用60Coγ射线照射离体人血建立淋巴细胞微核率的剂量效应曲线
作者：宋有志 孙 华 宋桂莲 白立新
单位：062552 河北任邱，华北石油管理局卫生防疫站
关键词：
中华放射医学与防护杂志980312.htm
Heddle 1973年首先推荐用微核法来衡量染色体的损伤[1]。之后，不少学者采用不同辐射类型对人或动物进行了研究，结果表明，在一定的剂量范围内，微核发生率与剂量间呈明确的剂量效应关系[2，3]。为了提高该方法的可靠性，1985年Fenech[4]提出了胞质阻断法观察双核淋巴细胞(M\-1细胞)，克服了以往采用的常规培养法[6]不能识别第一次有丝分裂的弊病，提高了该项指标的准确度。我们的研究目的是在本实验室条件下，利用胞质阻断法(CB法)建立0～6.0Gy范围内微核率的剂量效应曲线，以便一旦发生放射事故，尽快提供受照人员的生物剂量。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 血样和照射条件：血样取自3名健康男性成人，一年内无射线和化学毒物接触史。每例取静脉血20ml，肝素抗凝，混匀，分装10支灭菌玻璃试管内，密封。在37.0±0.5℃的恒温条件下，用60Coγ射线分别照射0，0.10，0.25，0.50，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0Gy，剂量率为0.377Gy/min。照后置37.0±0.5℃温箱内90分钟，然后培养，制片。60Co源和剂量由卫生部次级标准剂量学实验室提供。
1.2 培养、制片：从每个试管中吸取0.5ml血，分别注入装有4ml混合培养液(RPML1640液80%、小牛血清20%、青链霉素各100/ml，PHA适量)的培养瓶中，调pH至7.2～7.4，摇匀，置37.0±0.5℃恒温箱中培养，至40小时加松胞素-B(cyt\|B)，摇匀，继续培养至72小时收获。
, 百拇医药
终止培养后，用吸管去除培养瓶中上清液，加入0.075mol/L KCl 4ml，用吸管吹匀，移入离心管中，立即加新配固定液(甲醇：冰乙酸=3∶1)4ml，吹匀，1000r/min离心10分钟，然后弃上清液。再重复固定一次，弃上清液，沉淀物滴片，用GIEMSA染色。
1.3 观察计数和统计分析方法
1.3.1 分析方法和记数细胞数：采用双育法阅片，只观察双核淋巴细胞。判断标准：微核必须与主核分开，两者重叠或相切时应清楚地看到各自的核膜，结构与主核相同，着色与主核一致或■浅，大小不能超过主核的1/3。结果用微核细胞率和微核率表示。
应分析计数细胞数的确定，主要根据微核细胞率符合二项式分布的原理，用二项式分布95%可信限公式：n=(1-p)×96.04/p(这时采用20%的允许误差)来计算应分析计数的细胞数。
1.3.2 给出的结果，根据WHO(1973)提供的下列四种模式进行曲线的拟合①Y=a+bP;②Y=a+cD\+2;③Y=kD\+n;④Y=a+bD+cD\+2(Y为微核率(‰)，D为剂量(Gy)，a为自发微核率，b、c为回归系数，k为常数，n为幂次)，用最小平方和法对所得数据进行曲线拟合和拟合度检验。
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2 结果
本试验共观察各剂量点双核CB细胞52 514个， 对微核细胞数和微核数进行了统计，结果见附表。
附表 各剂量点微核细胞率和微核率 剂 量(Gy)
观察细胞数
(个)
微核细胞率
(P±Sp‰)
微核率
(P±Sp‰)
0.00
14910
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8.5±0.75
10.0±0.81
0.10
11664
14.3±1.10
15.7±1.15
0.25
10064
23.6±1.50
25.2±1.56
0.50
4532
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38.8±2.87
41.0±2.95
1.00
4074
79.0±4.23
86.2±4.40
2.00
2100
223.8±9.10
262.4±9.60
3.00
2100
, 百拇医药
396.7±10.68
524.8±10.89
4.00
1040
523.1±15.49
769.2±18.09
5.00
1040
710.5±18.06
1234.6±28.25
6.00
1000
, 百拇医药
857.0±27.15
1577.0±35.14
对0—0.5Gy；0—5.0Gy；0—6.0Gy三个剂量范围内所得数据按WHO提供的四种数学模式用最小平方和法进行曲线拟合，对回归系数进行显著性检验，对方程拟合度进行相关指数检验。根据各方程式的回归系数显著性检验(P值)、拟合度(R\+2值)以及q值的差异等指标，选出了上述三个剂量范围内的最佳回归方程：
0—0.5Gy(微核率)；Y=9.7326+62.3172D;
0—5.0Gy(微核率)；Y=33.6905+48.1881D\+2;
0—6.0Gy(微核率)；Y=10.0+72.7436D+32.3761D\+2;
其相应的剂量效应曲线绘图如下：
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图1 0～5.0Gy微核率剂量效应曲线
图2 0～0.5Gy微核率剂量效应曲线
3 讨论
CB法细胞微核测定技术是一种较好估算生物剂量的方法。自从Countryman等[5](1976)建立第一条微核的剂量效应曲线以来，国内外许多专家、学者建立了自己实验室的曲线。但是，由于各实验室所用辐射类型、剂量率、剂量范围，技术方法和微核判断标准不同，各自剂量效应曲线拟合的数学模式也不同，本实验结果表明，在小于6.0Gy的不同剂量范围内，微核率的剂量效应有曲线有所不同，但均具有良好的相关性。
许多环境、化学诱变剂可诱发微核，导致该方法的本底率较高，本实验的本底率为10‰，与有关报道相一致[1]。
, 百拇医药
一般认为，CB法可估算的剂量范围为0.25～5Gy，本实验结果表明，在0～6gy范围内，微核率呈现良好的剂量效应关系。这说明随着技术方法的不断改进，估算剂量的范围有扩大的可能，尤其是上限。
图3 0～6Gy微核率剂量效应曲线
参考文献
1 Heddle JA A rapid in vivo test Jor Chromosomal damage.Mutat Res.1973,18:187
2 白玉书，张秀霞，关树荣，60Coγ射线照射离体人血诱发的淋巴细胞微核率与剂量关系 遗传 1982 4(3)：7
3 杨家宽，程文英，丁志圣，等.整体照射与离体照射诱发狗外周血淋巴细胞微核率的比较.中华放射医学与防护杂志，1981，1(4)：25
, 百拇医药
4 Fenech M,Morley AA.Measurement of micronuelei in lymphocytes.Mutat Res,1985;1985 47:29
5 Countryman PL,Heddle JA.The Production of Micronuclei from chromosome aberrations in irradiated cultures of human lymphocytes.Mutat.Res;1976,41:321
6 白玉书，胞质分裂阻断微核法及其在辐射防护中应用的前景.放射医学与防护简报 1990，143：6
(收稿：1997-05-02 修回：1997-12-22), http://www.100md.com
单位：062552 河北任邱，华北石油管理局卫生防疫站
关键词：
中华放射医学与防护杂志980312.htm
Heddle 1973年首先推荐用微核法来衡量染色体的损伤[1]。之后，不少学者采用不同辐射类型对人或动物进行了研究，结果表明，在一定的剂量范围内，微核发生率与剂量间呈明确的剂量效应关系[2，3]。为了提高该方法的可靠性，1985年Fenech[4]提出了胞质阻断法观察双核淋巴细胞(M\-1细胞)，克服了以往采用的常规培养法[6]不能识别第一次有丝分裂的弊病，提高了该项指标的准确度。我们的研究目的是在本实验室条件下，利用胞质阻断法(CB法)建立0～6.0Gy范围内微核率的剂量效应曲线，以便一旦发生放射事故，尽快提供受照人员的生物剂量。
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1 材料和方法
1.1 血样和照射条件：血样取自3名健康男性成人，一年内无射线和化学毒物接触史。每例取静脉血20ml，肝素抗凝，混匀，分装10支灭菌玻璃试管内，密封。在37.0±0.5℃的恒温条件下，用60Coγ射线分别照射0，0.10，0.25，0.50，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0Gy，剂量率为0.377Gy/min。照后置37.0±0.5℃温箱内90分钟，然后培养，制片。60Co源和剂量由卫生部次级标准剂量学实验室提供。
1.2 培养、制片：从每个试管中吸取0.5ml血，分别注入装有4ml混合培养液(RPML1640液80%、小牛血清20%、青链霉素各100/ml，PHA适量)的培养瓶中，调pH至7.2～7.4，摇匀，置37.0±0.5℃恒温箱中培养，至40小时加松胞素-B(cyt\|B)，摇匀，继续培养至72小时收获。
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终止培养后，用吸管去除培养瓶中上清液，加入0.075mol/L KCl 4ml，用吸管吹匀，移入离心管中，立即加新配固定液(甲醇：冰乙酸=3∶1)4ml，吹匀，1000r/min离心10分钟，然后弃上清液。再重复固定一次，弃上清液，沉淀物滴片，用GIEMSA染色。
1.3 观察计数和统计分析方法
1.3.1 分析方法和记数细胞数：采用双育法阅片，只观察双核淋巴细胞。判断标准：微核必须与主核分开，两者重叠或相切时应清楚地看到各自的核膜，结构与主核相同，着色与主核一致或■浅，大小不能超过主核的1/3。结果用微核细胞率和微核率表示。
应分析计数细胞数的确定，主要根据微核细胞率符合二项式分布的原理，用二项式分布95%可信限公式：n=(1-p)×96.04/p(这时采用20%的允许误差)来计算应分析计数的细胞数。
1.3.2 给出的结果，根据WHO(1973)提供的下列四种模式进行曲线的拟合①Y=a+bP;②Y=a+cD\+2;③Y=kD\+n;④Y=a+bD+cD\+2(Y为微核率(‰)，D为剂量(Gy)，a为自发微核率，b、c为回归系数，k为常数，n为幂次)，用最小平方和法对所得数据进行曲线拟合和拟合度检验。
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2 结果
本试验共观察各剂量点双核CB细胞52 514个， 对微核细胞数和微核数进行了统计，结果见附表。
附表 各剂量点微核细胞率和微核率 剂 量(Gy)
观察细胞数
(个)
微核细胞率
(P±Sp‰)
微核率
(P±Sp‰)
0.00
14910
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8.5±0.75
10.0±0.81
0.10
11664
14.3±1.10
15.7±1.15
0.25
10064
23.6±1.50
25.2±1.56
0.50
4532
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38.8±2.87
41.0±2.95
1.00
4074
79.0±4.23
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2.00
2100
223.8±9.10
262.4±9.60
3.00
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396.7±10.68
524.8±10.89
4.00
1040
523.1±15.49
769.2±18.09
5.00
1040
710.5±18.06
1234.6±28.25
6.00
1000
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857.0±27.15
1577.0±35.14
对0—0.5Gy；0—5.0Gy；0—6.0Gy三个剂量范围内所得数据按WHO提供的四种数学模式用最小平方和法进行曲线拟合，对回归系数进行显著性检验，对方程拟合度进行相关指数检验。根据各方程式的回归系数显著性检验(P值)、拟合度(R\+2值)以及q值的差异等指标，选出了上述三个剂量范围内的最佳回归方程：
0—0.5Gy(微核率)；Y=9.7326+62.3172D;
0—5.0Gy(微核率)；Y=33.6905+48.1881D\+2;
0—6.0Gy(微核率)；Y=10.0+72.7436D+32.3761D\+2;
其相应的剂量效应曲线绘图如下：
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图1 0～5.0Gy微核率剂量效应曲线
图2 0～0.5Gy微核率剂量效应曲线
3 讨论
CB法细胞微核测定技术是一种较好估算生物剂量的方法。自从Countryman等[5](1976)建立第一条微核的剂量效应曲线以来，国内外许多专家、学者建立了自己实验室的曲线。但是，由于各实验室所用辐射类型、剂量率、剂量范围，技术方法和微核判断标准不同，各自剂量效应曲线拟合的数学模式也不同，本实验结果表明，在小于6.0Gy的不同剂量范围内，微核率的剂量效应有曲线有所不同，但均具有良好的相关性。
许多环境、化学诱变剂可诱发微核，导致该方法的本底率较高，本实验的本底率为10‰，与有关报道相一致[1]。
, 百拇医药
一般认为，CB法可估算的剂量范围为0.25～5Gy，本实验结果表明，在0～6gy范围内，微核率呈现良好的剂量效应关系。这说明随着技术方法的不断改进，估算剂量的范围有扩大的可能，尤其是上限。
图3 0～6Gy微核率剂量效应曲线
参考文献
1 Heddle JA A rapid in vivo test Jor Chromosomal damage.Mutat Res.1973,18:187
2 白玉书，张秀霞，关树荣，60Coγ射线照射离体人血诱发的淋巴细胞微核率与剂量关系 遗传 1982 4(3)：7
3 杨家宽，程文英，丁志圣，等.整体照射与离体照射诱发狗外周血淋巴细胞微核率的比较.中华放射医学与防护杂志，1981，1(4)：25
, 百拇医药
4 Fenech M,Morley AA.Measurement of micronuelei in lymphocytes.Mutat Res,1985;1985 47:29
5 Countryman PL,Heddle JA.The Production of Micronuclei from chromosome aberrations in irradiated cultures of human lymphocytes.Mutat.Res;1976,41:321
6 白玉书，胞质分裂阻断微核法及其在辐射防护中应用的前景.放射医学与防护简报 1990，143：6
(收稿：1997-05-02 修回：1997-12-22), http://www.100md.com