60Co照射诱导急性髓系白血病细胞bcl-2基因家族表达变化分析
作者：周剑锋 刘文励 李崇渔 邹萍 杨林花 乔振华 周木想 Findley HW 王辨明
单位：周剑峰 刘文励 (武汉，同济医科大学附属同济医院血液科 430030)；李崇渔 邹萍 王辨明 (同济医科大学附属协和医院血研所)；杨林花 乔振华 (山西医科大学附属二院血液科)；周木想 Findley HW (Emory University School of Medicine)
关键词：
中华放射医学与防护杂志980516 Bcl-2是最重要的抗凋亡基因之一，既往对bcl-2家族基因表达特点与肿瘤临床特征、疗效关系的认识，主要源于肿瘤细胞系，而以原代肿瘤细胞为研究对象，结合临床资料分析bcl-2基因家族在肿瘤形成、治疗反应性中的意义探讨少见。为此，我们用60Co照射处理原代急性髓系白血病细胞，观察了bcl-2基因家族功能状况对凋亡敏感性的影响。
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1 材料和方法
1.1 病例：8例不同预后AML为我院经细胞形态学，免疫学分型确诊病例。全部病例均于化疗前采集骨髓，分离AML细胞，并于3个疗程标准诱导方案化疗后进行疗效判定。采用1987年苏州“全国白血病化疗讨论会”疗效标准，将病例分为未缓解(NR，4例)，缓解(CR，4例)，急性早幼粒细胞白血病细胞系HL-60细胞系引自美国典型生物物种保藏中心(ATCC)。HL-60细胞系为p53基因缺失株。8例AML均为野生型p53(Wt-p53)表型。
1.2 主要试剂：尼龙膜，Trizol总RNA提取试剂盒，缺口平移探针标记盒，Sephadex G-75购自Gibco公司。α-32P-dCTP购自北京亚辉公司。SFFV.neo-bcl-XL质粒由Michigan大学Dr.Castle惠赠，BK-KSA-bcl-2,7027 cDNA-Bax质粒由Washington大学Dr.Korsemeyer惠赠。
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1.3 标本处理及检测
1.3.1 60Co细胞照射：新鲜分离细胞调浓度为1×106/ml，悬浮培养于10%FCS RPMI 1640液中，用60Co放疗机行照射。吸收剂量率0.68Gy/min,吸收剂量为7Gy，此剂量系参考Lowe等[5]所用剂量.为亚致死剂量，对骨髓细胞而言，属致损伤量，代表常规治疗剂量。照射后于37℃、饱和湿度5%CO2条件下孵育8小时，离心收集细胞，取1×106细胞行吖啶橙(Ao)染色，2×106细胞用70%乙醇固定后用于流式细胞术(FCM)分析凋亡率。照射前后细胞提取总RNA，用于Northern blot分析。
1.3.2 FCM：经预处理的AML细胞从-20℃取出，离心弃上清，加80μl柠檬酸液，室温30分钟后1000g离心5分钟，取上清于EP管。细胞沉淀用PBS重新洗3次，用RNA酶，PI染液等FCM常规预处理后上机测试，用Multicycle DNA分析软件分析DNA含量。凋亡细胞DNA含量低于G0/G1二倍体含量而出现G0/G1峰(AP)，即凋亡率。
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1.3.3 Ao染色：细胞受照后，离心涂片,干片后用甲醇固定5分钟，加1滴PBS润湿细胞，用Ao/PBS (1∶10000)染5分钟，PBS洗片，在荧光显微镜下观察拍照。
1.3.4 Northern blot:异硫氰酸胍一步法提取总RNA后，20μg总RNA 于1%甲醛变性胶电泳分离后，经快速倒转法将RNA转至尼龙膜。酶切回收bcl-2(1.9kb)、bax(1 kb)、bcl-XL(800 bp)探针，经缺口平移法标记α-32P-dCTP,Sephadex G-75纯化标记探针。因bcl-2、bcl-XL、bax mRNA长度分别为6.3，2.7，1.5～1.0kb,放3种探针各0.5μg进入同一杂交体系，进行杂交。将尼龙膜在50%去离子甲酰胺，5×SSC，1%SDS，5×Denhart's,20%葡聚糖，100μg/ml SSDNA在42℃恒温水浴摇床预杂交4 小时后，加入探针继续杂交20小时，用2×SSC，0.5% SDS/1×SSC溶液依次洗膜，终洗膜条件为1×SSC/1%SDS，60℃洗15～20分钟，Monitor监测洗膜效应。略干后压片，将带高效增感屏的曝光盒放-70℃冰箱曝光1周后冲片。将尼龙膜于1 mmol/L Tris.cl,1 mmol/L EDTA (pH8.0)，0.1×Denhard's液中75℃ 2小时去探针，与β-actin探针重新杂交步骤同上。
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1.3.5 Northern blot图像及数据处理：放射自显影图像经薄层层析扫描仪CS-910分析mRNA的表达丰度，bcl-2、bax mRNA的丰度用HL-60丰度的相对倍数表示，bcl-XL的丰度以1例AML bcl-XL丰度的相对倍数表示。所有数据均为t检验统计分析。
2 结果
2.1 HL-60细胞系有bcl-2 mRNA和低水平的bax mRNA表达。60Co照射后分别出现表达受抑和增强现象，bcl-XL mRNA表达缺失，与文献报告相符。CR和NR组在60Co照射前后的表达丰度见附表，照射前NR组bcl-2、bcl-XL表达高于CR组，bax表达无差异，照射后CR、NR两组均出现不同程度的bcl-2，bcl-XL表达受抑，bax表达增强现象。其中NR组的bcl-2、bcl-XL受抑后表达仍高于CR组。而NR组的bax增强后表达仍明显低于CR组。
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附表 60Co照射后bcl-2、bax、bcl-XL mRNA表达与凋亡率的关系 分组
bcl-2丰度
bax丰度
bcl-XL丰度
凋亡率
(%)
照前
照后
照前
照后
照前
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照后
NR
2.1±0.3
1.5±0.4
1.4±0.2
1.8±0.3
2.4±0.3
1.9±0.5
9.9±2.1
CR
0.8±0.27**
0.2±0.1**
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1.5±0.2
3.5±0.1**
1.3±0.4**
0.2±0.1**
18.2±3.5**
注：CR比NR组 * P<0.05；** P<0.01
2.2 60Co照射诱导的细胞凋亡敏感性分析：60Co照射后，AML细胞出现典型的凋亡形态，FCM分析显示，临床耐药的NR组的凋亡敏感性远低于CR组，bcl-2、bcl-XL mRNA的照前、照后表达丰度，bax mRNA的照后表达丰度与凋亡敏感性相关，高bcl-2、bcl-XL表达，低bax诱导表达水平的NR组对60Co照射诱导的凋亡耐受。FCM分析结果显示了NR，CR组凋亡敏感性的差异。
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3 讨论
放射线、化疗药物等均能通过DNA损伤的基因毒性(genotoxicity)致肿瘤细胞坏死及诱导细胞凋亡。细胞凋亡是机体在基因介导下主动清除损伤细胞的方式。现认为诱导细胞凋亡是放、化疗的关键疗效机制之一。因此理解DNA损伤诱导凋亡的基因径路的调控方式，对提高放化疗疗效具有指导意义。本研究用7 Gy亚致死剂量60Co照射原代AML细胞，观察到亚致死DNA损伤可抑制抗凋亡基因bcl-2、bcl-XL转录水平的表达，并增强凋亡基因bax的转录，通过改变细胞内凋亡抗凋亡基因产物的比率诱导细胞凋亡。高基础表达的bcl-2、bcl-XL细胞，经DNA损伤后，仍保留较高水平的转录水平，与bax转录诱导障碍协同，使之对凋亡的敏感性降低。从而成为临床放化疗疗效不佳的内在生物学基础。本组AML病例bcl-2基因家族的功能状况与临床化疗疗效密切相关，说明原代肿瘤细胞凋亡径路的异质性是影响疗效的重要因素，这对指导选择有效的治疗方案，设计整体的治疗策略甚为重要。
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近来研究肿瘤细胞系发现，细胞内Wt-p53蛋白可识别DNA损伤，通过转录后机制使Wt-p53蛋白在细胞内积聚，Wt-p53蛋白作为转录因子，激活bax转录表达，抑制bcl-2的转录，从而构成DNA损伤诱导凋亡的径路[3，4]。本实验在具有Wt-p53表型的原代AML细胞中观察到类似的调控模式，并发现DNA损害亦下调bcl-XL的表达，对既往的发现是一种重要补充。此外在缺失p53的HL-60细胞系中，同样出现bcl-2下调，bax上调的变化，说明存在Wt-p53外的DNA损伤凋亡诱导径路，这与Lowe[5]等的结论相符。
正常造血细胞仅微弱表达bcl-2、bcl-XL mRNA，而本组原代AML均存在bcl-2、bcl-XL的高表达。既往研究[1]证实初诊AML细胞的增殖活动低于正常骨髓细胞。这表明细胞凋亡的功能障碍，在AML恶性克隆的形成、扩展，进而形成病态造血的演变中，有不亚于细胞增殖失控的病理生理意义，深入研究其失衡的机制，对AML的防治十分重要。
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本课题受国家教委留学回国人员课题基金资助
参考文献
1 刘艳荣，陈珊珊，李鲲.用流式细胞仪测定成人白血病骨髓细胞原位DNA、RNA蛋白质量.中华血液学杂志，1991，12：128.
2 Fan S.El-Deiry WS.Bae I,et al.p53 gene mutations are associated with decreased sensitivity in human lymphoma cells to DNA damaging agents.Cancer Res,1994,54:5824.
3 Lee S,Elenbaas B,Levine A,et al.p53 and its 14KPa c-lermicnal domain recognized primary DNA damage in the form of insertion/deletion mismatches.Cell,1995,81:1013.
4 Miyashita T and Reed JC.Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene.Cell,1995,80:293.
5 Lowe SW,Ruley HE,Jacks T,et al.p53-dependent apoptosis modulated the cytotoxicity of anticancer agents.Cell,1993,74:957.
(收稿：1997-02-03 修回：1997-04-29), 百拇医药
单位：周剑峰 刘文励 (武汉，同济医科大学附属同济医院血液科 430030)；李崇渔 邹萍 王辨明 (同济医科大学附属协和医院血研所)；杨林花 乔振华 (山西医科大学附属二院血液科)；周木想 Findley HW (Emory University School of Medicine)
关键词：
中华放射医学与防护杂志980516 Bcl-2是最重要的抗凋亡基因之一，既往对bcl-2家族基因表达特点与肿瘤临床特征、疗效关系的认识，主要源于肿瘤细胞系，而以原代肿瘤细胞为研究对象，结合临床资料分析bcl-2基因家族在肿瘤形成、治疗反应性中的意义探讨少见。为此，我们用60Co照射处理原代急性髓系白血病细胞，观察了bcl-2基因家族功能状况对凋亡敏感性的影响。
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1 材料和方法
1.1 病例：8例不同预后AML为我院经细胞形态学，免疫学分型确诊病例。全部病例均于化疗前采集骨髓，分离AML细胞，并于3个疗程标准诱导方案化疗后进行疗效判定。采用1987年苏州“全国白血病化疗讨论会”疗效标准，将病例分为未缓解(NR，4例)，缓解(CR，4例)，急性早幼粒细胞白血病细胞系HL-60细胞系引自美国典型生物物种保藏中心(ATCC)。HL-60细胞系为p53基因缺失株。8例AML均为野生型p53(Wt-p53)表型。
1.2 主要试剂：尼龙膜，Trizol总RNA提取试剂盒，缺口平移探针标记盒，Sephadex G-75购自Gibco公司。α-32P-dCTP购自北京亚辉公司。SFFV.neo-bcl-XL质粒由Michigan大学Dr.Castle惠赠，BK-KSA-bcl-2,7027 cDNA-Bax质粒由Washington大学Dr.Korsemeyer惠赠。
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1.3 标本处理及检测
1.3.1 60Co细胞照射：新鲜分离细胞调浓度为1×106/ml，悬浮培养于10%FCS RPMI 1640液中，用60Co放疗机行照射。吸收剂量率0.68Gy/min,吸收剂量为7Gy，此剂量系参考Lowe等[5]所用剂量.为亚致死剂量，对骨髓细胞而言，属致损伤量，代表常规治疗剂量。照射后于37℃、饱和湿度5%CO2条件下孵育8小时，离心收集细胞，取1×106细胞行吖啶橙(Ao)染色，2×106细胞用70%乙醇固定后用于流式细胞术(FCM)分析凋亡率。照射前后细胞提取总RNA，用于Northern blot分析。
1.3.2 FCM：经预处理的AML细胞从-20℃取出，离心弃上清，加80μl柠檬酸液，室温30分钟后1000g离心5分钟，取上清于EP管。细胞沉淀用PBS重新洗3次，用RNA酶，PI染液等FCM常规预处理后上机测试，用Multicycle DNA分析软件分析DNA含量。凋亡细胞DNA含量低于G0/G1二倍体含量而出现G0/G1峰(AP)，即凋亡率。
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1.3.3 Ao染色：细胞受照后，离心涂片,干片后用甲醇固定5分钟，加1滴PBS润湿细胞，用Ao/PBS (1∶10000)染5分钟，PBS洗片，在荧光显微镜下观察拍照。
1.3.4 Northern blot:异硫氰酸胍一步法提取总RNA后，20μg总RNA 于1%甲醛变性胶电泳分离后，经快速倒转法将RNA转至尼龙膜。酶切回收bcl-2(1.9kb)、bax(1 kb)、bcl-XL(800 bp)探针，经缺口平移法标记α-32P-dCTP,Sephadex G-75纯化标记探针。因bcl-2、bcl-XL、bax mRNA长度分别为6.3，2.7，1.5～1.0kb,放3种探针各0.5μg进入同一杂交体系，进行杂交。将尼龙膜在50%去离子甲酰胺，5×SSC，1%SDS，5×Denhart's,20%葡聚糖，100μg/ml SSDNA在42℃恒温水浴摇床预杂交4 小时后，加入探针继续杂交20小时，用2×SSC，0.5% SDS/1×SSC溶液依次洗膜，终洗膜条件为1×SSC/1%SDS，60℃洗15～20分钟，Monitor监测洗膜效应。略干后压片，将带高效增感屏的曝光盒放-70℃冰箱曝光1周后冲片。将尼龙膜于1 mmol/L Tris.cl,1 mmol/L EDTA (pH8.0)，0.1×Denhard's液中75℃ 2小时去探针，与β-actin探针重新杂交步骤同上。
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1.3.5 Northern blot图像及数据处理：放射自显影图像经薄层层析扫描仪CS-910分析mRNA的表达丰度，bcl-2、bax mRNA的丰度用HL-60丰度的相对倍数表示，bcl-XL的丰度以1例AML bcl-XL丰度的相对倍数表示。所有数据均为t检验统计分析。
2 结果
2.1 HL-60细胞系有bcl-2 mRNA和低水平的bax mRNA表达。60Co照射后分别出现表达受抑和增强现象，bcl-XL mRNA表达缺失，与文献报告相符。CR和NR组在60Co照射前后的表达丰度见附表，照射前NR组bcl-2、bcl-XL表达高于CR组，bax表达无差异，照射后CR、NR两组均出现不同程度的bcl-2，bcl-XL表达受抑，bax表达增强现象。其中NR组的bcl-2、bcl-XL受抑后表达仍高于CR组。而NR组的bax增强后表达仍明显低于CR组。
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附表 60Co照射后bcl-2、bax、bcl-XL mRNA表达与凋亡率的关系 分组
bcl-2丰度
bax丰度
bcl-XL丰度
凋亡率
(%)
照前
照后
照前
照后
照前
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照后
NR
2.1±0.3
1.5±0.4
1.4±0.2
1.8±0.3
2.4±0.3
1.9±0.5
9.9±2.1
CR
0.8±0.27**
0.2±0.1**
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1.5±0.2
3.5±0.1**
1.3±0.4**
0.2±0.1**
18.2±3.5**
注：CR比NR组 * P<0.05；** P<0.01
2.2 60Co照射诱导的细胞凋亡敏感性分析：60Co照射后，AML细胞出现典型的凋亡形态，FCM分析显示，临床耐药的NR组的凋亡敏感性远低于CR组，bcl-2、bcl-XL mRNA的照前、照后表达丰度，bax mRNA的照后表达丰度与凋亡敏感性相关，高bcl-2、bcl-XL表达，低bax诱导表达水平的NR组对60Co照射诱导的凋亡耐受。FCM分析结果显示了NR，CR组凋亡敏感性的差异。
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3 讨论
放射线、化疗药物等均能通过DNA损伤的基因毒性(genotoxicity)致肿瘤细胞坏死及诱导细胞凋亡。细胞凋亡是机体在基因介导下主动清除损伤细胞的方式。现认为诱导细胞凋亡是放、化疗的关键疗效机制之一。因此理解DNA损伤诱导凋亡的基因径路的调控方式，对提高放化疗疗效具有指导意义。本研究用7 Gy亚致死剂量60Co照射原代AML细胞，观察到亚致死DNA损伤可抑制抗凋亡基因bcl-2、bcl-XL转录水平的表达，并增强凋亡基因bax的转录，通过改变细胞内凋亡抗凋亡基因产物的比率诱导细胞凋亡。高基础表达的bcl-2、bcl-XL细胞，经DNA损伤后，仍保留较高水平的转录水平，与bax转录诱导障碍协同，使之对凋亡的敏感性降低。从而成为临床放化疗疗效不佳的内在生物学基础。本组AML病例bcl-2基因家族的功能状况与临床化疗疗效密切相关，说明原代肿瘤细胞凋亡径路的异质性是影响疗效的重要因素，这对指导选择有效的治疗方案，设计整体的治疗策略甚为重要。
, http://www.100md.com
近来研究肿瘤细胞系发现，细胞内Wt-p53蛋白可识别DNA损伤，通过转录后机制使Wt-p53蛋白在细胞内积聚，Wt-p53蛋白作为转录因子，激活bax转录表达，抑制bcl-2的转录，从而构成DNA损伤诱导凋亡的径路[3，4]。本实验在具有Wt-p53表型的原代AML细胞中观察到类似的调控模式，并发现DNA损害亦下调bcl-XL的表达，对既往的发现是一种重要补充。此外在缺失p53的HL-60细胞系中，同样出现bcl-2下调，bax上调的变化，说明存在Wt-p53外的DNA损伤凋亡诱导径路，这与Lowe[5]等的结论相符。
正常造血细胞仅微弱表达bcl-2、bcl-XL mRNA，而本组原代AML均存在bcl-2、bcl-XL的高表达。既往研究[1]证实初诊AML细胞的增殖活动低于正常骨髓细胞。这表明细胞凋亡的功能障碍，在AML恶性克隆的形成、扩展，进而形成病态造血的演变中，有不亚于细胞增殖失控的病理生理意义，深入研究其失衡的机制，对AML的防治十分重要。
, http://www.100md.com
本课题受国家教委留学回国人员课题基金资助
参考文献
1 刘艳荣，陈珊珊，李鲲.用流式细胞仪测定成人白血病骨髓细胞原位DNA、RNA蛋白质量.中华血液学杂志，1991，12：128.
2 Fan S.El-Deiry WS.Bae I,et al.p53 gene mutations are associated with decreased sensitivity in human lymphoma cells to DNA damaging agents.Cancer Res,1994,54:5824.
3 Lee S,Elenbaas B,Levine A,et al.p53 and its 14KPa c-lermicnal domain recognized primary DNA damage in the form of insertion/deletion mismatches.Cell,1995,81:1013.
4 Miyashita T and Reed JC.Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene.Cell,1995,80:293.
5 Lowe SW,Ruley HE,Jacks T,et al.p53-dependent apoptosis modulated the cytotoxicity of anticancer agents.Cell,1993,74:957.
(收稿：1997-02-03 修回：1997-04-29), 百拇医药