复方活血汤对放射性损伤小鼠造血细胞bcl-2、bax、bcl-xL基因表达的作用
作者：刘文励 孙汉英 周剑锋 肖侃艳 唐锦治
单位：430030 武汉，同济医科大学附属同济医院内科
关键词：放射损伤；造血细胞；bcl-2基因；bax基因；bcl-xL基因
中华放射医学与防护杂志980414 目的 探讨放射性损伤骨髓衰竭打败理及防护对策。方法 用Northern blot技术检测了60Coγ射线8.0Gy照射小鼠(对照组)及照射后立即复方活血汤治疗小鼠(中药组)的骨髓有核细胞bcl-2、bax、bcl-xL基因表达。结果 放射损伤后第3，7天，对照组骨髓有核细胞bcl-2/bax值减小、bcl-xL不表达。中药组与之相反，bcl-2/bax值明显增大、bcl-xL明显表达。受照后第7天两组脾脏单个核细胞bcl-2/bax值与骨髓有核细胞的表达一致。结论 复方活血汤对放射损伤骨髓造血细胞增殖周期调探基因bcl-2、bax、bcl-xL有一定调节作用，保护骨髓造血。
, http://www.100md.com
Effect of compound bolld-activation decoction on expression of bcl-2,bax and bcl-xL genes in bone marrow hematopoietic cells of radiation injured mice. Siu Wenli,Sun Hanying,Zhou Jianfeng,et al.Tongji Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430030,China.
Objective To explore the mechanism of and protective strategy againt bone marrow failure caused by radiation injury.Method Northern blot technique was used to detect the bcl-2,bax and bcl-xL gene expression in murine bone marrow nucleated cells (BMNC) both in Chinese drug-treated group, which was administered per os compound blood-activation decoction immediately after irradiation with 8.0 Gy60Coγ-rays,and control group.Results On the 3rd and 7th day arter irradiation,bcl-2/bax value of BMNC decreased obviously.No bcl-xL expression was observed in control group.In Chinese drug-treated group,the bcl-2/bax value increased remarkably,while bcl-xL expression occurred obviously.On the 7thday after irradiation,the bcl-2/bax value in splenic mononuclear cells was consitstent with that in BMNC in both Chinese drug-treated and control groups.Conclusion Compound blood-activation decoction could have a regulative effect on the expression of cell cycle egulation gene bcl-2,bax and bcl-xL in irradiated bone marrow hemato-poietic cells and protect the bone marrow hematopoiesis.
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Key words Radiation injury Hematopoietic cells bcl-2 gene bax bene bcl-xLgene
骨髓放射损伤的机理及防护研究有重要意义。我们在观察常用活血化瘀中药能促进急性放射损伤小鼠骨髓微血管恢复，增加骨髓微环境供氧，促进造血细胞增生[1]的同时，初步探讨了复方活血汤对受照小鼠骨髓有核细胞增殖周期调控基因bcl-2及其家族成员Bax、bcl-xL表达作用，报告如下。
1 材料和方法
1.1 复方活血汤注射液：由丹参、当归、川芎、赤芍按2∶2∶1∶1称重，水煎、醇沉、过滤，配制成100%药液(每ml含生药lg)，分装灭菌(由我所药理研究室提供)。
1.2 实验小鼠和分组：清洁级昆明小白鼠36只，雌性，同批鼠龄7～8周，体重18～22g,本校实验动物中心提供，随机分为3组。正常组：即未照射组。中药组：小鼠用60Coγ射线治疗机行全身照射，每只吸收剂量8.0Gy，吸收剂量率0.43Gy/min，照射后即给复方活血汤注射液腹腔内注射0.2ml/只，每天2次，连续6天。对照组：照射方法、剂量同上，照射后即给无菌生理盐水腹腔内注射0.2ml/只，每天2次，连续6天。
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1.3 骨髓有核细胞制备：分别于照射后第3，7天每组随机取6只小鼠，断颈处死，取股骨，冲出骨髓有核细胞，将每组6只小鼠的骨髓有核细胞混合，常规液氮冻存，供Northern blot分析。
1.4 脾脏单个核细胞(MNC)制备：分别取照射后第7天中药组和对照组各6只小鼠的新鲜脾脏，研碎，200目尼龙网过滤、离心，收集单个核细胞，常规液氮冻存，供Northern blot分析。
1.5 主要试剂：尼龙膜、Trizol总RNA提取试剂盒、缺口平移标记系统、Sephadex G-75购自Gibco公司，α-32P-dCTp购自北京亚辉公司。Bk-KS-A-bcl-2和7027cDNA-Bax质粒探针由Washington university Dr Korsemeyer惠赠，SFFV-neo-bcl-xL表达载体由university of Michigan Dr castle惠赠。
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1.6 Northern blot 按Chomczynski等报道的异硫氰酸胍-酚-氯仿一步抽提法提取各组细胞总RNA，20μg总RNA于1%甲醛变性胶电泳分离后，经快速倒转法将RNA转至尼龙膜。酶切BK-KS-A-bcl-2质粒为1.9kb cDNA探针，酶切7027cDNA-Bax、SFFV-neo-bcl-xL质粒分别为1kb、800bp的bax cDNA、bcl-xL cDNA探针，经电泳分离低熔点琼脂糖回收后，经缺口平移以α-32P-dCTp标记探针，并用SephadexG-75纯化。因bcl-2、Bax、bcl-xL mRNA长度分别为6.3，1.5～1.0，2.7kb，所以3种探针各0.5μg进入共同的杂交体系进行杂交。将尼龙膜在50%去离子甲酰胺/5×SSC/1%SDS/5% Denhart's/20%葡聚糖/100μg/ml SS DNA,置42℃恒温水浴摇床预杂交4小时后，将变性后的bcl-2、Bax、Bcl-xL探针各0.5μg加入杂交袋，杂交20小时，用2×SSC、0.5%SDS/1×SSC、0.5%SDS/1×SSC溶液依次洗膜，终洗膜条件为1×SSC/1%SDS,60℃洗15～20分钟，Monitor监测洗膜效应。略干后压片置带高效增感屏曝光盒放-70℃冰箱放射自显影1周后，将尼龙膜于1mmol/LTris*cl、1mmol/LEDTA(pH8.0)、0.1×Denhart's液中75℃保温2小时去探针，并与β-actin探针重新杂交，步骤同上。
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1.7 Northern blot结果分析：放射自显影图像经岛津CS-910(日本产)薄层扫描仪扫描分析mNA表达水平，进行相对定量(积分值)。
2 结果
2.1 骨髓有核细胞bcl-2,Bax、bcl-xL基因表达：如附图提示，放射损伤后第3，7天中药组骨髓有核细胞bcl-2基因表达明显高于对照组；Bax基因表达与之相反，中药组明显低于对照组。bcl-xL正常组和对照组未表达，中药组有一定的表达，各组表达水平见附表。
附表 复方活血汤对辐射损伤小鼠骨髓有核细胞
bcl-2、Bax、bcl-xL基因表达的作用(扫描积分值) 组别
, 百拇医药
照后第3天
照后第7天
bcl-2
bax
bcl-2/bax
bcl-xL
bcl-2
bax
bcl-2/bax
bcl-xL
正常组
186
, 百拇医药
175
1.06
0
186
175
1.06
0
中药组
187
122
1.53
65
175
, 百拇医药
108
1.62
58
对照组
161
185
0.87
0
138
216
0.64
0
2.2 脾脏MNC的bcl-2、Bax、bcl-xL基因表达放射损伤后第7天，对照组脾脏MNC bcl-2/bax值为0.74，而复方活血汤治疗组bcl-2/bax值为1.41。中药组和对照组bcl-xL均呈高表达。
, 百拇医药
3 讨论
有报道亚致隐约剂量60Coγ射线照射可引起骨髓有核细胞凋亡[2]，我们进一步观察了放射损伤时骨髓造血细胞增殖周期调控基因bcl-2及其家族成员Bax、bcl-xL的表达。bcl-2是最重要的抗凋亡基因之一，其高表达阻抑放射损伤诱导的细胞凋亡。Bax基因是bcl-2家族的一重要成员，与bcl-2有相反的生物效应[3]。在体内bcl-2、Bax蛋白可形成异质二聚体，两者剂量的比率决定细胞凋亡的敏感性，当bcl-2/bax增大则细胞存活，反之则易凋亡。本结果显示小鼠受叹收剂量8Gy、吸收剂量率0.43Gy/min放射损伤后1周内，骨髓有核细胞bcl-2/bax比值减小。因此，细胞易于凋亡。这与我们骨髓切片病理学所见一致[1]，即放射损伤后1周内骨髓造血细胞重度减少。但是若给予活血化瘀中药复方活血汤治疗，其骨髓有核细胞bcl-2/bax比值明显增大，这有助于防止骨髓造血细胞凋亡，促进骨髓造血恢复，这从受照后14天复方活血汤治疗组骨髓切片示造血细胞恢复正常得到证实[1]。
, 百拇医药
bcl-xL基因是bcl-2基因家族的新成员，是独立于bcl-2/bax细胞凋亡调节通路的[4]。bcl-xL通过转录剪切机制和转录水平变化调控细胞凋亡，其功能类似于bcl-2，故对照组骨髓有核细胞bcl-xL下降至未见表达。而复方活血汤组骨髓有核细胞bcl-xL有一定表达，有助于保护骨髓细胞不易凋亡。上述结果说明活血化瘀中药对放射损伤骨髓具有保护作用，不仅从促进其骨髓微血管恢复，增加骨髓微环境供氧，增强骨髓基质细胞粘附功能等方面促进造血细胞增生[5]，而且可能在分子生物学水平上通过影响细胞凋亡调控基因而保护骨髓造血细胞。
参考文献
1 刘文励，孙汉英，路武，等.活血化瘀中药对受照小鼠骨髓微环境及其供氧的作用.同济医科大学学报，1997，26：447.
, http://www.100md.com 2 潘景轩，朱振宇，李树浓，等.亚致死量60Coγ射线照射后小鼠骨髓造血细胞程度性死亡特性研究.实验血液学杂志，1996，4：195.
3 Oltval ZN,Milliman CL,Korsmeyer SL.Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog,bax,that accellerates programmedcell death.Cell,1993,74:609.
4 Boise LH,Gonzalez-Garcia M,Postema CE,et al.Bcl-x,a bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death.Cell,1993,74:597.
5 刘文励，黄伟，何美科，等.复方活血汤对辐射损伤小鼠骨髓基质细胞粘附功能的影响.中国中西医结合杂志，1997，17：354.
(收稿：1997-04-21 修回：1997-08-12), 百拇医药
单位：430030 武汉，同济医科大学附属同济医院内科
关键词：放射损伤；造血细胞；bcl-2基因；bax基因；bcl-xL基因
中华放射医学与防护杂志980414 目的 探讨放射性损伤骨髓衰竭打败理及防护对策。方法 用Northern blot技术检测了60Coγ射线8.0Gy照射小鼠(对照组)及照射后立即复方活血汤治疗小鼠(中药组)的骨髓有核细胞bcl-2、bax、bcl-xL基因表达。结果 放射损伤后第3，7天，对照组骨髓有核细胞bcl-2/bax值减小、bcl-xL不表达。中药组与之相反，bcl-2/bax值明显增大、bcl-xL明显表达。受照后第7天两组脾脏单个核细胞bcl-2/bax值与骨髓有核细胞的表达一致。结论 复方活血汤对放射损伤骨髓造血细胞增殖周期调探基因bcl-2、bax、bcl-xL有一定调节作用，保护骨髓造血。
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Effect of compound bolld-activation decoction on expression of bcl-2,bax and bcl-xL genes in bone marrow hematopoietic cells of radiation injured mice. Siu Wenli,Sun Hanying,Zhou Jianfeng,et al.Tongji Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430030,China.
Objective To explore the mechanism of and protective strategy againt bone marrow failure caused by radiation injury.Method Northern blot technique was used to detect the bcl-2,bax and bcl-xL gene expression in murine bone marrow nucleated cells (BMNC) both in Chinese drug-treated group, which was administered per os compound blood-activation decoction immediately after irradiation with 8.0 Gy60Coγ-rays,and control group.Results On the 3rd and 7th day arter irradiation,bcl-2/bax value of BMNC decreased obviously.No bcl-xL expression was observed in control group.In Chinese drug-treated group,the bcl-2/bax value increased remarkably,while bcl-xL expression occurred obviously.On the 7thday after irradiation,the bcl-2/bax value in splenic mononuclear cells was consitstent with that in BMNC in both Chinese drug-treated and control groups.Conclusion Compound blood-activation decoction could have a regulative effect on the expression of cell cycle egulation gene bcl-2,bax and bcl-xL in irradiated bone marrow hemato-poietic cells and protect the bone marrow hematopoiesis.
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Key words Radiation injury Hematopoietic cells bcl-2 gene bax bene bcl-xLgene
骨髓放射损伤的机理及防护研究有重要意义。我们在观察常用活血化瘀中药能促进急性放射损伤小鼠骨髓微血管恢复，增加骨髓微环境供氧，促进造血细胞增生[1]的同时，初步探讨了复方活血汤对受照小鼠骨髓有核细胞增殖周期调控基因bcl-2及其家族成员Bax、bcl-xL表达作用，报告如下。
1 材料和方法
1.1 复方活血汤注射液：由丹参、当归、川芎、赤芍按2∶2∶1∶1称重，水煎、醇沉、过滤，配制成100%药液(每ml含生药lg)，分装灭菌(由我所药理研究室提供)。
1.2 实验小鼠和分组：清洁级昆明小白鼠36只，雌性，同批鼠龄7～8周，体重18～22g,本校实验动物中心提供，随机分为3组。正常组：即未照射组。中药组：小鼠用60Coγ射线治疗机行全身照射，每只吸收剂量8.0Gy，吸收剂量率0.43Gy/min，照射后即给复方活血汤注射液腹腔内注射0.2ml/只，每天2次，连续6天。对照组：照射方法、剂量同上，照射后即给无菌生理盐水腹腔内注射0.2ml/只，每天2次，连续6天。
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1.3 骨髓有核细胞制备：分别于照射后第3，7天每组随机取6只小鼠，断颈处死，取股骨，冲出骨髓有核细胞，将每组6只小鼠的骨髓有核细胞混合，常规液氮冻存，供Northern blot分析。
1.4 脾脏单个核细胞(MNC)制备：分别取照射后第7天中药组和对照组各6只小鼠的新鲜脾脏，研碎，200目尼龙网过滤、离心，收集单个核细胞，常规液氮冻存，供Northern blot分析。
1.5 主要试剂：尼龙膜、Trizol总RNA提取试剂盒、缺口平移标记系统、Sephadex G-75购自Gibco公司，α-32P-dCTp购自北京亚辉公司。Bk-KS-A-bcl-2和7027cDNA-Bax质粒探针由Washington university Dr Korsemeyer惠赠，SFFV-neo-bcl-xL表达载体由university of Michigan Dr castle惠赠。
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1.6 Northern blot 按Chomczynski等报道的异硫氰酸胍-酚-氯仿一步抽提法提取各组细胞总RNA，20μg总RNA于1%甲醛变性胶电泳分离后，经快速倒转法将RNA转至尼龙膜。酶切BK-KS-A-bcl-2质粒为1.9kb cDNA探针，酶切7027cDNA-Bax、SFFV-neo-bcl-xL质粒分别为1kb、800bp的bax cDNA、bcl-xL cDNA探针，经电泳分离低熔点琼脂糖回收后，经缺口平移以α-32P-dCTp标记探针，并用SephadexG-75纯化。因bcl-2、Bax、bcl-xL mRNA长度分别为6.3，1.5～1.0，2.7kb，所以3种探针各0.5μg进入共同的杂交体系进行杂交。将尼龙膜在50%去离子甲酰胺/5×SSC/1%SDS/5% Denhart's/20%葡聚糖/100μg/ml SS DNA,置42℃恒温水浴摇床预杂交4小时后，将变性后的bcl-2、Bax、Bcl-xL探针各0.5μg加入杂交袋，杂交20小时，用2×SSC、0.5%SDS/1×SSC、0.5%SDS/1×SSC溶液依次洗膜，终洗膜条件为1×SSC/1%SDS,60℃洗15～20分钟，Monitor监测洗膜效应。略干后压片置带高效增感屏曝光盒放-70℃冰箱放射自显影1周后，将尼龙膜于1mmol/LTris*cl、1mmol/LEDTA(pH8.0)、0.1×Denhart's液中75℃保温2小时去探针，并与β-actin探针重新杂交，步骤同上。
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1.7 Northern blot结果分析：放射自显影图像经岛津CS-910(日本产)薄层扫描仪扫描分析mNA表达水平，进行相对定量(积分值)。
2 结果
2.1 骨髓有核细胞bcl-2,Bax、bcl-xL基因表达：如附图提示，放射损伤后第3，7天中药组骨髓有核细胞bcl-2基因表达明显高于对照组；Bax基因表达与之相反，中药组明显低于对照组。bcl-xL正常组和对照组未表达，中药组有一定的表达，各组表达水平见附表。
附表 复方活血汤对辐射损伤小鼠骨髓有核细胞
bcl-2、Bax、bcl-xL基因表达的作用(扫描积分值) 组别
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照后第3天
照后第7天
bcl-2
bax
bcl-2/bax
bcl-xL
bcl-2
bax
bcl-2/bax
bcl-xL
正常组
186
, 百拇医药
175
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中药组
187
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65
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1.62
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对照组
161
185
0.87
0
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0.64
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2.2 脾脏MNC的bcl-2、Bax、bcl-xL基因表达放射损伤后第7天，对照组脾脏MNC bcl-2/bax值为0.74，而复方活血汤治疗组bcl-2/bax值为1.41。中药组和对照组bcl-xL均呈高表达。
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3 讨论
有报道亚致隐约剂量60Coγ射线照射可引起骨髓有核细胞凋亡[2]，我们进一步观察了放射损伤时骨髓造血细胞增殖周期调控基因bcl-2及其家族成员Bax、bcl-xL的表达。bcl-2是最重要的抗凋亡基因之一，其高表达阻抑放射损伤诱导的细胞凋亡。Bax基因是bcl-2家族的一重要成员，与bcl-2有相反的生物效应[3]。在体内bcl-2、Bax蛋白可形成异质二聚体，两者剂量的比率决定细胞凋亡的敏感性，当bcl-2/bax增大则细胞存活，反之则易凋亡。本结果显示小鼠受叹收剂量8Gy、吸收剂量率0.43Gy/min放射损伤后1周内，骨髓有核细胞bcl-2/bax比值减小。因此，细胞易于凋亡。这与我们骨髓切片病理学所见一致[1]，即放射损伤后1周内骨髓造血细胞重度减少。但是若给予活血化瘀中药复方活血汤治疗，其骨髓有核细胞bcl-2/bax比值明显增大，这有助于防止骨髓造血细胞凋亡，促进骨髓造血恢复，这从受照后14天复方活血汤治疗组骨髓切片示造血细胞恢复正常得到证实[1]。
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bcl-xL基因是bcl-2基因家族的新成员，是独立于bcl-2/bax细胞凋亡调节通路的[4]。bcl-xL通过转录剪切机制和转录水平变化调控细胞凋亡，其功能类似于bcl-2，故对照组骨髓有核细胞bcl-xL下降至未见表达。而复方活血汤组骨髓有核细胞bcl-xL有一定表达，有助于保护骨髓细胞不易凋亡。上述结果说明活血化瘀中药对放射损伤骨髓具有保护作用，不仅从促进其骨髓微血管恢复，增加骨髓微环境供氧，增强骨髓基质细胞粘附功能等方面促进造血细胞增生[5]，而且可能在分子生物学水平上通过影响细胞凋亡调控基因而保护骨髓造血细胞。
参考文献
1 刘文励，孙汉英，路武，等.活血化瘀中药对受照小鼠骨髓微环境及其供氧的作用.同济医科大学学报，1997，26：447.
, http://www.100md.com 2 潘景轩，朱振宇，李树浓，等.亚致死量60Coγ射线照射后小鼠骨髓造血细胞程度性死亡特性研究.实验血液学杂志，1996，4：195.
3 Oltval ZN,Milliman CL,Korsmeyer SL.Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog,bax,that accellerates programmedcell death.Cell,1993,74:609.
4 Boise LH,Gonzalez-Garcia M,Postema CE,et al.Bcl-x,a bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death.Cell,1993,74:597.
5 刘文励，黄伟，何美科，等.复方活血汤对辐射损伤小鼠骨髓基质细胞粘附功能的影响.中国中西医结合杂志，1997，17：354.
(收稿：1997-04-21 修回：1997-08-12), 百拇医药