原位杂交技术在辐射诱导骨髓细胞凋亡及修复时bcl-2基因表达检测中的应用
作者：熊呈琦 彭瑞云 高亚兵 李延平 杨红 王德文
单位：100850， 北京放射医学研究所
关键词：
中华放射医学与防护杂志990221 细胞凋亡是生物体增殖、分化和发育过程中的自然规律，是基因控制下的细胞自杀活动。近年来实验研究表明：在细胞凋亡过程中，有新的基因转录和蛋白质合成，是机体对外界刺激进行主动应答的过程[1]。本文作者对已有的原位杂交方法进行改进，并成功地应用到辐射诱导骨髓细胞凋亡时bcl-2 mRNA基因的表达检测中，收到良好的效果。
一、材料和方法
1.实验动物与分组
LACA小鼠213只，体重16～20 g，随机分为对照组(22只)和2.5 Gy(48只)，4.0 Gy(48只)，5.5 Gy(46只)及7.0 Gy(49只)照射组。
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2.照射条件与方法
采用60Co γ 射线全身一次照射，靶距为4.0米，吸收剂量分别为2.5、4.0、5.5及7.0 Gy，吸收剂量率为1.35×10-2 C*kg-1*min-1。
3.骨髓细胞悬液涂片制备
各组小鼠于照射后6小时，1、3、6、10、15、21及28天后断头活杀，将股骨分离，去净周围肌肉，将股骨骨髓用含抗凝剂(肝素20 U/ml)的2 ml生理盐水冲出，充分打散骨髓细胞，使之成2 ml细胞悬液，采用离心涂片机涂片，每个动物骨髓细胞悬液涂10张玻片，待干后经BFA液(每100 ml固定液含20 mg Na2HPO4，100 mg KH2PO4，45 ml丙酮，25 ml甲醛，30 ml蒸馏水)固定，4℃保存备用。
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4.骨髓细胞涂片原位杂交
(1)试剂：Bio-bc1-2 cRNA探针购自中山生物工程公司；AP-SA(碱性磷酸酶标记的抗生蛋白链菌素)为美国Zymed公司产品；坚固红及缓冲液购自本院生物制剂发展中心。
(2)染色步骤：参考苏慧慈[2]报道方法并进行改进。①杂交前预处理：BFA液固定的骨髓细胞涂片室温复温后，用PAP笔在细胞周围画圈，待干；入80%酒精5分钟，蒸馏水速洗后，DEPC水洗；用含0.1% DEPC的TBS洗2×3分钟；0.2 mol/L盐酸酸化10分钟，DEPC-TBS洗2×3分钟；5 μg/ml蛋白酶K37℃消化15分钟；0.2%甘氨酸(用DEPC-TBS配制)2分钟中止反应，DEPC-TBS洗2×3分钟；2×SSC-50%甲酰胺中52℃10分钟。②预杂交：向玻片圈内加预杂交液(50%甲酰胺，5×SSC，1×Denhardt's,10%硫酸葡聚糖，100 μg/ml剪断的鲑鱼精子DNA，250 μg/ml酵母tRNA。RNA杂交时，加RNasin 1U/μl)，42℃90分钟。③杂交：将Bio-bcl-2 cRNA探针按2.5 μg/ml稀释于上述预杂交液中，滴加样品上，50℃杂交过夜(约10～16小时)。④杂交后洗涤：2×SSC-50%甲酰胺洗涤，42℃2×15分钟；2×SSC洗涤2×15分钟；1×SSC洗涤2×5分钟；0.5×SSC洗涤2×5分钟；0.2×SSC洗涤2×5分钟；TBS洗涤2×5分钟。⑤杂交后检测：加AP-SA(1：1 000)37℃1小时；TBS洗涤3×5分钟；将硝基蓝四氮唑(NBT)改为坚固红显色：1 mg/ml坚固红(用坚固红缓冲液稀释)，镜下控制显色效果；自来水冲洗终止反应。⑥复染：苏木素复染核，甘油明胶封片。
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(3)对照实验：①探针对照：杂交液中不加探针，余同。②检测系统对照：用TBS代替AP-SA，余同。
二、结果
阴性对照实验结果为阴性。
正常小鼠骨髓仅少部分造血细胞膜及胞浆bc1-2 mRNA阳性呈玫瑰红色。
5.5 Gy照后6小时至3天，造血细胞膜及胞浆内bc1-2 mRNA进行性减少。照后3天，bc1-2 mRNA为阴性。照后10天，造血细胞处于恢复早期,bc1-2 mRNA明显增多，表现为其mRNA阳性的造血细胞明显增多，且阳性强度明显增强。照射15天后，bc1-2 mRNA阳性的造血细胞较正常亦明显增多，但较照后10天为少。
本实验阳性结果为玫瑰红色，胞核复染呈浅蓝色，反差明显，能够客观反映bc1-2 mRNA在辐射诱导的骨髓造血细胞凋亡及其后修复中的变化规律，结果可靠，且便于观察和照相。
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三、讨论
细胞凋亡(apoptosis)是细胞死亡的一种形式，是基因控制下的细胞自杀活动，可见于胚胎发育、正常组织代谢及某些病理情况，如物理、化学、生物等因素均可导致细胞凋亡发生[3]。早在1972年，Kerr等人首次命名了细胞“凋亡”的概念。但当时并未引起人们的重视，近20年，尤其是近5年来，对细胞凋亡出现新的研究热点，以期达到能诱导或控制细胞凋亡来使人们延年益寿或治疗疾病(如恶性肿瘤)的目的。已有学者报道，辐射可导致细胞凋亡，由于骨髓是辐射高度敏感的组织，对其造血细胞的研究亦有一些报道。至今，在国内外同类文献中，尚未见利用原位杂交技术研究bc1-2基因表达在辐射诱导骨髓细胞凋亡及修复中的变化规律，对其方法进行改进的文章更未见报道。
本文作者采用骨髓细胞涂片原位杂交技术，并将通常使用的原位杂交技术显色过程中的显色液(NBT)改为坚固红，阳性结果为玫瑰红色，位于细胞浆内或胞膜上，胞核复染呈浅蓝色，形成明显的色泽反差，得到明显的染色效果。bc1-2重要的功能是抑制细胞凋亡，使细胞寿命延长并进行增殖。对骨髓造血细胞，其功能与造血生长因子相似，可促进造血细胞的增殖。本实验结果证实观点：照射后6小时至6天，bc1-2表达减少，其抑制凋亡、促进增殖功能减弱，于是造血细胞则凋亡，数目减少；照射10天后，bc1-2表达增加，抑制骨髓细胞凋亡发生，并促进造血细胞增殖，其数目增加。因此，改进后的原位杂交技术是一种较好的实验技术方法。
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辐射所致的骨髓造血细胞凋亡及凋亡后的恢复是一系列癌基因、抑癌基因、生长因子及受体相互作用、相互影响、共同参与的结果，辐射可引起造血细胞一些基因mRNA转录及蛋白的合成，造血细胞主动死亡及死亡后自行修复[4]。其中原癌基因bc1-2可抑制骨髓造血细胞凋亡并促进造血细胞凋亡后的修复。已有文献报道原癌基因bc1-2定位于线粒体外膜、内质网膜及核外膜，编码相对分子质量为26×103的膜蛋白[5]。它能抑制多种类型的细胞凋亡，保护正常细胞和癌细胞免于各种诱导剂诱发的细胞凋亡，被认为是哺乳动物细胞死亡的解毒剂。它的相关基因有bax、bc1-X(bc1-XL,bc1-Xs两种形式)及mc1-1，其中bc1-Xs及bax可促进细胞凋亡，而bc1-XL和mcl-1则抑制之。
本实验为了探讨原癌基因bc1-2在辐射诱导的骨髓造血细胞凋亡及修复中的改变及作用，改进了已有的原位杂交技术并成功地应用到本项课题的研究，为bc1-2基因参与辐射诱导的骨髓造血细胞凋亡及修复研究提供了有力的技术保障，同时本方法也可为其他课题进行原位杂交技术操作提供较好的实验方法，值得病理同行推广应用。
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参考文献
1 Teodoczk-Injeyan JA,Sparkes BG,Falk RE,et al.IL-2 secretion and transmembrane signalling in burn patients.J Trauma,1988,28:152-158.
2 苏慧慈主编.原位杂交.北京：中国科学技术出版社，1994，59-84.
3 Majno G,Joris I.Apoptosis,oncosis and necrosis：an overview of cell death.Am J Pathol,1995,146:3-14.
4 彭瑞云，王德文.细胞程序性死亡研究进展.医药卫生科学技术进展，1997，4：151-155.
5 Monaghan P,Robertson D,Amos TA,et al.Ultrastructural localization of Bc1-2 protein.J Histochem Cytochem,1992,40:18-19.
(收稿：1998-09-09 修回:1998-11-14), http://www.100md.com
单位：100850， 北京放射医学研究所
关键词：
中华放射医学与防护杂志990221 细胞凋亡是生物体增殖、分化和发育过程中的自然规律，是基因控制下的细胞自杀活动。近年来实验研究表明：在细胞凋亡过程中，有新的基因转录和蛋白质合成，是机体对外界刺激进行主动应答的过程[1]。本文作者对已有的原位杂交方法进行改进，并成功地应用到辐射诱导骨髓细胞凋亡时bcl-2 mRNA基因的表达检测中，收到良好的效果。
一、材料和方法
1.实验动物与分组
LACA小鼠213只，体重16～20 g，随机分为对照组(22只)和2.5 Gy(48只)，4.0 Gy(48只)，5.5 Gy(46只)及7.0 Gy(49只)照射组。
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2.照射条件与方法
采用60Co γ 射线全身一次照射，靶距为4.0米，吸收剂量分别为2.5、4.0、5.5及7.0 Gy，吸收剂量率为1.35×10-2 C*kg-1*min-1。
3.骨髓细胞悬液涂片制备
各组小鼠于照射后6小时，1、3、6、10、15、21及28天后断头活杀，将股骨分离，去净周围肌肉，将股骨骨髓用含抗凝剂(肝素20 U/ml)的2 ml生理盐水冲出，充分打散骨髓细胞，使之成2 ml细胞悬液，采用离心涂片机涂片，每个动物骨髓细胞悬液涂10张玻片，待干后经BFA液(每100 ml固定液含20 mg Na2HPO4，100 mg KH2PO4，45 ml丙酮，25 ml甲醛，30 ml蒸馏水)固定，4℃保存备用。
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4.骨髓细胞涂片原位杂交
(1)试剂：Bio-bc1-2 cRNA探针购自中山生物工程公司；AP-SA(碱性磷酸酶标记的抗生蛋白链菌素)为美国Zymed公司产品；坚固红及缓冲液购自本院生物制剂发展中心。
(2)染色步骤：参考苏慧慈[2]报道方法并进行改进。①杂交前预处理：BFA液固定的骨髓细胞涂片室温复温后，用PAP笔在细胞周围画圈，待干；入80%酒精5分钟，蒸馏水速洗后，DEPC水洗；用含0.1% DEPC的TBS洗2×3分钟；0.2 mol/L盐酸酸化10分钟，DEPC-TBS洗2×3分钟；5 μg/ml蛋白酶K37℃消化15分钟；0.2%甘氨酸(用DEPC-TBS配制)2分钟中止反应，DEPC-TBS洗2×3分钟；2×SSC-50%甲酰胺中52℃10分钟。②预杂交：向玻片圈内加预杂交液(50%甲酰胺，5×SSC，1×Denhardt's,10%硫酸葡聚糖，100 μg/ml剪断的鲑鱼精子DNA，250 μg/ml酵母tRNA。RNA杂交时，加RNasin 1U/μl)，42℃90分钟。③杂交：将Bio-bcl-2 cRNA探针按2.5 μg/ml稀释于上述预杂交液中，滴加样品上，50℃杂交过夜(约10～16小时)。④杂交后洗涤：2×SSC-50%甲酰胺洗涤，42℃2×15分钟；2×SSC洗涤2×15分钟；1×SSC洗涤2×5分钟；0.5×SSC洗涤2×5分钟；0.2×SSC洗涤2×5分钟；TBS洗涤2×5分钟。⑤杂交后检测：加AP-SA(1：1 000)37℃1小时；TBS洗涤3×5分钟；将硝基蓝四氮唑(NBT)改为坚固红显色：1 mg/ml坚固红(用坚固红缓冲液稀释)，镜下控制显色效果；自来水冲洗终止反应。⑥复染：苏木素复染核，甘油明胶封片。
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(3)对照实验：①探针对照：杂交液中不加探针，余同。②检测系统对照：用TBS代替AP-SA，余同。
二、结果
阴性对照实验结果为阴性。
正常小鼠骨髓仅少部分造血细胞膜及胞浆bc1-2 mRNA阳性呈玫瑰红色。
5.5 Gy照后6小时至3天，造血细胞膜及胞浆内bc1-2 mRNA进行性减少。照后3天，bc1-2 mRNA为阴性。照后10天，造血细胞处于恢复早期,bc1-2 mRNA明显增多，表现为其mRNA阳性的造血细胞明显增多，且阳性强度明显增强。照射15天后，bc1-2 mRNA阳性的造血细胞较正常亦明显增多，但较照后10天为少。
本实验阳性结果为玫瑰红色，胞核复染呈浅蓝色，反差明显，能够客观反映bc1-2 mRNA在辐射诱导的骨髓造血细胞凋亡及其后修复中的变化规律，结果可靠，且便于观察和照相。
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三、讨论
细胞凋亡(apoptosis)是细胞死亡的一种形式，是基因控制下的细胞自杀活动，可见于胚胎发育、正常组织代谢及某些病理情况，如物理、化学、生物等因素均可导致细胞凋亡发生[3]。早在1972年，Kerr等人首次命名了细胞“凋亡”的概念。但当时并未引起人们的重视，近20年，尤其是近5年来，对细胞凋亡出现新的研究热点，以期达到能诱导或控制细胞凋亡来使人们延年益寿或治疗疾病(如恶性肿瘤)的目的。已有学者报道，辐射可导致细胞凋亡，由于骨髓是辐射高度敏感的组织，对其造血细胞的研究亦有一些报道。至今，在国内外同类文献中，尚未见利用原位杂交技术研究bc1-2基因表达在辐射诱导骨髓细胞凋亡及修复中的变化规律，对其方法进行改进的文章更未见报道。
本文作者采用骨髓细胞涂片原位杂交技术，并将通常使用的原位杂交技术显色过程中的显色液(NBT)改为坚固红，阳性结果为玫瑰红色，位于细胞浆内或胞膜上，胞核复染呈浅蓝色，形成明显的色泽反差，得到明显的染色效果。bc1-2重要的功能是抑制细胞凋亡，使细胞寿命延长并进行增殖。对骨髓造血细胞，其功能与造血生长因子相似，可促进造血细胞的增殖。本实验结果证实观点：照射后6小时至6天，bc1-2表达减少，其抑制凋亡、促进增殖功能减弱，于是造血细胞则凋亡，数目减少；照射10天后，bc1-2表达增加，抑制骨髓细胞凋亡发生，并促进造血细胞增殖，其数目增加。因此，改进后的原位杂交技术是一种较好的实验技术方法。
, 百拇医药
辐射所致的骨髓造血细胞凋亡及凋亡后的恢复是一系列癌基因、抑癌基因、生长因子及受体相互作用、相互影响、共同参与的结果，辐射可引起造血细胞一些基因mRNA转录及蛋白的合成，造血细胞主动死亡及死亡后自行修复[4]。其中原癌基因bc1-2可抑制骨髓造血细胞凋亡并促进造血细胞凋亡后的修复。已有文献报道原癌基因bc1-2定位于线粒体外膜、内质网膜及核外膜，编码相对分子质量为26×103的膜蛋白[5]。它能抑制多种类型的细胞凋亡，保护正常细胞和癌细胞免于各种诱导剂诱发的细胞凋亡，被认为是哺乳动物细胞死亡的解毒剂。它的相关基因有bax、bc1-X(bc1-XL,bc1-Xs两种形式)及mc1-1，其中bc1-Xs及bax可促进细胞凋亡，而bc1-XL和mcl-1则抑制之。
本实验为了探讨原癌基因bc1-2在辐射诱导的骨髓造血细胞凋亡及修复中的改变及作用，改进了已有的原位杂交技术并成功地应用到本项课题的研究，为bc1-2基因参与辐射诱导的骨髓造血细胞凋亡及修复研究提供了有力的技术保障，同时本方法也可为其他课题进行原位杂交技术操作提供较好的实验方法，值得病理同行推广应用。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Teodoczk-Injeyan JA,Sparkes BG,Falk RE,et al.IL-2 secretion and transmembrane signalling in burn patients.J Trauma,1988,28:152-158.
2 苏慧慈主编.原位杂交.北京：中国科学技术出版社，1994，59-84.
3 Majno G,Joris I.Apoptosis,oncosis and necrosis：an overview of cell death.Am J Pathol,1995,146:3-14.
4 彭瑞云，王德文.细胞程序性死亡研究进展.医药卫生科学技术进展，1997，4：151-155.
5 Monaghan P,Robertson D,Amos TA,et al.Ultrastructural localization of Bc1-2 protein.J Histochem Cytochem,1992,40:18-19.
(收稿：1998-09-09 修回:1998-11-14), http://www.100md.com