辐射诱发人淋巴细胞hprt基因突变——多核细胞法的方法学探讨与量效关系研究
作者：邬洪梁 朱巍 高锦声 郑斯英
单位：邬洪梁:414000 湖南，岳阳市一人民医院中心实验室；朱巍、高锦声、郑斯英：苏州医学院放射医学系
关键词：
中华放射医学与防护杂志990219 人体细胞hprt基因对电离辐射和化学诱变剂非常敏感，研究表明该基因突变分析可用于急性照射和慢性小剂量照射的剂量评估[1]。多核细胞法是Norman等人1988年提出的研究hprt基因突变的一种简单的方法[2]。该法具有操作简单，结果易于分析等优点，但对该方法实验影响因素的研究不多，为使该法更加完善，更趋标准化，作者应用正交试验[3]对3个主要影响因素进行探讨，同时应用该实验方案研究60Co γ射线诱导人淋巴细胞hprt基因突变的剂量效应关系，并与染色体畸变(CA)，胞浆分裂阻滞法微核(CBMN)进行相关性分析，以期确立作为辐射生物剂量计的应用潜力。
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一、材料和方法
1.试剂：6-TG、CytB、RPMI 1640培养基、PHA、小牛血清购自上海科达公司。
2.照射方法：采用60Co γ射线照射，吸收剂量率120.4c Gy/min，照射距离70 cm，温度(37±0.5)℃。
3.标本采集与培养：①2例健康献血员各采血20 ml，分装2瓶，各接受0、1.0 Gy γ射线照射，2小时后接种。每份血按加与不加6-TG培养各接种9瓶。每瓶作编号，37℃恒温培养。在培养0时加入6-TG(终浓度分别为2×10-4,2×10-5，2×10-6 mol/L),培养30小时加入CytB(终浓度分别为3、6、9 mg/L)，分别在50、56、72小时收获细胞。正交试验方法参见文献[3]。②3例健康献血员各采血20 ml，分装于7瓶，分别接受0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 Gy γ射线照射，2小时后接种。每个剂量点各接种3瓶：第1、2瓶按前法的最佳实验方案操作；第3瓶按常规染色体制备方法操作。按本室常规方法收获细胞，制片，染色，盲法阅片。
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4.计数标准与统计分析：①双(多)核细胞的判别标准及Vf的计算方法、微核的判断标准与计算方法、染色体畸变分析及计算方法参见相关文献[2，4，5]；②根据方差分析来判别各因素的作用大小，并找出各因素不同水平间的最佳实验方案；③参照WHO(1973)推荐的4种模式[5]，应用Excel统计程序，分别对Vf、CAf、MNf配合量效关系，选择最佳回归方程；并用CAf和MNf对Vf进行相关性分析。
二、结果
1.多核细胞法的方法学研究
在2×10-5mol/L的6-TG实验组中，Vf(×10-4，下同)平均增加3.43，明显大于其他两组(1.53、1.29，P<0.01)；72小时收获的Vf平均增加2.77，也大于其他两组(1.72、1.75，P<0.05)；而在6 mg/L的CytB实验组中，其Vf平均增加2.47与其他两组相差不大(1.71、2.07，P>0.05)。另外，各实验组辐射诱发的Vf较自发Vf明显增加(P<0.01)，表明辐射可诱导hprt基因突变。
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方差分析表明6-TG终浓度和收获时间是影响多核细胞法的主要因素(P<0.01)。根据辐射诱发的Vf越高越好，自发Vf越低越好，即两者的差值越大越好的原则，找出三者间的最佳实验方案：6-TG终浓度为2×10-5mol/L，CytB终浓度为6 mg/L，72小时收获细胞。
2.60Co γ射线诱导人淋巴细胞hprt基因突变的量效关系
表1为各剂量点上hprt Vf(×10-3)、CAf、MNf，可以看出三者都随照射剂量的增加而增加。对三者分别配合量效关系，发现它们的最优关系均为直线平方模式，其中hprt Vf的b值最大(0.1675)，b/c比值也最大(5.045)。hprt Vf(×10-3)：Y=0.7202+0.1675D+0.0332D2,R2=0.9624; CAf:Y=0.0004+0.1059D+0.0444D2,R2=0.9245;MNf:Y=0.0105+0.0592D+0.029D2,R2=0.8978.分别用CAf\,MNf与Vf进行相关性分析，结果Vf随CAf及MNf增加而增加，表明hprt基因突变与CA与CBMN之间具有显著相关，这一结果证实了Hakoda等[6]的研究。CAf与hprt Vf:Vf=0.7345+1.0143CAf,r=0.9682,P<0.01;MNf与hprt Vf:Vf=0.7488+1.6842MNf,r=0.9479,P<0.01。
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表1 60Co γ射线诱导人淋巴细胞hprt基因突变、CA、CBMN的量效关系 剂量
(Gy)
hprt Vf
(×10-3)
CAf
(%)
MNf
(%)
0
0.7242±0.0067
0.003±0.006
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0.011±0.015
0.5
0.8188±0.0103
0.060±0.015
0.032±0.011
1.0
0.9067±0.0079
0.155±0.013
0.099±0.018
1.5
1.0409±0.0108
0.263±0.021
, 百拇医药
0.148±0.022
2.0
1.1857±0.0240
0.372±0.019
0.264±0.019
3.0
1.5376±0.0168
0.735±0.024
0. 459±0.022
4.0
1.9095±0.0273
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0.698±0.024
三、讨论
在电离辐射和化学诱变剂的作用下，hprt基因易发生突变，这些突变的细胞能在含6-TG的培养基中存活，并生存增殖，而正常细胞却因6-TG的毒性作用而死亡，因此通过检测分裂细胞的数目即可确定hprt基因突变频率[1]。目前检测人淋巴细胞hprt基因突变的方法较多，多核细胞法是Norman等1988年提出的一种简便方法[2]。但是尚未有对该法的方法学进行研究的报道。 研究认为存活淋巴细胞数量与6-TG浓度密切相关[1]。根据文献报道[7]，本实验选择了2×10-4、2×10-5、2×10-6mol/L 3种6-TG浓度。在辐射后的培养中，2×10-5mol/L 的培养与未辐射者相比差异具有显著性(P<0.01)，而其他两种浓度的Vf则与未辐射者差异无显著性(P>0.05)，说明2×10-5mol/L的6-TG终浓度是最佳条件。
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多核细胞法是CB微核法的发展[2,4]，因此影响CB微核法的因素必然对该法产生一定的影响。王知权等[8]认为，CytB终浓度和收获时间是主要影响因素。实验表明72小时培养的Vf比50、56小时培养者显著增加，证实了培养时间增加可使生长缓慢的变异体细胞增殖转化[2]。蒋本荣等[9]认为加入6 mg/L与9 mg/L的CytB对双核细胞的比例影响不大。我们的研究表明，在加入一定量的6-TG后，3种终浓度的CytB对Vf的变化关系不大。因此，在培养同时加终浓度为2×10-5mol/L的6-TG，培养30小时加终浓度为6 mg/L的CytB，72小时收获细胞，既可以获得高比例的多(双)核细胞，又可以提高方法的灵敏度，使结果更趋准确。
应用上述最佳实验方案，研究了60Co γ 射线诱导人淋巴细胞hprt基因突变的剂量效应关系。结果表明，随着照射剂量的增加，Vf也相应增加，两者呈明显的依赖关系，拟合的最佳量效关系符合线性平方模式，其b值、b/c比值均比CAf、MNf大，小剂量的射线照射即可诱导Vf的显著增加，说明它对电离辐射的灵敏度要高于CA、CBMN。由于它可以长期存在于体内，是真正的突变[10]，并且它与CA、CBMN有显著相关性，因此人淋巴细胞hprt基因突变分析可作为一种辐射生物剂量计，在辐射剂量估算中发挥作用。
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参考文献
1 Cole J, Spoeak T.Somatic mutant frequency, mutation rates and mutational spectra in the human population in vivo. Mutat Res, 1994, 303:31-104.
2 Norman A, Mitchell JC, Iwamoto KS.A sensitive assay for 6-thioguanine-resistant lymphocytes. Mutat Res, 1988, 208:17-19.
3 周怀梧主编.医药应用概率统计.上海：百家出版社，1989.242.
4 Fenech M.The cytokinesis-block micronucleus technique:a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations. Mutat Res, 1993, 285:35-44.
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5 刘树铮主编.医学放射生物学.北京：原子能出版社，1986. 219-240.
6 Hakoda M, Akiyama M, Kyoizumi S, et al. Measurement of in vivo HGPRT-deficient mutant cell frequency using a modified method for cloning human peripheral blood T-lymphocytes. Mutat Res, 1988, 197:161-169.
7 Davies MJ, Lovell DP, Anderson D. Thioguanine-resistant mutant frequency in T-lymphocytes from a healthy human population. Mutat Res, 1992, 265:165-171.
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8 王知权，葛志勇，王继先，等.辐射诱导人淋巴细胞微核率的研究-方法学及剂量效应关系.中国辐射卫生，1994,3:65-69.
9 蒋本荣，张忠银.人淋巴细胞胞浆分裂阻滞微核法的探讨.军事医学科学院院刊，1990，14：132-136.
10 Muir P,Osborne Y,Morley AA, et al. Karyotypic abnormality of the X chromosome is rare in mutant HPRT- lymphocyte clones. Mutat Res, 1988, 197:157-160.
(收稿：1998-05-11 修回:1998-11-11), http://www.100md.com
单位：邬洪梁:414000 湖南，岳阳市一人民医院中心实验室；朱巍、高锦声、郑斯英：苏州医学院放射医学系
关键词：
中华放射医学与防护杂志990219 人体细胞hprt基因对电离辐射和化学诱变剂非常敏感，研究表明该基因突变分析可用于急性照射和慢性小剂量照射的剂量评估[1]。多核细胞法是Norman等人1988年提出的研究hprt基因突变的一种简单的方法[2]。该法具有操作简单，结果易于分析等优点，但对该方法实验影响因素的研究不多，为使该法更加完善，更趋标准化，作者应用正交试验[3]对3个主要影响因素进行探讨，同时应用该实验方案研究60Co γ射线诱导人淋巴细胞hprt基因突变的剂量效应关系，并与染色体畸变(CA)，胞浆分裂阻滞法微核(CBMN)进行相关性分析，以期确立作为辐射生物剂量计的应用潜力。
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一、材料和方法
1.试剂：6-TG、CytB、RPMI 1640培养基、PHA、小牛血清购自上海科达公司。
2.照射方法：采用60Co γ射线照射，吸收剂量率120.4c Gy/min，照射距离70 cm，温度(37±0.5)℃。
3.标本采集与培养：①2例健康献血员各采血20 ml，分装2瓶，各接受0、1.0 Gy γ射线照射，2小时后接种。每份血按加与不加6-TG培养各接种9瓶。每瓶作编号，37℃恒温培养。在培养0时加入6-TG(终浓度分别为2×10-4,2×10-5，2×10-6 mol/L),培养30小时加入CytB(终浓度分别为3、6、9 mg/L)，分别在50、56、72小时收获细胞。正交试验方法参见文献[3]。②3例健康献血员各采血20 ml，分装于7瓶，分别接受0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 Gy γ射线照射，2小时后接种。每个剂量点各接种3瓶：第1、2瓶按前法的最佳实验方案操作；第3瓶按常规染色体制备方法操作。按本室常规方法收获细胞，制片，染色，盲法阅片。
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4.计数标准与统计分析：①双(多)核细胞的判别标准及Vf的计算方法、微核的判断标准与计算方法、染色体畸变分析及计算方法参见相关文献[2，4，5]；②根据方差分析来判别各因素的作用大小，并找出各因素不同水平间的最佳实验方案；③参照WHO(1973)推荐的4种模式[5]，应用Excel统计程序，分别对Vf、CAf、MNf配合量效关系，选择最佳回归方程；并用CAf和MNf对Vf进行相关性分析。
二、结果
1.多核细胞法的方法学研究
在2×10-5mol/L的6-TG实验组中，Vf(×10-4，下同)平均增加3.43，明显大于其他两组(1.53、1.29，P<0.01)；72小时收获的Vf平均增加2.77，也大于其他两组(1.72、1.75，P<0.05)；而在6 mg/L的CytB实验组中，其Vf平均增加2.47与其他两组相差不大(1.71、2.07，P>0.05)。另外，各实验组辐射诱发的Vf较自发Vf明显增加(P<0.01)，表明辐射可诱导hprt基因突变。
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方差分析表明6-TG终浓度和收获时间是影响多核细胞法的主要因素(P<0.01)。根据辐射诱发的Vf越高越好，自发Vf越低越好，即两者的差值越大越好的原则，找出三者间的最佳实验方案：6-TG终浓度为2×10-5mol/L，CytB终浓度为6 mg/L，72小时收获细胞。
2.60Co γ射线诱导人淋巴细胞hprt基因突变的量效关系
表1为各剂量点上hprt Vf(×10-3)、CAf、MNf，可以看出三者都随照射剂量的增加而增加。对三者分别配合量效关系，发现它们的最优关系均为直线平方模式，其中hprt Vf的b值最大(0.1675)，b/c比值也最大(5.045)。hprt Vf(×10-3)：Y=0.7202+0.1675D+0.0332D2,R2=0.9624; CAf:Y=0.0004+0.1059D+0.0444D2,R2=0.9245;MNf:Y=0.0105+0.0592D+0.029D2,R2=0.8978.分别用CAf\,MNf与Vf进行相关性分析，结果Vf随CAf及MNf增加而增加，表明hprt基因突变与CA与CBMN之间具有显著相关，这一结果证实了Hakoda等[6]的研究。CAf与hprt Vf:Vf=0.7345+1.0143CAf,r=0.9682,P<0.01;MNf与hprt Vf:Vf=0.7488+1.6842MNf,r=0.9479,P<0.01。
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表1 60Co γ射线诱导人淋巴细胞hprt基因突变、CA、CBMN的量效关系 剂量
(Gy)
hprt Vf
(×10-3)
CAf
(%)
MNf
(%)
0
0.7242±0.0067
0.003±0.006
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0.011±0.015
0.5
0.8188±0.0103
0.060±0.015
0.032±0.011
1.0
0.9067±0.0079
0.155±0.013
0.099±0.018
1.5
1.0409±0.0108
0.263±0.021
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0.148±0.022
2.0
1.1857±0.0240
0.372±0.019
0.264±0.019
3.0
1.5376±0.0168
0.735±0.024
0. 459±0.022
4.0
1.9095±0.0273
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0.698±0.024
三、讨论
在电离辐射和化学诱变剂的作用下，hprt基因易发生突变，这些突变的细胞能在含6-TG的培养基中存活，并生存增殖，而正常细胞却因6-TG的毒性作用而死亡，因此通过检测分裂细胞的数目即可确定hprt基因突变频率[1]。目前检测人淋巴细胞hprt基因突变的方法较多，多核细胞法是Norman等1988年提出的一种简便方法[2]。但是尚未有对该法的方法学进行研究的报道。 研究认为存活淋巴细胞数量与6-TG浓度密切相关[1]。根据文献报道[7]，本实验选择了2×10-4、2×10-5、2×10-6mol/L 3种6-TG浓度。在辐射后的培养中，2×10-5mol/L 的培养与未辐射者相比差异具有显著性(P<0.01)，而其他两种浓度的Vf则与未辐射者差异无显著性(P>0.05)，说明2×10-5mol/L的6-TG终浓度是最佳条件。
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多核细胞法是CB微核法的发展[2,4]，因此影响CB微核法的因素必然对该法产生一定的影响。王知权等[8]认为，CytB终浓度和收获时间是主要影响因素。实验表明72小时培养的Vf比50、56小时培养者显著增加，证实了培养时间增加可使生长缓慢的变异体细胞增殖转化[2]。蒋本荣等[9]认为加入6 mg/L与9 mg/L的CytB对双核细胞的比例影响不大。我们的研究表明，在加入一定量的6-TG后，3种终浓度的CytB对Vf的变化关系不大。因此，在培养同时加终浓度为2×10-5mol/L的6-TG，培养30小时加终浓度为6 mg/L的CytB，72小时收获细胞，既可以获得高比例的多(双)核细胞，又可以提高方法的灵敏度，使结果更趋准确。
应用上述最佳实验方案，研究了60Co γ 射线诱导人淋巴细胞hprt基因突变的剂量效应关系。结果表明，随着照射剂量的增加，Vf也相应增加，两者呈明显的依赖关系，拟合的最佳量效关系符合线性平方模式，其b值、b/c比值均比CAf、MNf大，小剂量的射线照射即可诱导Vf的显著增加，说明它对电离辐射的灵敏度要高于CA、CBMN。由于它可以长期存在于体内，是真正的突变[10]，并且它与CA、CBMN有显著相关性，因此人淋巴细胞hprt基因突变分析可作为一种辐射生物剂量计，在辐射剂量估算中发挥作用。
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1 Cole J, Spoeak T.Somatic mutant frequency, mutation rates and mutational spectra in the human population in vivo. Mutat Res, 1994, 303:31-104.
2 Norman A, Mitchell JC, Iwamoto KS.A sensitive assay for 6-thioguanine-resistant lymphocytes. Mutat Res, 1988, 208:17-19.
3 周怀梧主编.医药应用概率统计.上海：百家出版社，1989.242.
4 Fenech M.The cytokinesis-block micronucleus technique:a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations. Mutat Res, 1993, 285:35-44.
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6 Hakoda M, Akiyama M, Kyoizumi S, et al. Measurement of in vivo HGPRT-deficient mutant cell frequency using a modified method for cloning human peripheral blood T-lymphocytes. Mutat Res, 1988, 197:161-169.
7 Davies MJ, Lovell DP, Anderson D. Thioguanine-resistant mutant frequency in T-lymphocytes from a healthy human population. Mutat Res, 1992, 265:165-171.
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8 王知权，葛志勇，王继先，等.辐射诱导人淋巴细胞微核率的研究-方法学及剂量效应关系.中国辐射卫生，1994,3:65-69.
9 蒋本荣，张忠银.人淋巴细胞胞浆分裂阻滞微核法的探讨.军事医学科学院院刊，1990，14：132-136.
10 Muir P,Osborne Y,Morley AA, et al. Karyotypic abnormality of the X chromosome is rare in mutant HPRT- lymphocyte clones. Mutat Res, 1988, 197:157-160.
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