骨髓型急性放射病患者红细胞膜蛋白组成与功能变化特征
作者：李津婴 魏善建 胡小健 张志鸿 周汉清
单位：200433 上海，第二军医大学长海医院(李津婴)；第二军医大学高分子生物研究室(魏善建)；复旦大学生物物理系(胡小健 张志鸿 周汉清)
关键词：辐射损伤；红细胞膜蛋白；阴离子转运
中华放射医学与防护杂志980111.htm 目的 观察辐射对红细胞膜损伤的远后效应。方法 应用7.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳法、Percoll梯度密度离心、NO-2通透速率测定、DIDS通透抑制率测定等方法，分析5例骨髓型急性放射病(ARS)患者受照后第6年红细胞膜蛋白组成与功能。结果 辐射对膜蛋白的损伤持续存在，损伤特征为带8蛋白含量减少，带3蛋白阴离子转运功能低下。进一步分析结果显示，ARS年轻红细胞对NO-2通透时间延迟较中、老年细胞变化明显；ARS红细胞对DIDS通透抑制效应下降。结论 结果提示，辐射对红细胞膜蛋白的损伤环节在骨髓红细胞合成期；ARS红细胞膜外侧带3结合位点可能发生病变，导致阴离子转运功能下降；同时，ARS红细胞可能存在提前衰老机制。
, 百拇医药
Characterization of changes in composition and function of erythrocyte membrane proteins in patients with bone marrow form of acute radiation sickness. Li Jinying\+1,Wei Shanjian\+2,Hu Xiaojian\+3,et al.1. Changhai Hospital,Shanghai 200433,China.2. Biomacromolecule Research Laboratory,The Second Military Medical University,Shanghai 200433,China .3. Department of Biophysiology,Fudan University,Shanghai 200433,China.
Objective The delayed effect of radiation on erythtocyte membrane protein,the composition and function of the membrane proteins in five patients with bone marrow form of acute radiation sickness(ARS) were follow up at six years after the Shanghai 60Co irradiation accident. Methods Percoll centrifugation,SDS-polyacryamide gel electrophoresis,and analysis of NO-2 transport rate and DIDS inhibition rate were performed. Results The injuries of the membrane proteins induced by radiation,characterized by reduced content of band 8 and declined anion transport function of band 3 protein remained the same as initially observed.The further study showed that the inhibition of DIDS on the anion transport of the ARS erythrocytes was decreased and the transport time for NO-2 by band 3 was significantly prolonged in younger erythrocytes than those in middle-or old-aged cells. Conclusion It is suggested that the radiation damage to erythrocyte membrane proteins might occur at the stage of erythropoiesis in bone marrow.The exofacial site in band 3 may be changed after radiation,which could result in the abnormalities in anion transport.It is believed that the aging of erythrocytes might be present in advanced stage of ARS.
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Key words Radiation damage Erythrocyte membrane protein Anion transport
对骨髓型急性放射病(ARS)患者红细胞膜蛋白初步研究显示，辐射可损伤膜蛋白的组成与功能，表现为受照后初期带8蛋白含量明显减少，嵌膜带3蛋白阴离子转运功能受损，对亚硝酸根(NO-2)跨膜运输时间明显延长[1]。本文作者对受照后第6年ARS上述指标进行复查，结果表明辐射对膜蛋白的损伤持续存在，且以新生红细胞病变严重。
1 材料和方法
1.1 病例：收集“6.25”60Co源辐射事故5例患者新鲜全血，肝素抗凝，冰冷生理盐水清洗。取部分压积红细胞作总Ts测定和梯度分离后Ts测定，其余细胞按低渗溶血法(10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA)制成红细胞膜制剂。
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1.2 方法：Percoll梯度分离。按文献[2]方法配制60%，63%，66%，69%Percoll梯度分离液，分离红细胞。年轻红细胞分布于60%～63%层(Y)，中年红细胞分布于66%层(M)，老年红细胞分布于69%层(O)。
红细胞阴离子转运功能测定：按张志鸿方法[3]进行，分别测定未分离红细胞和梯度分离后各年龄层红细胞对NO-2跨膜运输时间(Ts)。
DIDS通透抑制效应测定：以阴离子转运特异抑制剂4，4′-二异硫氰基-2，2′-二磺基芪(DIDS)作“探针”，测定22μmol/L浓度DIDS对ARS红细胞NO-2通透抑制效应，由K～Ts标准曲线得Kt和Kt(D)，由1-Kt(D)/Kt得DIDS抑制率(%)。
红细胞膜蛋白电泳：按前述条件[1]进行7.5%SDS-PAGE。
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2 结果
2.1 红细胞NO-2通透速率(Ts)和DIDS通透抑制效应
Ts测定结果显示，5例ARS中1例Ts明显延长。DIDS通透抑制效应测定结果有3例低于正常范围下限(表1)。用Percoll梯度分离红细胞，进一步分析带3蛋白阴离子转运功能，发现有4例ARS处于60%Percoll层的年轻红细胞(Y)Ts明显延迟，超过正常范围上限，甚至长于69%Percoll层(O)老年细胞通透时间(表2)。DIDS抑制率(%)与NO-2通透速率(Ts)之间没有平行变化关系。
2.2 红细胞膜蛋白含量分析
比较膜蛋白相对含量比值(表3)，具有阴离子转运功能的带3蛋白含量在ARS未见明显变化；电泳扫描图谱中，带8蛋白呈肩胛形低峰(附图)，5例(5/5)ARS带8含量均低于正常范围下限。
, 百拇医药
表1 红细胞NO-2通透速率和DIDS通透抑制效应 病例
Ts(NO-2)
1-Kt(D)/Kt(%)
龙
30.09
68.70
俊
21.41
76.22
武
18.72
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60.00
给
23.59
70.59
军
22.07
62.78
±s
23.18±3.80
67.66±5.75
正常对照\+*
20.21±2.02
72.43±0.57
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注：* n=4(下表同)表2 不同年龄红细胞NO-2通透速率 病例
Ts
Y
M
O
龙
16.88
14.73
19.30
俊
9.42
11.14
, 百拇医药
10.76
武
12.22
9.43
9.58
给
15.03
15.97
12.02
军
15.20
10.08
15.72
±s
, 百拇医药
13.75±2.94
12.27±2.91
13.48±3.99
正常对照
9.31±0.82
11.35±2.46
12.87±2.58
表3 红细胞膜蛋白相对含量比值 病例
sp/b3
b3/b4
b8/b7
龙
, 百拇医药
1.11
4.46
0.61
俊
1.12
4.10
0.55
武
1.10
4.18
0.78
给
0.97
, 百拇医药
3.86
0.76
军
1.09
4.22
0.69
正常对照
1.07±0.06
4.24±0.59
0.87±0.04
3 讨论
对ARS 5例患者红细胞膜蛋白初步分析表明，受照后初期，带3蛋白阴离子转运功能明显下降(占75%)，膜蛋白组分中带8蛋白含量显著减少(占100%)。本文作者对受照后第6年ARS病人上述指标再次测定，结果显示，带8含量仍低于正常范围(占100%)；红细胞对NO-2转运速率的总和测值Ts在5例ARS中虽然仅一例表现延迟，但是梯度分离红细胞后测定各年龄层细胞的Ts，发现有4例ARS
, 百拇医药
附图 照射后第6年红细胞膜蛋白SDS-PAGE扫描图谱(A600nm)
年轻红细胞Ts延迟比中、老年细胞变化明显占80%；ARS的DIDS抑制效应低于正常(占60%)。结果表明，辐射对红细胞膜蛋白组成与功能的损伤在受照后第6年仍有不同程度地持续存在，而且病变以年轻细胞群为严重，提示辐射损伤环节在骨髓红细胞合成期，为骨髓造血干细胞辐射损伤的病理表现之一；细胞年龄与阴离子转运功能变化的关系，同时提示ARS可能存在红细胞提前衰老机制。受照剂量与上述指标变化之间未见统计学相关意义，但是在受照剂量最大的患者，无论其年轻红细胞还是总和细胞群，Ts延迟均比其他患者变化明显。
带8蛋白的生理意义尚不清楚。而带3蛋白是一种多功能膜蛋白，对红细胞携氧、阴离子跨膜转运、维持pH、调节膜骨架变形性等至关重要。带3在红细胞中天然状态是单体-二聚体-四聚体动态平衡存在，不同功能需要不同的聚合形式，阴离子转运必须以二聚体形式，若解离为单体，阴离子孔道也随即解体。DIDS类抑制剂亦与带3二聚体结合，结合位点(如Lys-539)在红细胞膜外侧，这些位点也是带3阴离子转运活性位残基，一旦与DIDS结合，即可对阴离子转运产生不可逆抑制[4，5]。因此，DIDS结合位点和抑制率变化可以反映出带3转运位点的改变。ARS红细胞膜带3含量没有明显变化，而DIDS抑制效应低下，提示ARS红细胞膜外侧带3结合位点可能发生病变，致使ARS红细胞阴离子转运功能减弱。
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阴离子转运与红细胞pH调节、细胞内离子动态平衡等理化活动密切相关，ARS阴离子转运功能低下可能影响这些活动，加之膜组成异常、胞浆酶活力改变(另文讨论)，可能进而影响ARS患者红细胞寿命。有关问题待进一步研究。
参考文献
1 李津婴，万树栋，张志鸿，等.辐射对人红细胞膜蛋白组成与功能的损伤.上海“6.25”60Co源辐射事故病人诊断与救治文集.刘本FDA1，叶根耀主编.北京科学技术出版社，1994，141-144.
2 Salvo G,Caprari P,Samoggia P,et al.Human erythrocyte separation according to age on a discontinuous Percoll density gradient.Clin Chim Acta,1982,122:293.
3 张志鸿，Deyev AI.红细胞膜对NO-2通透性的研究.生物物理学报，1990，6(2)：254.
4 李津婴，李建新，杨志铭.红细胞膜带3蛋白研究新进展.国外医学分子生物学分册，1987，9(1)：37.
5 Passow H.The band 3 protein:an introduction.Prog Cell Res,1992,2:1.
(收稿：1997-04-15 修回：1997-05-20), http://www.100md.com
单位：200433 上海，第二军医大学长海医院(李津婴)；第二军医大学高分子生物研究室(魏善建)；复旦大学生物物理系(胡小健 张志鸿 周汉清)
关键词：辐射损伤；红细胞膜蛋白；阴离子转运
中华放射医学与防护杂志980111.htm 目的 观察辐射对红细胞膜损伤的远后效应。方法 应用7.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳法、Percoll梯度密度离心、NO-2通透速率测定、DIDS通透抑制率测定等方法，分析5例骨髓型急性放射病(ARS)患者受照后第6年红细胞膜蛋白组成与功能。结果 辐射对膜蛋白的损伤持续存在，损伤特征为带8蛋白含量减少，带3蛋白阴离子转运功能低下。进一步分析结果显示，ARS年轻红细胞对NO-2通透时间延迟较中、老年细胞变化明显；ARS红细胞对DIDS通透抑制效应下降。结论 结果提示，辐射对红细胞膜蛋白的损伤环节在骨髓红细胞合成期；ARS红细胞膜外侧带3结合位点可能发生病变，导致阴离子转运功能下降；同时，ARS红细胞可能存在提前衰老机制。
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Characterization of changes in composition and function of erythrocyte membrane proteins in patients with bone marrow form of acute radiation sickness. Li Jinying\+1,Wei Shanjian\+2,Hu Xiaojian\+3,et al.1. Changhai Hospital,Shanghai 200433,China.2. Biomacromolecule Research Laboratory,The Second Military Medical University,Shanghai 200433,China .3. Department of Biophysiology,Fudan University,Shanghai 200433,China.
Objective The delayed effect of radiation on erythtocyte membrane protein,the composition and function of the membrane proteins in five patients with bone marrow form of acute radiation sickness(ARS) were follow up at six years after the Shanghai 60Co irradiation accident. Methods Percoll centrifugation,SDS-polyacryamide gel electrophoresis,and analysis of NO-2 transport rate and DIDS inhibition rate were performed. Results The injuries of the membrane proteins induced by radiation,characterized by reduced content of band 8 and declined anion transport function of band 3 protein remained the same as initially observed.The further study showed that the inhibition of DIDS on the anion transport of the ARS erythrocytes was decreased and the transport time for NO-2 by band 3 was significantly prolonged in younger erythrocytes than those in middle-or old-aged cells. Conclusion It is suggested that the radiation damage to erythrocyte membrane proteins might occur at the stage of erythropoiesis in bone marrow.The exofacial site in band 3 may be changed after radiation,which could result in the abnormalities in anion transport.It is believed that the aging of erythrocytes might be present in advanced stage of ARS.
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Key words Radiation damage Erythrocyte membrane protein Anion transport
对骨髓型急性放射病(ARS)患者红细胞膜蛋白初步研究显示，辐射可损伤膜蛋白的组成与功能，表现为受照后初期带8蛋白含量明显减少，嵌膜带3蛋白阴离子转运功能受损，对亚硝酸根(NO-2)跨膜运输时间明显延长[1]。本文作者对受照后第6年ARS上述指标进行复查，结果表明辐射对膜蛋白的损伤持续存在，且以新生红细胞病变严重。
1 材料和方法
1.1 病例：收集“6.25”60Co源辐射事故5例患者新鲜全血，肝素抗凝，冰冷生理盐水清洗。取部分压积红细胞作总Ts测定和梯度分离后Ts测定，其余细胞按低渗溶血法(10mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA)制成红细胞膜制剂。
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1.2 方法：Percoll梯度分离。按文献[2]方法配制60%，63%，66%，69%Percoll梯度分离液，分离红细胞。年轻红细胞分布于60%～63%层(Y)，中年红细胞分布于66%层(M)，老年红细胞分布于69%层(O)。
红细胞阴离子转运功能测定：按张志鸿方法[3]进行，分别测定未分离红细胞和梯度分离后各年龄层红细胞对NO-2跨膜运输时间(Ts)。
DIDS通透抑制效应测定：以阴离子转运特异抑制剂4，4′-二异硫氰基-2，2′-二磺基芪(DIDS)作“探针”，测定22μmol/L浓度DIDS对ARS红细胞NO-2通透抑制效应，由K～Ts标准曲线得Kt和Kt(D)，由1-Kt(D)/Kt得DIDS抑制率(%)。
红细胞膜蛋白电泳：按前述条件[1]进行7.5%SDS-PAGE。
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2 结果
2.1 红细胞NO-2通透速率(Ts)和DIDS通透抑制效应
Ts测定结果显示，5例ARS中1例Ts明显延长。DIDS通透抑制效应测定结果有3例低于正常范围下限(表1)。用Percoll梯度分离红细胞，进一步分析带3蛋白阴离子转运功能，发现有4例ARS处于60%Percoll层的年轻红细胞(Y)Ts明显延迟，超过正常范围上限，甚至长于69%Percoll层(O)老年细胞通透时间(表2)。DIDS抑制率(%)与NO-2通透速率(Ts)之间没有平行变化关系。
2.2 红细胞膜蛋白含量分析
比较膜蛋白相对含量比值(表3)，具有阴离子转运功能的带3蛋白含量在ARS未见明显变化；电泳扫描图谱中，带8蛋白呈肩胛形低峰(附图)，5例(5/5)ARS带8含量均低于正常范围下限。
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表1 红细胞NO-2通透速率和DIDS通透抑制效应 病例
Ts(NO-2)
1-Kt(D)/Kt(%)
龙
30.09
68.70
俊
21.41
76.22
武
18.72
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60.00
给
23.59
70.59
军
22.07
62.78
±s
23.18±3.80
67.66±5.75
正常对照\+*
20.21±2.02
72.43±0.57
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注：* n=4(下表同)表2 不同年龄红细胞NO-2通透速率 病例
Ts
Y
M
O
龙
16.88
14.73
19.30
俊
9.42
11.14
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12.22
9.43
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15.03
15.97
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15.20
10.08
15.72
±s, 百拇医药
13.75±2.94
12.27±2.91
13.48±3.99
正常对照
9.31±0.82
11.35±2.46
12.87±2.58
表3 红细胞膜蛋白相对含量比值 病例
sp/b3
b3/b4
b8/b7
龙
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1.11
4.46
0.61
俊
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3.86
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4.22
0.69
正常对照
1.07±0.06
4.24±0.59
0.87±0.04
3 讨论
对ARS 5例患者红细胞膜蛋白初步分析表明，受照后初期，带3蛋白阴离子转运功能明显下降(占75%)，膜蛋白组分中带8蛋白含量显著减少(占100%)。本文作者对受照后第6年ARS病人上述指标再次测定，结果显示，带8含量仍低于正常范围(占100%)；红细胞对NO-2转运速率的总和测值Ts在5例ARS中虽然仅一例表现延迟，但是梯度分离红细胞后测定各年龄层细胞的Ts，发现有4例ARS
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附图 照射后第6年红细胞膜蛋白SDS-PAGE扫描图谱(A600nm)
年轻红细胞Ts延迟比中、老年细胞变化明显占80%；ARS的DIDS抑制效应低于正常(占60%)。结果表明，辐射对红细胞膜蛋白组成与功能的损伤在受照后第6年仍有不同程度地持续存在，而且病变以年轻细胞群为严重，提示辐射损伤环节在骨髓红细胞合成期，为骨髓造血干细胞辐射损伤的病理表现之一；细胞年龄与阴离子转运功能变化的关系，同时提示ARS可能存在红细胞提前衰老机制。受照剂量与上述指标变化之间未见统计学相关意义，但是在受照剂量最大的患者，无论其年轻红细胞还是总和细胞群，Ts延迟均比其他患者变化明显。
带8蛋白的生理意义尚不清楚。而带3蛋白是一种多功能膜蛋白，对红细胞携氧、阴离子跨膜转运、维持pH、调节膜骨架变形性等至关重要。带3在红细胞中天然状态是单体-二聚体-四聚体动态平衡存在，不同功能需要不同的聚合形式，阴离子转运必须以二聚体形式，若解离为单体，阴离子孔道也随即解体。DIDS类抑制剂亦与带3二聚体结合，结合位点(如Lys-539)在红细胞膜外侧，这些位点也是带3阴离子转运活性位残基，一旦与DIDS结合，即可对阴离子转运产生不可逆抑制[4，5]。因此，DIDS结合位点和抑制率变化可以反映出带3转运位点的改变。ARS红细胞膜带3含量没有明显变化，而DIDS抑制效应低下，提示ARS红细胞膜外侧带3结合位点可能发生病变，致使ARS红细胞阴离子转运功能减弱。
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阴离子转运与红细胞pH调节、细胞内离子动态平衡等理化活动密切相关，ARS阴离子转运功能低下可能影响这些活动，加之膜组成异常、胞浆酶活力改变(另文讨论)，可能进而影响ARS患者红细胞寿命。有关问题待进一步研究。
参考文献
1 李津婴，万树栋，张志鸿，等.辐射对人红细胞膜蛋白组成与功能的损伤.上海“6.25”60Co源辐射事故病人诊断与救治文集.刘本FDA1，叶根耀主编.北京科学技术出版社，1994，141-144.
2 Salvo G,Caprari P,Samoggia P,et al.Human erythrocyte separation according to age on a discontinuous Percoll density gradient.Clin Chim Acta,1982,122:293.
3 张志鸿，Deyev AI.红细胞膜对NO-2通透性的研究.生物物理学报，1990，6(2)：254.
4 李津婴，李建新，杨志铭.红细胞膜带3蛋白研究新进展.国外医学分子生物学分册，1987，9(1)：37.
5 Passow H.The band 3 protein:an introduction.Prog Cell Res,1992,2:1.
(收稿：1997-04-15 修回：1997-05-20), http://www.100md.com