放射复合伤小鼠骨髓基质细胞周期及其DNA含量的变化
作者：陈幸华 罗成基 郭朝华 王苹 邓学才
单位：陈幸华：400037 重庆，第三军医大学附属新桥医院全军肿瘤中心；罗成基、郭朝华：复合伤研究所；王苹：附属新桥医院中西医结合科；邓学才：基础部中心实验室
关键词：
放射复合伤小鼠骨髓基质细胞周期及其 DNA含量的变化
骨髓基质细胞(Stromal Cell)是造血诱导微环境(Hematopoietic inductive microenvironment,HIE)的重要组成成分[1，2]。关于造血实质细胞赖以生存的造血微环境在放射复合伤造血功能障碍中的作用及其机理的研究很少。本文作者观察了放射复合伤小鼠骨髓基质细胞周期及其DNA含量的变化特点。
一、材料和方法
, http://www.100md.com
昆明种健康雄性小鼠共210只，体重20～30 g。实验分为4组：①单纯放射损伤组(简称单放组)：60只小鼠，用本室60Co γ射线源行一次性全身照射，距离1.5 m，总吸收剂量5.0 Gy，吸收剂量率0.4019～0.6646 Gy/min。②单纯烧伤组(简称单烧组)：45只小鼠，按本室常规方法，致成Ⅲ度烧伤，烧伤面积为15%(病理切片证实)。③放射损伤复合烧伤组(简称复合伤组)：60只小鼠，吸收剂量和烧伤面积的方法同上，照射后30分钟内实施烧伤。④正常对照组(简称正常组)：45只小鼠。每组实验重复3次，各组实际用于取材的动物不少于5只，各损伤组小鼠分别于伤后3、7、14天行颈椎脱臼活杀。取骨髓单个核细胞进行基质细胞体外培养14、21、28天。骨髓基质细胞培养、基质细胞周期及其DNA含量测定按文献[3]方法进行。实验数据的结果以
±s表示，t检验求出P值。
, 百拇医药
二、结果
1.骨髓基质细胞细胞周期的变化特点(见表1)。
表1 受照小鼠骨髓基质细胞的细胞周期的变化(
±s)
组别
动物数
(只)
伤后天数
细胞周期(%)
G0/G1
, http://www.100md.com
S
G2+M
正常
45
—
64.80±1.85
19.70±1.23
15.50±0.75
单烧
15
3
61.30±1.42c,f
, 百拇医药
11.90±1.76
26.80±1.72b,d,f
15
7
45.60±1.78b,d,f
33.70±1.25b,d
20.70±1.52b,d,f
15
14
65.60±1.54
23.10±1.42
, http://www.100md.com
11.30±0.85
单放
20
3
81.60±1.13b
15.90±0.86
2.50±0.41b
20
7
78.30±1.64a
17.50±1.39
4.20±1.27b
, http://www.100md.com
20
14
62.30±1.37
30.30±2.47a,d
7.40±0.73a
复合伤
20
3
78.70±2.68a
17.50±1.74
3.80±0.42b
, http://www.100md.com
20
7
73.50±1.35
19.30±1.17d
7.20±0.76a
20
14
68.80±1.27
22.10±1.28
9.10±1.15
注：与正常对照组比较(a)P<0.05,(b)P<0.01;与复合伤组比较(c)P<0.05,(d)P<0.01;单烧组与单放组比较(f)P<0.01
, http://www.100md.com
随伤后时间的延长，单放组和复合伤组G0/G1期细胞比例由高到低，S、G2+M细胞比例由低到高；单烧组除伤后第7天的G0/G1和S期细胞比例出现波动外，则呈现与单放组和复合伤组相反的变化趋势。
2.骨髓基质细胞DNA含量的变化(见表2)。
表2 受照小鼠骨髓基质细胞DNA含量百分比的变化(
±s)
组别
动物数
(只)
, 百拇医药
伤后天数
培养天数
14
21
28
正常
45
—
58.50±0.83
52.46±1.23
13.46±2.56
单烧
15
, http://www.100md.com
3
62.82±0.51d,f
59.58±0.48c,f
34.53±0.92b,d,e
15
7
66.10±0.38d,f
62.35±0.54a,d,f
49.93±0.85b,e
15
, 百拇医药
14
52.46±0.92f
35.99±1.53a
17.97±1.87d,f
单放
20
3
12.07±2.86b,d
17.22±1.85b,d
19.96±1.62d
, http://www.100md.com
20
7
19.50±2.35b,d
32.71±1.14b,c
41.28±1.08b
20
14
37.82±0.92b
42.21±0.85a
48.45±0.73b,d
, 百拇医药
复合伤
20
3
36.20±0.87b
42.58±0.63a
47.28±0.46b
20
7
41.79±1.15a
42.48±0.58a
32.16±1.16b
, 百拇医药
20
14
45.83±1.08a
38.56±1.21b
25.38±2.17b
注：与正常对照组比较(a)P<0.05,(b)P<0.01;与复合伤组比较(c)P<0.05,(d)P<0.01;单烧组与单放组比较(e)P<0.05,(f)P<0.01
单烧组骨髓基质细胞DNA含量以伤后第7天最高，与正常组比较，P<0.05～0.01；单放组和复合伤组骨髓基质细胞以伤后第3天体外培养14、21天时，其DNA含量最低，与正常组比较，P<0.05～0.01。随培养时间或/和伤后时间的延长，正常组和单烧组骨髓基质细胞DNA含量呈由高到低的变化；单放组则呈由低到高的变化；复合伤组骨髓基质细胞除伤后第7、14天于体外培养21和28天时，其DNA含量变化趋势同单烧组(高→低)外，与单放组的变化趋势相似。至伤后第14天于体外培养第28天，单烧组基质细胞DNA含量接近于正常组水平(P>0.05)；单放组和复合伤组骨髓基质细胞DNA含量仍高于正常组(P<0.05)；单放组高于复合伤组(P<0.01)。
, 百拇医药
三、讨论
细胞周期测定是分析细胞增殖动力学的一种快速和准确的方法。对于骨髓基质细胞的细胞周期分析的研究报道很少，而有关放射复合伤后骨髓基质细胞周期的研究更缺乏可比性的资料。在本实验条件下的结果表明，放射复合伤使骨髓基质细胞的周期比例发生了变化，主要表现为反映细胞增殖能力的G2+M期细胞比例方面。单烧组高于正常组和其余各损伤组，提示烧伤因素具有刺激基质细胞增殖的作用；单放组和复合伤组G2+M期细胞比例在观察期内仍未恢复达到正常组水平，提示：“G2期阻滞”可能是放射损伤和放射复合伤早期骨髓基质细胞发生分裂延迟的主要原因[4]。提示放射损伤和放射复合伤具有对造血微环境损伤持续作用较久和恢复缓慢的特点。对于放射复合伤组G2+M期细胞比例与单放组无显著性差异的问题，是否与放射损伤后未表现出明显的烧伤刺激作用有关，还有待于进一步探讨。
细胞内DNA含量变化是反映细胞动力学变化的直接依据。DNA合成和有丝分裂是细胞增殖的两个重要标志。在细胞周期中，从G1期到S期，G2期到M期这两个阶段正处于复杂活跃的分子变化时期，易受外界条件的影响。DNA是电离辐射作用的靶分子，G2期是辐射极敏感的阶段，细胞分裂所需特异性蛋白质和RNA合成障碍，因而细胞在G2期停留下来，称“G2期阻滞”(G2 block)。本实验结果提示：单放组和复合伤组骨髓基质细胞DNA含量恢复正常时间缓慢，至伤后第14天，仍均低于正常组。从不同培养时间各损伤组骨髓基质细胞DNA含量的动态变化结果来看，正常组呈由高到低的变化，提示正常骨髓基质细胞分化成熟速度快于各损伤组；单烧组骨髓基质细胞DNA含量随培养时间的延长仍处于较高水平，提示单烧组骨髓基质细胞具有较强的增殖能力；单放组和复合伤组骨髓基质细胞于伤后第14天经培养28天时，其DNA含量显著高于正常组，以修复损伤的基质细胞。
, http://www.100md.com
致谢：本课题得到程天民院士和粟永萍教授的指教，特此感谢
本课题受全军“八五”攻关基金资助
参考文献
1 Deryugina EI,Muller-Sieburg CE.Stromal cells in long-term cultures:keys to the elucidation of hematopoietic development?Crit Rev Immunol,1993,13:115-118.
2 Wilkins BS,Jones DB.Vascular networks within the stroma of human long term bone marrow cultures.J Pathol,1995,177:295-297.
3 陈幸华，罗成基，郭朝华，等.放射复合伤对小鼠骨髓基质细胞动力学及其粘附功能的影响.第三军医大学学报，1997，19：97-99.
4 陈幸华，罗成基，郭朝华，等. 5.0 Gy放射损伤对小鼠骨髓造血基质细胞细胞周期及其DNA含量的影响.第三军医大学学报，1996，18：209-212.
(收稿：1998-03-15 修回：1998-07-11), http://www.100md.com
单位：陈幸华：400037 重庆，第三军医大学附属新桥医院全军肿瘤中心；罗成基、郭朝华：复合伤研究所；王苹：附属新桥医院中西医结合科；邓学才：基础部中心实验室
关键词：
放射复合伤小鼠骨髓基质细胞周期及其 DNA含量的变化
骨髓基质细胞(Stromal Cell)是造血诱导微环境(Hematopoietic inductive microenvironment,HIE)的重要组成成分[1，2]。关于造血实质细胞赖以生存的造血微环境在放射复合伤造血功能障碍中的作用及其机理的研究很少。本文作者观察了放射复合伤小鼠骨髓基质细胞周期及其DNA含量的变化特点。
一、材料和方法
, http://www.100md.com
昆明种健康雄性小鼠共210只，体重20～30 g。实验分为4组：①单纯放射损伤组(简称单放组)：60只小鼠，用本室60Co γ射线源行一次性全身照射，距离1.5 m，总吸收剂量5.0 Gy，吸收剂量率0.4019～0.6646 Gy/min。②单纯烧伤组(简称单烧组)：45只小鼠，按本室常规方法，致成Ⅲ度烧伤，烧伤面积为15%(病理切片证实)。③放射损伤复合烧伤组(简称复合伤组)：60只小鼠，吸收剂量和烧伤面积的方法同上，照射后30分钟内实施烧伤。④正常对照组(简称正常组)：45只小鼠。每组实验重复3次，各组实际用于取材的动物不少于5只，各损伤组小鼠分别于伤后3、7、14天行颈椎脱臼活杀。取骨髓单个核细胞进行基质细胞体外培养14、21、28天。骨髓基质细胞培养、基质细胞周期及其DNA含量测定按文献[3]方法进行。实验数据的结果以
±s表示，t检验求出P值。, 百拇医药
二、结果
1.骨髓基质细胞细胞周期的变化特点(见表1)。
表1 受照小鼠骨髓基质细胞的细胞周期的变化(
±s)组别
动物数
(只)
伤后天数
细胞周期(%)
G0/G1
, http://www.100md.com
S
G2+M
正常
45
—
64.80±1.85
19.70±1.23
15.50±0.75
单烧
15
3
61.30±1.42c,f
, 百拇医药
11.90±1.76
26.80±1.72b,d,f
15
7
45.60±1.78b,d,f
33.70±1.25b,d
20.70±1.52b,d,f
15
14
65.60±1.54
23.10±1.42
, http://www.100md.com
11.30±0.85
单放
20
3
81.60±1.13b
15.90±0.86
2.50±0.41b
20
7
78.30±1.64a
17.50±1.39
4.20±1.27b
, http://www.100md.com
20
14
62.30±1.37
30.30±2.47a,d
7.40±0.73a
复合伤
20
3
78.70±2.68a
17.50±1.74
3.80±0.42b
, http://www.100md.com
20
7
73.50±1.35
19.30±1.17d
7.20±0.76a
20
14
68.80±1.27
22.10±1.28
9.10±1.15
注：与正常对照组比较(a)P<0.05,(b)P<0.01;与复合伤组比较(c)P<0.05,(d)P<0.01;单烧组与单放组比较(f)P<0.01
, http://www.100md.com
随伤后时间的延长，单放组和复合伤组G0/G1期细胞比例由高到低，S、G2+M细胞比例由低到高；单烧组除伤后第7天的G0/G1和S期细胞比例出现波动外，则呈现与单放组和复合伤组相反的变化趋势。
2.骨髓基质细胞DNA含量的变化(见表2)。
表2 受照小鼠骨髓基质细胞DNA含量百分比的变化(
±s)组别
动物数
(只)
, 百拇医药
伤后天数
培养天数
14
21
28
正常
45
—
58.50±0.83
52.46±1.23
13.46±2.56
单烧
15
, http://www.100md.com
3
62.82±0.51d,f
59.58±0.48c,f
34.53±0.92b,d,e
15
7
66.10±0.38d,f
62.35±0.54a,d,f
49.93±0.85b,e
15
, 百拇医药
14
52.46±0.92f
35.99±1.53a
17.97±1.87d,f
单放
20
3
12.07±2.86b,d
17.22±1.85b,d
19.96±1.62d
, http://www.100md.com
20
7
19.50±2.35b,d
32.71±1.14b,c
41.28±1.08b
20
14
37.82±0.92b
42.21±0.85a
48.45±0.73b,d
, 百拇医药
复合伤
20
3
36.20±0.87b
42.58±0.63a
47.28±0.46b
20
7
41.79±1.15a
42.48±0.58a
32.16±1.16b
, 百拇医药
20
14
45.83±1.08a
38.56±1.21b
25.38±2.17b
注：与正常对照组比较(a)P<0.05,(b)P<0.01;与复合伤组比较(c)P<0.05,(d)P<0.01;单烧组与单放组比较(e)P<0.05,(f)P<0.01
单烧组骨髓基质细胞DNA含量以伤后第7天最高，与正常组比较，P<0.05～0.01；单放组和复合伤组骨髓基质细胞以伤后第3天体外培养14、21天时，其DNA含量最低，与正常组比较，P<0.05～0.01。随培养时间或/和伤后时间的延长，正常组和单烧组骨髓基质细胞DNA含量呈由高到低的变化；单放组则呈由低到高的变化；复合伤组骨髓基质细胞除伤后第7、14天于体外培养21和28天时，其DNA含量变化趋势同单烧组(高→低)外，与单放组的变化趋势相似。至伤后第14天于体外培养第28天，单烧组基质细胞DNA含量接近于正常组水平(P>0.05)；单放组和复合伤组骨髓基质细胞DNA含量仍高于正常组(P<0.05)；单放组高于复合伤组(P<0.01)。
, 百拇医药
三、讨论
细胞周期测定是分析细胞增殖动力学的一种快速和准确的方法。对于骨髓基质细胞的细胞周期分析的研究报道很少，而有关放射复合伤后骨髓基质细胞周期的研究更缺乏可比性的资料。在本实验条件下的结果表明，放射复合伤使骨髓基质细胞的周期比例发生了变化，主要表现为反映细胞增殖能力的G2+M期细胞比例方面。单烧组高于正常组和其余各损伤组，提示烧伤因素具有刺激基质细胞增殖的作用；单放组和复合伤组G2+M期细胞比例在观察期内仍未恢复达到正常组水平，提示：“G2期阻滞”可能是放射损伤和放射复合伤早期骨髓基质细胞发生分裂延迟的主要原因[4]。提示放射损伤和放射复合伤具有对造血微环境损伤持续作用较久和恢复缓慢的特点。对于放射复合伤组G2+M期细胞比例与单放组无显著性差异的问题，是否与放射损伤后未表现出明显的烧伤刺激作用有关，还有待于进一步探讨。
细胞内DNA含量变化是反映细胞动力学变化的直接依据。DNA合成和有丝分裂是细胞增殖的两个重要标志。在细胞周期中，从G1期到S期，G2期到M期这两个阶段正处于复杂活跃的分子变化时期，易受外界条件的影响。DNA是电离辐射作用的靶分子，G2期是辐射极敏感的阶段，细胞分裂所需特异性蛋白质和RNA合成障碍，因而细胞在G2期停留下来，称“G2期阻滞”(G2 block)。本实验结果提示：单放组和复合伤组骨髓基质细胞DNA含量恢复正常时间缓慢，至伤后第14天，仍均低于正常组。从不同培养时间各损伤组骨髓基质细胞DNA含量的动态变化结果来看，正常组呈由高到低的变化，提示正常骨髓基质细胞分化成熟速度快于各损伤组；单烧组骨髓基质细胞DNA含量随培养时间的延长仍处于较高水平，提示单烧组骨髓基质细胞具有较强的增殖能力；单放组和复合伤组骨髓基质细胞于伤后第14天经培养28天时，其DNA含量显著高于正常组，以修复损伤的基质细胞。
, http://www.100md.com
致谢：本课题得到程天民院士和粟永萍教授的指教，特此感谢
本课题受全军“八五”攻关基金资助
参考文献
1 Deryugina EI,Muller-Sieburg CE.Stromal cells in long-term cultures:keys to the elucidation of hematopoietic development?Crit Rev Immunol,1993,13:115-118.
2 Wilkins BS,Jones DB.Vascular networks within the stroma of human long term bone marrow cultures.J Pathol,1995,177:295-297.
3 陈幸华，罗成基，郭朝华，等.放射复合伤对小鼠骨髓基质细胞动力学及其粘附功能的影响.第三军医大学学报，1997，19：97-99.
4 陈幸华，罗成基，郭朝华，等. 5.0 Gy放射损伤对小鼠骨髓造血基质细胞细胞周期及其DNA含量的影响.第三军医大学学报，1996，18：209-212.
(收稿：1998-03-15 修回：1998-07-11), http://www.100md.com