用荧光原位杂交检测高本底辐射诱发居民染色体易位初探
作者：王春燕 早田勇 陈德清 中井斌 姜涛 袁镛龄 魏履新 菅原努
单位：王春燕、陈德清、姜涛、魏履新：100088 北京，卫生部工业卫生实验所；早田勇：日本科技厅放射线医学综合研究所；中井斌、菅原努：日本体质研究会；袁镛龄：湖南省劳动卫生研究所
关键词：
中华放射医学与防护杂志990211
天然高本底辐射能够导致居民淋巴细胞染色体非稳定性畸变率(如双着丝点)升高，尤其是对老年人，其差异具有显著性[1]。双着丝点畸变是公认的生物剂量计，已广泛地用于估算急性照射情况下的辐射剂量。但是，带有这种畸变的细胞每分裂一次，大约丢失一半。染色体易位属于稳定性畸变，能在体内长期存留。Lucas等[2]报道，检测易位有可能用于慢性照射或早先照射的剂量估算。本研究试图采用新近发展起来的一种分子生物学技术——荧光原位杂交(FISH)检测阳江高本底辐射地区(HBRA)居民染色体易位率，用于评价高本底辐射对人体健康的影响。
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一、材料和方法
1.研究对象：在HBRA塘口镇**塘村选择两户和对照地区(CA)横陂镇横陂仔村选择一户，每户选择两代人(祖父、孙子)作为研究对象。全部供血者均为世代居住，经询问和体检确定为健康者，并且均未受到过较大剂量的医疗照射。
2.剂量估算：本研究用γ辐射仪测定了HBRA和CA每个调查对象生活和工作活动环境中的天然γ射线照射量率，经用合理的室内外滞留因子的校正，计算了每个研究对象从出生到采血时的累积剂量(mGy)。
3.细胞遗传学方法
(1)标本制备：实验采用分离淋巴细胞培养法进行细胞培养[3]，将采集到的静脉血经肝素抗凝，注入淋巴细胞分离管(Leuco PLEP)中，离心分离，然后在含有20%胎牛血清，0.04 μg/ml秋水酰胺和2%PHA的RPMI 1640培养基中，37℃培养49～50小时，收获。经固定的细胞悬液在-30℃冰箱保存。空气干燥法制片，一部分标本用8%Giemsa染色，分析双着丝点畸变，另一部分用FISH法分析易位。
, 百拇医药
(2)荧光原位杂交：根据Yamada等[4]报告的方法制备染色体彩涂标本。染色体标本经RNA酶处理，老化，变性后，用1、2、4号全染色体探针(Cambio Co)进行杂交，杂交后玻片经洗涤，信号放大，用PI染液进行对比染色。
(3)畸变分析：采用带有自动坐标记录仪的荧光显微镜进行畸变分析，避免了细胞的重复记录，并便于其他研究者再次复核。全部异常细胞均作显微照相。对于非稳定性畸变每例平均分析2 500个细胞，对于稳定性畸变平均每例分析1 400个细胞。
二、结果和讨论
表1列出了HBRA和CA每一个个体从出生到采血时受到的来自环境γ射线外照射累积剂量和用FISH方法观察到的易位结果。由于用1、2、4号全染色体探针仅占全基因组的一部分(约占22.44%)，仅能检测与1、2、4号染色体有关的易位。因此，需要将FISH法测出的易位转换为全基因组易位率。根据Lucas等[2]推荐的转换公式：FP=2.05 fP(1-fP)FG进行了换算。式中FP为观察到的易位率；fP为FISH探针在全基因组中所占份额；FG为全基因组易位率。
, 百拇医药
表1 FISH法测定高本底地区居民的易位率 编号
性别
年龄
累积剂量
(cGy)
细胞数
易位数
(dic+rc)
FG/103细胞
HBRA
Y-1
男
, 百拇医药
89
26.2
2 233(791)
11(3)
13.7(3.8)
Y-3
女
10
3.3
1 015(2 979)
1(2)
2.7(0.67)
X-1
, 百拇医药
男
74
23.0
3 201(468)
18(1)
15.7(2.1)
CA
T-1
男
70
3.8
1 424(3 145)
5(3)
, 百拇医药
9.8(0.95)
T-3
男
10
0.6
1 742(3 016)
3(0)
4.8(0)
注：()内数字为用Giemsa染色分析的双着丝点结果；FG：基因组的易位率
从表1可以看出易位和双着丝点一样，老年人高于年轻人。对同一个个体来说，易位率高于双着丝点率，这表明检测易位比检测双着丝点更为敏感。
, http://www.100md.com 文献报道用FISH法检测到的自发易位率在2‰～8‰之间。Straume等[5]和Lucas等[6]报道用FISH法检测易位率分别为2.6‰和4.6‰。我国王知权等[7]报道易位率为6‰。Lucas等[2]用FISH法对日本广岛对照组的检测易位率为5.6‰～7.9‰。Tucker等[8]用FISH法对55例不同年龄组人员的研究，发现稳定性染色体畸变与年龄的平方之间有明显相关性。在本研究中也发现不论是HBRA，还是CA老年人的易位率均高于儿童。而HBRA老年人的易位率也明显高于CA，其差异接近有显著性。为了进一步探索高本底辐射是否导致当地居民易位率升高，需要更严格的选择对照，除考虑高本底辐射因素外，还应考虑其他影响因素，如年龄、医疗照射、环境化学致突因子等，应作齐同配对。
参考文献
1 姜涛，王春燕，陈德清，等.阳江高本底辐射地区家庭成员外周血淋巴细胞非稳定性染色体畸变的剂量效应关系初探.中华放射医学与防护杂志，1997，17：390-394.
, http://www.100md.com
2 Lucas JN, Awa A,Straume T,et al.Rapid translocation frequency analysis in human decades after exposure to ionizing radiation. Int J Radial Biol,1992,62:53-63.
3 Hayata I,Tabuchi H,Furukawa A,et al.Robot system for preparing lymphocyte chromosome.J Radiat Res,1992,33(Suppl):231-241.
4 Yamada K.Technical improvement and development for automated detection.In:Ministry of Health and Welfare, ed. Report on trial researchers of nuclear power by national organizations. 1996,35:118-1-4.(in Japanese)
, 百拇医药
5 Straume T,Lucas JN,Tucker JD,et al,Biodosimetry for a radiation worker using multiple assays.Health Phys,1992, 62:122-130.
6 Lucas JN,Hill F,Burk C,et al.Dose-response curve for chromosome translocations measured in human lymphocytes exposed to 60Co gamma rays.Health Phys,1995,68:761-765.
7 王知权，孙元明，李进，等.用荧光原位杂交快速检测医用诊断X射线工作者染色体结构重排及其剂量估算的探讨.中华放射医学与防护杂志，1998, 18：263-265.
8 Tucker JD,Lee DA,Ramsey MJ,et al.On the frequency of chromosome exchanges in a control population measured by chromosome painting.Mutat Res,1994,313:193-198.
(收稿：1998-08-11 修回:1998-10-03), http://www.100md.com
单位：王春燕、陈德清、姜涛、魏履新：100088 北京，卫生部工业卫生实验所；早田勇：日本科技厅放射线医学综合研究所；中井斌、菅原努：日本体质研究会；袁镛龄：湖南省劳动卫生研究所
关键词：
中华放射医学与防护杂志990211
天然高本底辐射能够导致居民淋巴细胞染色体非稳定性畸变率(如双着丝点)升高，尤其是对老年人，其差异具有显著性[1]。双着丝点畸变是公认的生物剂量计，已广泛地用于估算急性照射情况下的辐射剂量。但是，带有这种畸变的细胞每分裂一次，大约丢失一半。染色体易位属于稳定性畸变，能在体内长期存留。Lucas等[2]报道，检测易位有可能用于慢性照射或早先照射的剂量估算。本研究试图采用新近发展起来的一种分子生物学技术——荧光原位杂交(FISH)检测阳江高本底辐射地区(HBRA)居民染色体易位率，用于评价高本底辐射对人体健康的影响。
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一、材料和方法
1.研究对象：在HBRA塘口镇**塘村选择两户和对照地区(CA)横陂镇横陂仔村选择一户，每户选择两代人(祖父、孙子)作为研究对象。全部供血者均为世代居住，经询问和体检确定为健康者，并且均未受到过较大剂量的医疗照射。
2.剂量估算：本研究用γ辐射仪测定了HBRA和CA每个调查对象生活和工作活动环境中的天然γ射线照射量率，经用合理的室内外滞留因子的校正，计算了每个研究对象从出生到采血时的累积剂量(mGy)。
3.细胞遗传学方法
(1)标本制备：实验采用分离淋巴细胞培养法进行细胞培养[3]，将采集到的静脉血经肝素抗凝，注入淋巴细胞分离管(Leuco PLEP)中，离心分离，然后在含有20%胎牛血清，0.04 μg/ml秋水酰胺和2%PHA的RPMI 1640培养基中，37℃培养49～50小时，收获。经固定的细胞悬液在-30℃冰箱保存。空气干燥法制片，一部分标本用8%Giemsa染色，分析双着丝点畸变，另一部分用FISH法分析易位。
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(2)荧光原位杂交：根据Yamada等[4]报告的方法制备染色体彩涂标本。染色体标本经RNA酶处理，老化，变性后，用1、2、4号全染色体探针(Cambio Co)进行杂交，杂交后玻片经洗涤，信号放大，用PI染液进行对比染色。
(3)畸变分析：采用带有自动坐标记录仪的荧光显微镜进行畸变分析，避免了细胞的重复记录，并便于其他研究者再次复核。全部异常细胞均作显微照相。对于非稳定性畸变每例平均分析2 500个细胞，对于稳定性畸变平均每例分析1 400个细胞。
二、结果和讨论
表1列出了HBRA和CA每一个个体从出生到采血时受到的来自环境γ射线外照射累积剂量和用FISH方法观察到的易位结果。由于用1、2、4号全染色体探针仅占全基因组的一部分(约占22.44%)，仅能检测与1、2、4号染色体有关的易位。因此，需要将FISH法测出的易位转换为全基因组易位率。根据Lucas等[2]推荐的转换公式：FP=2.05 fP(1-fP)FG进行了换算。式中FP为观察到的易位率；fP为FISH探针在全基因组中所占份额；FG为全基因组易位率。
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表1 FISH法测定高本底地区居民的易位率 编号
性别
年龄
累积剂量
(cGy)
细胞数
易位数
(dic+rc)
FG/103细胞
HBRA
Y-1
男
, 百拇医药
89
26.2
2 233(791)
11(3)
13.7(3.8)
Y-3
女
10
3.3
1 015(2 979)
1(2)
2.7(0.67)
X-1
, 百拇医药
男
74
23.0
3 201(468)
18(1)
15.7(2.1)
CA
T-1
男
70
3.8
1 424(3 145)
5(3)
, 百拇医药
9.8(0.95)
T-3
男
10
0.6
1 742(3 016)
3(0)
4.8(0)
注：()内数字为用Giemsa染色分析的双着丝点结果；FG：基因组的易位率
从表1可以看出易位和双着丝点一样，老年人高于年轻人。对同一个个体来说，易位率高于双着丝点率，这表明检测易位比检测双着丝点更为敏感。
, http://www.100md.com 文献报道用FISH法检测到的自发易位率在2‰～8‰之间。Straume等[5]和Lucas等[6]报道用FISH法检测易位率分别为2.6‰和4.6‰。我国王知权等[7]报道易位率为6‰。Lucas等[2]用FISH法对日本广岛对照组的检测易位率为5.6‰～7.9‰。Tucker等[8]用FISH法对55例不同年龄组人员的研究，发现稳定性染色体畸变与年龄的平方之间有明显相关性。在本研究中也发现不论是HBRA，还是CA老年人的易位率均高于儿童。而HBRA老年人的易位率也明显高于CA，其差异接近有显著性。为了进一步探索高本底辐射是否导致当地居民易位率升高，需要更严格的选择对照，除考虑高本底辐射因素外，还应考虑其他影响因素，如年龄、医疗照射、环境化学致突因子等，应作齐同配对。
参考文献
1 姜涛，王春燕，陈德清，等.阳江高本底辐射地区家庭成员外周血淋巴细胞非稳定性染色体畸变的剂量效应关系初探.中华放射医学与防护杂志，1997，17：390-394.
, http://www.100md.com
2 Lucas JN, Awa A,Straume T,et al.Rapid translocation frequency analysis in human decades after exposure to ionizing radiation. Int J Radial Biol,1992,62:53-63.
3 Hayata I,Tabuchi H,Furukawa A,et al.Robot system for preparing lymphocyte chromosome.J Radiat Res,1992,33(Suppl):231-241.
4 Yamada K.Technical improvement and development for automated detection.In:Ministry of Health and Welfare, ed. Report on trial researchers of nuclear power by national organizations. 1996,35:118-1-4.(in Japanese)
, 百拇医药
5 Straume T,Lucas JN,Tucker JD,et al,Biodosimetry for a radiation worker using multiple assays.Health Phys,1992, 62:122-130.
6 Lucas JN,Hill F,Burk C,et al.Dose-response curve for chromosome translocations measured in human lymphocytes exposed to 60Co gamma rays.Health Phys,1995,68:761-765.
7 王知权，孙元明，李进，等.用荧光原位杂交快速检测医用诊断X射线工作者染色体结构重排及其剂量估算的探讨.中华放射医学与防护杂志，1998, 18：263-265.
8 Tucker JD,Lee DA,Ramsey MJ,et al.On the frequency of chromosome exchanges in a control population measured by chromosome painting.Mutat Res,1994,313:193-198.
(收稿：1998-08-11 修回:1998-10-03), http://www.100md.com