, 百拇医药 4(16.0)
20(80.0)
合计
69
60(87.0)
13(21.7)
19(31.7)
28(46.6)
*经零检验证实与Ⅳ级组比P<0.05；**经两两比较t检验证实3组间P<0.02～0.001 3.本组69例胶质瘤中，bcl-2 mRNA -、+、++、+++者分别占7.3% (5/69)、21.7% (15/69)、 23.2%(16/69)和47.8%(33/69)，bcl-2蛋白-、+、++、+++者分别占13.1% (9/69)、18.8% (13/69)、27.5% (19/69) 和40.6% (28/69)。经等级相关分析证实，bcl-2 mRNA和蛋白表达的等级间呈显著性正相关(rs=0.999,P<0.01)。
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4.69例胶质瘤PCNA表达和细胞凋亡的阳性率均为100%，总PCNA阳性肿瘤细胞密度为(165.5±91.8)个/0.05 mm2，总凋亡肿瘤细胞密度为(52.5±21.6)个/0.05 mm2，直线相关分析证实两者间呈显著性负相关(r=-0.761,P<0.01)。PCNA阳性肿瘤细胞密度随肿瘤细胞bcl-2蛋白表达水平升高而相应增加，凋亡肿瘤细胞密度随肿瘤细胞bcl-2蛋白表达水平升高而相应减少，除bcl-2蛋白-组与+组间P>0.05外，其余各组间PCNA阳性和凋亡肿瘤细胞密度的差异均有显著性(表3)。PCNA阳性肿瘤细胞为核呈棕黄色着色，凋亡肿瘤细胞为核呈紫蓝色着色，这两种肿瘤细胞均呈不均匀散在分布(图3,4)。
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图1 胶质母细胞瘤中表达bcl-2 mRNA的阳性肿瘤细胞，胞质呈紫蓝色着色，多数肿瘤细胞呈阳性表达，分布均匀 原位杂交×400 图2 胶质母细胞瘤中表达bcl-2蛋白的阳性肿瘤细胞，胞质呈棕黄色着色，阳性肿瘤细胞呈散在分布 ABC法×400 图3 纤维型星形细胞瘤中表达PCNA的阳性肿瘤细胞，胞核呈棕黄色着色，阳性肿瘤细胞呈不均匀散在分布 ABC法×200 图4 间变性星形细胞瘤中的凋亡肿瘤细胞，胞核呈紫蓝色着色，凋亡肿瘤细胞呈不均匀散在分布 TUNEL法×400表3 bcl-2蛋白表达水平不同胶质瘤组间PCNA阳性和
凋亡肿瘤细胞密度的比较(
±s)bcl-2蛋白
表达
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总例数
细胞密度(个/0.05 mm2)
PCNA阳性
凋亡细胞
-
9
60.7±1.6
75.7±1.2
+
13
61.6±1.9
65.8±1.4
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++
19
147.9±1.6△
42.7±1.5△
+++
28
200.3±1.6△▲
30.2±1.6△▲
F值
24.99
18.61
, 百拇医药 P值
<0.01
<0.01
注：q检验：△与bcl-2蛋白-组和+组比较，P<0.01，▲与bcl-2蛋白++组比较，P<0.05讨论
正常情况下bcl-2基因定位于人染色体18q21[1]，其编码产物bcl-2蛋白可通过拮抗野生型p53蛋白的促凋亡作用、将c-myc蛋白由促凋亡逆转为抑制凋亡、稳定线粒体的结构和功能及阻断caspase酶类活化的上游信号传递通路等作用抑制多种因素诱发的细胞凋亡，参与细胞增殖与凋亡动态平衡的调控[2，3，5，6]。bcl-2基因表达异常增加可使已有基因异常改变的细胞逃避凋亡， 由此引起的基因异常事件的累积是导致细胞转化和肿瘤形成的必要前提[2，3，5]。浸润性生长是胶质瘤的一大特征，其浸润能力与肿瘤恶性程度呈正比。最近经体外细胞系研究发现，胶质瘤细胞表达的bcl-2蛋白可通过促进基质金属蛋白酶(MMPs)合成、分泌和活化提高胶质瘤细胞浸润性生长的能力[7]。本组69例胶质瘤中，bcl-2 mRNA和蛋白的阳性率分别为92.8%和87.0%，两者的阳性率均显示Ⅰ～Ⅱ级组低于Ⅳ级组，差异有显著性。bcl-2 mRNA和蛋白阳性肿瘤细胞的含量间呈显著性正相关，并均随肿瘤级别升高而相应增加，不同级别的3组胶质瘤间差异均有显著性。提示胶质瘤细胞普遍有bcl-2基因mRNA转录和蛋白翻译的一致性过度表达，且表达水平随肿瘤恶性程度升高而相应递增，并与胶质瘤的发生、恶性进展及浸润性生长能力的获得密切相关[2，4，5，7，8]。
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肿瘤的发生是多种基因异常综合作用，导致细胞过度增殖和(或)凋亡抑制，进而造成细胞无限蓄积的结果[2，4，5]。尽管这些基因异常介导的生物信号分别干扰细胞增殖和凋亡调控网络的不同环节，但它们的作用是相互协同，密切相关的[2，5，9，10]。近来发现，p53基因失活或突变及蛋白激酶C活化均可促进细胞增殖，并通过上调bcl-2基因表达抑制细胞凋亡[6，9，11，12]，而血小板源生长因子B链的纯合二聚体(PDGFBB)与其细胞膜受体结合后激发的一系列级联反应则是通过活化蛋白激酶C介导其促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的生物学效应[10，13]。本组69例胶质瘤增殖期细胞标记物PCNA表达及凋亡肿瘤细胞的阳性率均为100%，两种阳性肿瘤细胞密度间呈显著性负相关。随肿瘤细胞bcl-2蛋白表达水平升高PCNA阳性肿瘤细胞密度相应增加，凋亡肿瘤细胞密度则相应减少，除bcl-2蛋白-组与+组间外，bcl-2蛋白表达水平不同的其余组间PCNA阳性肿瘤细胞及凋亡肿瘤细胞密度的差异均有显著性。作者最近的研究表明，胶质瘤既有细胞过度增殖，又有细胞凋亡异常减少，肿瘤细胞普遍有突变型p53蛋白、PDGFBB及其受体高表达，后两者形成一个具有高效信号介导功能的异常自分泌环，且突变型p53蛋白表达水平及PDGFBB自分泌环活性均随肿瘤级别升高而相应增加，并均与肿瘤细胞增殖活性呈正相关，与肿瘤细胞凋亡程度呈负相关[9，10]，和本次研究中bcl-2 mRNA及bcl-2蛋白表达的趋势、以及bcl-2蛋白表达水平与肿瘤细胞增殖活性和凋亡程度的关系完全一致。结合他人及我们以往的研究结果提示，bcl-2基因表达异常增加可抑制胶质瘤细胞凋亡，抑制强度随肿瘤细胞bcl-2基因表达水平升高而相应增加，突变型p53蛋白过度表达及PDGFBB自分泌环活性异常增加可能是导致胶质瘤细胞过度增殖和bcl-2基因表达异常增加的直接因素[6，9-13]，虽然bcl-2基因表达异常增加可能不是胶质瘤细胞过度增殖的直接原因[2，3]，但两者之间的协同作用可引起细胞无限蓄积，并在胶质瘤发生及恶性进展过程中起重要作用[4，9，10]。
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基金项目：天津市教委重点学科科研基金资助项目
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收稿日期：1999-07-11, 百拇医药