川芎嗪对放射损伤小鼠造血细胞粘附分子CD49d及细胞周期蛋白CyclinD2表达的影响
作者：董凌莉 孙汉英 刘文励 陶德定 张悦 徐慧珍
单位：董凌莉 孙汉英 刘文励 陶德定 张悦 徐慧珍 武汉，同济医科大学附属同济医院 430030
关键词：
川芎嗪对放射损伤小鼠造血细胞粘附分子CD49d及 细胞周期蛋白CyclinD2表达的影响 常用活血化瘀中药川芎嗪能通过改善骨髓微环境，提高基质细胞粘附功能，促进造血干 细胞增生[1]。本文作者则进一步在分子水平上探讨川芎嗪对急性放射损伤小鼠骨 髓造血细胞粘附分子CD49d及脾脏单个核细胞周期蛋白CyclinD2表达水平的影响及 意义。
一、材料和方法
1.实验小鼠和分组：清洁级昆明小白鼠36只，雌性，同批鼠龄6～7周，体重16～20?g， 由 武汉生物制品研究所动物室提供，随机分为3组，每组12只。正常组：即未照射组。川芎嗪 组：60Co γ射线行全身照射，吸收剂量8.0?Gy/只，吸收剂量率0.43 Gy/min，照射后即胃饲川芎嗪注射液4 mg/只，每天2次，连续13天。对照组：同用药组照 射 剂量处理，照射后即胃饲生理盐水0.2 ml/只，每天2次，连续13天。
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2.药物：盐酸川芎嗪注射液每毫升含川芎嗪20?mg，常州制药厂生产，批号：970617。
3.试剂和仪器：大鼠抗小鼠CD49d(VLA4)单克隆抗体(Pharmingen公司产品)，羊抗 大鼠免疫球蛋白FITC结合抗体(Pharmingen公司产品)，大鼠抗小鼠CyclinD2单克隆抗体( Calbiochem公司产品)，碘化丙啶(P1，Sigma公司产品)，Rnase A(Sigma公司产品)，流式 细胞仪(Becton Dickinson FACSsort)。
4.骨髓单个核细胞(MNC)悬液制备：分别于照射后第7、14天每组随机取6只小鼠，断颈处 死，取股骨冲出骨髓细胞，制备骨髓MNC悬液，调细胞浓度为1×107/ml，备用。
5.脾脏单个核细胞(MNC)悬液制备：照射后第14天分别取上述各组6只小鼠的新鲜脾脏，研 碎，200目尼龙网过滤，离心，制备脾脏MNC悬液，调细胞浓度为5×106/ml，备用。
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6.骨髓MNC粘附分子CD49d表达的检测：将骨髓MNC悬液按左连富介绍的方法[2 ]，依次用1：10稀释度的大鼠抗小鼠CD49d单克隆抗体(第一抗体)和1：40稀释度 的羊抗大鼠IgG-FITC荧光抗体(第二抗体)分别4℃孵育30分钟。用磷酸盐缓冲液(PBS)洗 3次后经流式细胞仪检测CD49d表达水平。
7.脾脏MNC的CyclinD2表达水平及其G0+G1期细胞比例的检测：将脾脏MNC用1%甲醛 冰 上固定15分钟，洗涤后再用80%酒精-20℃固定。按文献介绍的方法[3]，将固定的 细胞清洗后用0.25% TritonX-100 PBS液冰上作用5分钟。清洗后依次加入1：400稀释度的 大鼠抗小鼠cyclinD2单克隆抗体(第一抗体)和1：40稀释度的羊抗大鼠IgG-FITC荧光抗体 (第二抗体)分别4℃过夜、室温孵育30分钟，再加入10?μg/ml PI和0.1% Rnase A PBS染 液 作用20分钟。经流式细胞仪分析脾脏MNC的CyclinD2表达水平及其G0+G1期细胞比例。
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8.统计学分析：数据均以均数±标准差(
±s)表示，采用t检验。
二、结果
1.骨髓单个核细胞CD49d表达水平：放射损伤后第7天川芎嗪组CD49d表达水 平显著高于对照组，两组相比，差异有非常显著性(P<0.01)，见表1。放射损伤后 第14天 ，川芎嗪组CD49d表达下降，且显著低于正常组，两组相比，差异有非常显著性( P <0.01)；而对照组表达则上升，且显著高于正常组，两组相比，差异有非常显著性(P <0.01)。
2.脾脏单个核细胞CyclinD2表达水平及G0+G1期细胞比例：急性放射损伤后第1 4 天，川芎嗪组脾脏单个核细胞cyclinD2表达水平显著高于对照组，两组相比，差异有非常 显著 性(P<0.01)，而G0+G1期细胞比例显著低于对照组，两组相比，差异有非常显著 性(P<0.01)，见表2。
, 百拇医药
表1 照射后不同时间骨髓单个核细胞CD49d表达水平(±s)
组别
小鼠数
(只)
骨髓单个核
细胞CD49d表达水平
第7天
第14天
正常组
, 百拇医药
6
32.69±4.13
36.14±2.68
对照组
6
22.54±2.63*
46.36±3.40*
川芎嗪组
6
36.51±3.67△
23.61±2.12△*
, 百拇医药
注：与正常组比*P<0.01;与对照组比△P<0.01
表2 照射后第14天脾脏单个核细胞CyclinD2表达水平及其G0+G1 期细胞比例的比较(±s)
组别
小鼠数
(只)
CyclinD2
G0+G1期细胞
, 百拇医药
比例(%)
正常组
6
0.82±0.17
95.65±0.69
对照组
6
1.23±0.37*
92.07±0.84*
川芎嗪组
6
2.13±0.59*△
, 百拇医药
87.96±0.55*△
注：与正常组比*P<0.01;与对照组比△P<0.01
三、讨论
细胞粘附分子是位于细胞表面的糖蛋白。早期造血祖细胞表达VLA4(CD49d)，并借 此与基质细胞上血管细胞粘附分子(VCAM-1)及胞外基质中纤维粘连蛋白(Fn)粘附[4] 。VLA4直接参与红系、B淋巴系的分化，且有利于骨髓造血细胞的增殖[5]。本 实验中川芎嗪组在放射损伤后第7天骨髓MNC的VLA4表达显著增加，而对照组第14天表达才 增加，说明川芎嗪一方面能提高基质细胞粘附功能[1]，另一方面可加速骨髓造血 细胞粘附分子的高表达，从而加强造血细胞与基质细胞间相互作用。至受照后第14天，川芎 嗪组VLA4表达下降，VLA4表达的减少，允许细胞更容易进入外周循环[4]。我 们以前观察的结果也支持这点[1]。
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细胞周期不同时相(G1、S、G2、M期)间存在关键的调控点(check point)，其中最重要 的是G1/S调控点。G1/S调控点受细胞周期蛋白(Cyclin)和细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyc lin dependent kinese,CDK)复合物的调控。已有学者证实CyclinD2、CyclinD3调节小 鼠骨髓造血细胞G1/S期转换，且CyclinD的表达直接影响着细胞由G1→S期转换的速率和 时间[6]。本实验显示川芎嗪组CyclinD2表达显著高于对照组。CyclinD2的高 表达，必加速细胞由G1→S期的转换，实验结果该治疗组处于G0+G1期细胞比例显著低 于对照组即证实了这点。
本课题受湖北省自然科学基金资助(项目号：96 J 080)
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参考文献
1 孙汉英，舒砚君，刘文励，等.川芎嗪改善免疫诱导再障小鼠骨髓微环境的作 用研究.中华血液学杂志，1998，19：178-180.
2 左连富.流式细胞术样品制备技术.北京：华夏出版社，1991.83,94-95.
3 Gong J,Bhatia V,Traganos F,et al.Expression of Cyclin A, D2 and D3 in in di vidual nomal mitogen stimulated lymphocytes and in MOLT-4 leukemic cells analy sed by multiparameter flow cytometry.Leucemia,1995,9:883-889.
4 Jacobsen K,Kravitz J,Kincade PW.Adhesion receptors on bone marrow stromal ce l l:In vivo expresion of vascular cell adhesion molecule-1 by reticular cells and sinusoidal endothelium in nomal and γ-irradiated mice.Blood,1996,87:73-82.
, 百拇医药
5 Coulombel L,Auffray I,Gaugler MH,et al.Expression and function of integrins o n hematopoietic progenitor cells.Acta Haematol,1997,97:13-21.
6 Andok,Ajekenbaum-Cymbalista F.Regulation of G1/S transition by Cyclin D 2 and D3 in hematopoietic cells.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90:9571-9375.
(收稿:1998-03-09 修回1998-05-05), 百拇医药
单位：董凌莉 孙汉英 刘文励 陶德定 张悦 徐慧珍 武汉，同济医科大学附属同济医院 430030
关键词：
川芎嗪对放射损伤小鼠造血细胞粘附分子CD49d及 细胞周期蛋白CyclinD2表达的影响 常用活血化瘀中药川芎嗪能通过改善骨髓微环境，提高基质细胞粘附功能，促进造血干 细胞增生[1]。本文作者则进一步在分子水平上探讨川芎嗪对急性放射损伤小鼠骨 髓造血细胞粘附分子CD49d及脾脏单个核细胞周期蛋白CyclinD2表达水平的影响及 意义。
一、材料和方法
1.实验小鼠和分组：清洁级昆明小白鼠36只，雌性，同批鼠龄6～7周，体重16～20?g， 由 武汉生物制品研究所动物室提供，随机分为3组，每组12只。正常组：即未照射组。川芎嗪 组：60Co γ射线行全身照射，吸收剂量8.0?Gy/只，吸收剂量率0.43 Gy/min，照射后即胃饲川芎嗪注射液4 mg/只，每天2次，连续13天。对照组：同用药组照 射 剂量处理，照射后即胃饲生理盐水0.2 ml/只，每天2次，连续13天。
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2.药物：盐酸川芎嗪注射液每毫升含川芎嗪20?mg，常州制药厂生产，批号：970617。
3.试剂和仪器：大鼠抗小鼠CD49d(VLA4)单克隆抗体(Pharmingen公司产品)，羊抗 大鼠免疫球蛋白FITC结合抗体(Pharmingen公司产品)，大鼠抗小鼠CyclinD2单克隆抗体( Calbiochem公司产品)，碘化丙啶(P1，Sigma公司产品)，Rnase A(Sigma公司产品)，流式 细胞仪(Becton Dickinson FACSsort)。
4.骨髓单个核细胞(MNC)悬液制备：分别于照射后第7、14天每组随机取6只小鼠，断颈处 死，取股骨冲出骨髓细胞，制备骨髓MNC悬液，调细胞浓度为1×107/ml，备用。
5.脾脏单个核细胞(MNC)悬液制备：照射后第14天分别取上述各组6只小鼠的新鲜脾脏，研 碎，200目尼龙网过滤，离心，制备脾脏MNC悬液，调细胞浓度为5×106/ml，备用。
, 百拇医药
6.骨髓MNC粘附分子CD49d表达的检测：将骨髓MNC悬液按左连富介绍的方法[2 ]，依次用1：10稀释度的大鼠抗小鼠CD49d单克隆抗体(第一抗体)和1：40稀释度 的羊抗大鼠IgG-FITC荧光抗体(第二抗体)分别4℃孵育30分钟。用磷酸盐缓冲液(PBS)洗 3次后经流式细胞仪检测CD49d表达水平。
7.脾脏MNC的CyclinD2表达水平及其G0+G1期细胞比例的检测：将脾脏MNC用1%甲醛 冰 上固定15分钟，洗涤后再用80%酒精-20℃固定。按文献介绍的方法[3]，将固定的 细胞清洗后用0.25% TritonX-100 PBS液冰上作用5分钟。清洗后依次加入1：400稀释度的 大鼠抗小鼠cyclinD2单克隆抗体(第一抗体)和1：40稀释度的羊抗大鼠IgG-FITC荧光抗体 (第二抗体)分别4℃过夜、室温孵育30分钟，再加入10?μg/ml PI和0.1% Rnase A PBS染 液 作用20分钟。经流式细胞仪分析脾脏MNC的CyclinD2表达水平及其G0+G1期细胞比例。
, 百拇医药
8.统计学分析：数据均以均数±标准差(
±s)表示，采用t检验。二、结果
1.骨髓单个核细胞CD49d表达水平：放射损伤后第7天川芎嗪组CD49d表达水 平显著高于对照组，两组相比，差异有非常显著性(P<0.01)，见表1。放射损伤后 第14天 ，川芎嗪组CD49d表达下降，且显著低于正常组，两组相比，差异有非常显著性( P <0.01)；而对照组表达则上升，且显著高于正常组，两组相比，差异有非常显著性(P <0.01)。
2.脾脏单个核细胞CyclinD2表达水平及G0+G1期细胞比例：急性放射损伤后第1 4 天，川芎嗪组脾脏单个核细胞cyclinD2表达水平显著高于对照组，两组相比，差异有非常 显著 性(P<0.01)，而G0+G1期细胞比例显著低于对照组，两组相比，差异有非常显著 性(P<0.01)，见表2。
, 百拇医药
表1 照射后不同时间骨髓单个核细胞CD49d表达水平(
±s)组别
小鼠数
(只)
骨髓单个核
细胞CD49d表达水平
第7天
第14天
正常组
, 百拇医药
6
32.69±4.13
36.14±2.68
对照组
6
22.54±2.63*
46.36±3.40*
川芎嗪组
6
36.51±3.67△
23.61±2.12△*
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注：与正常组比*P<0.01;与对照组比△P<0.01
表2 照射后第14天脾脏单个核细胞CyclinD2表达水平及其G0+G1 期细胞比例的比较(
±s)组别
小鼠数
(只)
CyclinD2
G0+G1期细胞
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比例(%)
正常组
6
0.82±0.17
95.65±0.69
对照组
6
1.23±0.37*
92.07±0.84*
川芎嗪组
6
2.13±0.59*△
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87.96±0.55*△
注：与正常组比*P<0.01;与对照组比△P<0.01
三、讨论
细胞粘附分子是位于细胞表面的糖蛋白。早期造血祖细胞表达VLA4(CD49d)，并借 此与基质细胞上血管细胞粘附分子(VCAM-1)及胞外基质中纤维粘连蛋白(Fn)粘附[4] 。VLA4直接参与红系、B淋巴系的分化，且有利于骨髓造血细胞的增殖[5]。本 实验中川芎嗪组在放射损伤后第7天骨髓MNC的VLA4表达显著增加，而对照组第14天表达才 增加，说明川芎嗪一方面能提高基质细胞粘附功能[1]，另一方面可加速骨髓造血 细胞粘附分子的高表达，从而加强造血细胞与基质细胞间相互作用。至受照后第14天，川芎 嗪组VLA4表达下降，VLA4表达的减少，允许细胞更容易进入外周循环[4]。我 们以前观察的结果也支持这点[1]。
, http://www.100md.com
细胞周期不同时相(G1、S、G2、M期)间存在关键的调控点(check point)，其中最重要 的是G1/S调控点。G1/S调控点受细胞周期蛋白(Cyclin)和细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyc lin dependent kinese,CDK)复合物的调控。已有学者证实CyclinD2、CyclinD3调节小 鼠骨髓造血细胞G1/S期转换，且CyclinD的表达直接影响着细胞由G1→S期转换的速率和 时间[6]。本实验显示川芎嗪组CyclinD2表达显著高于对照组。CyclinD2的高 表达，必加速细胞由G1→S期的转换，实验结果该治疗组处于G0+G1期细胞比例显著低 于对照组即证实了这点。
本课题受湖北省自然科学基金资助(项目号：96 J 080)
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参考文献
1 孙汉英，舒砚君，刘文励，等.川芎嗪改善免疫诱导再障小鼠骨髓微环境的作 用研究.中华血液学杂志，1998，19：178-180.
2 左连富.流式细胞术样品制备技术.北京：华夏出版社，1991.83,94-95.
3 Gong J,Bhatia V,Traganos F,et al.Expression of Cyclin A, D2 and D3 in in di vidual nomal mitogen stimulated lymphocytes and in MOLT-4 leukemic cells analy sed by multiparameter flow cytometry.Leucemia,1995,9:883-889.
4 Jacobsen K,Kravitz J,Kincade PW.Adhesion receptors on bone marrow stromal ce l l:In vivo expresion of vascular cell adhesion molecule-1 by reticular cells and sinusoidal endothelium in nomal and γ-irradiated mice.Blood,1996,87:73-82.
, 百拇医药
5 Coulombel L,Auffray I,Gaugler MH,et al.Expression and function of integrins o n hematopoietic progenitor cells.Acta Haematol,1997,97:13-21.
6 Andok,Ajekenbaum-Cymbalista F.Regulation of G1/S transition by Cyclin D 2 and D3 in hematopoietic cells.Proc Natl Acad Sci USA,1993,90:9571-9375.
(收稿:1998-03-09 修回1998-05-05), 百拇医药