放射复合伤对骨髓基质细胞粘附功能影响的初步观察
作者：陈幸华 罗成基 郭朝华 王苹 邓学才
单位：陈幸华 重庆，第三军医大学附属新桥医院全军肿瘤中心;400037；罗成基、郭朝华 第三军医 大学全军复合伤研究所；王苹 附属新桥医院中西医结合科；邓学才 第三军医大学 基础部
关键词：放射复合伤；骨髓；基质细胞；细胞粘附；小鼠
中华放射医学与防护杂志990315 【摘要】 目的 初步探讨放射复合伤对骨髓造血微环境中基质细胞粘附功能损伤的机理。 方法 采用流式细胞仪、细胞粘附实验和细胞粘附阻断实验等方法，检测5 .0 Gy γ射线全身照射、15%体表面积Ⅲ度烧伤和放射复合伤小鼠骨髓基质细胞表达血管细 胞 粘附分子(VCAM-1)、纤维连接素(Fn)、层粘素(Ln)和Ⅳ型胶原(Col Ⅳ)等成分的变化以及 骨髓基质细胞贴壁层对骨髓单个核细胞粘附能力的影响。结果 ①骨髓基质细胞表达VCAM-1、Fn、Ln和Col Ⅳ的水平具有以单烧组 >正常组>复合伤组>单放组的特点。②伤后第3～7天，单烧组骨髓基质细胞的粘附能力显 著高于正常组(P<0.05～P<0.01)；单放组和伤后第3天的复合伤组则反之。③ 分别用 VCAM-1、Fn、Ln和Col Ⅳ单抗处理骨髓基质细胞贴壁层后，骨髓单个核细胞的粘附率较未 加单抗组均有不同程度的下降。结论 骨髓微环境基质细胞粘附功能的损伤可能是影响放射复合伤骨髓造 血功能障碍的原因之一。
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Primary observation on adherent function of bone marrow stroma l cells in mice post combined radiation-burn injury.
CHEN Xinghua,LUO Chengji,GUO Chaohua et al.Affiliated Xinqiao Hospital,Third Military Medical Unive rsity,Chongqing 400037,China.
【Abstract】 Objective To investigate the adherent function of bon e marrow stromal cells in hematopoietic inducive microenvironment post combined radiation-burn injury. Methods The expression of cell adhesion molecules including vascul a r cell adhesion molecule-1(VCAM-1),fibronection(Fn),laminin (Ln) and collagen ty pe IV (Col Ⅳ) on bone marrow stromal cells cultured in vitro was detected b y fl ow cytometry and the binding capacity of bone marrow mononuclear cells to stroma l cell adherence layer was tested by cell binding assay and cell binding blockin g assay respectively from mice treated with 5.0 Gy γ-ray 15% of total body sur face area (TBSA),third-degree burn injury and combined irradiation-burn injur y,respectively. Resul ts 1.The expression levels of molecules mentioned above in burn-injured m ice were the highest.The molecules levels in control mice were greater than thos e in radiation-injured mice,which were lower than those in mice with combined r adiation-burn injury.2.The binding capacity of stromal cell adherence layer in burn-injured mice was greater than that in control mice,and significantly incre ased from 3 to 7 days post injury as compared with that in controls,radiation-i njured mice and combined radiation-burn-injured mice, respectively (P<0. 0 5-0.01).Contrarily,the capacity of binding in the radiation-injured and combin ed radiation-burn-injured mice was the lowest from 3 to 7 days post injury.3.T he binding rate of bone marrow mononuclear cells to stromal cell adherence layer descended in different degrees after pre-treatment with monoclonal antibodies directed to VCAM-1,Fn,Ln,or Col Ⅳ respectively or VCAM-1 combined with a nti-Fn,anti-Ln or anti-Col Ⅳ,respectively,in stromal cell adherence layer. Conclusion The damage of cell adherent function for bone marrow hemat opoietic inducive microenvironment post combined radiation-burn injury might b e one of the important factors in hematopoietic disorder in combined radiation-b urn injury.
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【Key words】 Combined radiation-burn injury Bone marrow St romal cells Cell adherence Mice
为进一步探讨放射复合伤对造血微环境损伤的机理，本文作者观察了5.0 Gy 射线放射损 伤、15%Ⅲ度体表面积烧伤和放射复合伤小鼠骨髓基质细胞表达血管细胞粘附分子(Vascula r cell adhesion molecules-1,VCAM-1)、纤维连接素(Fibronectin,Fn)、层粘素(Laminin ,Ln)和Ⅳ型胶原(Collagen Ⅳ,Col Ⅳ)等成分的变化和放射复合伤小鼠骨髓基质细胞贴壁层 对正常骨髓单个核细胞的粘附能力以及分别或复合应用VCAM-1、Fn、Ln和胶原Ⅳ等单抗 对骨髓基质细胞粘附能力的影响。
材料和方法
1.实验动物与分组：昆明种健康雄性小鼠共210只，体重20～30?g，由本校实验动物中心提供。实验分为4组： ①单纯放射损伤组(简称单放组)：60只小鼠，用本室60Coγ源行一次性全身照射 ，距离1.5 m，照射总吸收剂量5.0?Gy，吸收剂量率0.4019～0.6646 Gy/min。②单纯 烧 伤组(简称单烧组)：45只小鼠，按本室常规方法，致成Ⅲ度烧伤，烧伤体表面积为15%(病理 切片证实)。③放射损伤复合烧伤组(简称复合伤组)：60只小鼠，照射剂量和烧伤面积的方 法同上；照射后30分钟内实施烧伤。④正常对照组(简称正常组)：45只小鼠。
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2.骨髓基质细胞培养：按我们既往报道的方法[1]。
3.流式细胞仪检测：采用间接免疫荧光法，台盼蓝染色判定骨髓基质细胞的成活率为95%以 上。在各样本管中分别加入一抗(VCAM-1,Fn,Ln和Col Ⅳ等单抗)，终浓度分别为20 μg/ml 、20?μg/ml、40?μg/ml和40?μg/ml；阴性对照分别用PBS和小鼠骨髓瘤蛋白IgG1、IgG 2a、IgG2b代替一抗，4℃过夜，离心弃上清，PBS洗3次。分别加1：50工作浓度的FITC标记 的二抗(羊抗鼠IgG，终浓度为10 μg/ml，37℃孵育30分钟，离心弃上清，PBS洗3次，即送 流 式细胞仪(Becton Dickinson公司，FACStar plus型)检测，测定前用戊二醛固定的鸡红细胞 调节仪器，使CV值稳定在4%左右，收集细胞10?000个，由仪器配备的软件LysisⅡ处理后， 计算出各检测指标的阳性细胞百分数。
4.细胞粘附实验和细胞粘附阻断实验[2]：取正常小鼠骨髓单个核细胞(5×106/ml)，用3.7×106 BqNa251CrO4共同孵 育30分钟，用10倍体积pH 7.4的PBS于4℃离心15分钟共3次；用含10%小牛血清的RPMI 1640 培养液重悬细胞，调整细胞浓度为1×106/ml。各损伤组和正常组经培养28天的骨髓基质 细胞贴壁层经弃液，RPMI 1640培养液冲洗，加入1 ml51Cr标记的骨髓单个核细 胞 。37℃孵育3小时，吸出培养液和未粘附的骨髓有核细胞，PBS洗3次；用含0.05%胰酶和0. 5 mmol/L EDTA消化脱落贴壁细胞并用吸管吹打分散细胞，收集粘附细胞悬液，测定其放射 性 (计数.min-1)。计算骨髓有核细胞的粘附率，计算公式如下：
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取正常组和单烧组伤后7天并经培养28天的骨髓基质细胞贴壁层，弃培养液，用RPMI 1640培 养液洗3次，各皿分别加入1 ml抗VCAM-1(20 μg/ml)、Fn(20 μg/ml)、Ln(40 μg/ml)和C ol Ⅳ(40 μg/ml)等单抗或联合加入上述相同浓度的单抗，阴性对照同前所述。37℃孵育30分 钟 后，弃液，再分别加入1 ml51Cr标记的正常鼠骨髓单个核细胞(1×106/ml)，3 7 ℃孵育30分钟，吸出孔内液体，用PBS洗3次，经胰酶消化脱落后测定粘附细胞悬液的放射性 强度(计数.min-1)。计数细胞粘附阻断率，计算公式如下：
5.实验数据的统计学处理：结果以
±s表示，t检验求出P值。
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结 果
1.放射复合伤骨髓基质细胞表达几种粘附分子的变化，见表1。
表1 骨髓基质细胞几种粘附分子表达的阳性细胞百分比 (±s) 组别
动物数
(只)
检 测
指 标
正常组
(45只)
阳性细胞百分比
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伤后1天
伤后2天
伤后3天
伤后7天
伤后14天
伤后28天
单 烧
45
VCAM-1
27.32▲▲△△1.58
24.37±1.45▲
36.48±1.91▲▲△△
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47.28±2.63*▲▲▲
56.22±3.57*▲▲△△
38.71±1.88▲▲△△
29.46±1.76
单 放
60
VCAM-1
27.32±1.58
12.26±0.72**
13.54±0.82**
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8.49±0.56**
8.64±0.52**
14.62±1.08**
20.15±1.62
复合伤
60
VCAM-1
27.32±1.58
19.57±1.26
13.83±0.95**
11.45±0.67**
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13.56±0.97**
18.48±1.42
23.63±1.38
单 烧
45
Fn
41.26±2.36
38.43±2.18▲▲△△
36.48±2.33▲▲△△
48.28±2.71▲△△
57.33±2.26*▲▲△△
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45.91±2.37▲△△
43.62±2.53▲△△
单 放
60
Fn
41.26±2.36
20.41±1.23**
15.47±1.06**▲
10.82±0.83**▲▲△△
6.54±0.45**▲▲
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19.71±1.18**▲
25.28±1.51*
复合伤
60
Fn
41.26±2.36
18.64±1.22**
25.31±1.67*
32.36±1.78
38.51±2.15
31.26±1.53
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28.58±1.723
单 烧
45
Ln
16.32±1.28
18.63±1.54
22.55±1.83
45.17±2.46**▲▲△△
31.78±2.15**▲▲△△
26.16±1.97*▲▲△△
22.73±1.92
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单 放
60
Ln
16.32±1.28
12.24±0.92
13.18±1.13
8.62±0.85**
10.27±0.95*
12.59±1.22
14.61±1.46
复合伤
, http://www.100md.com 60
Ln
16.32±1.28
14.28±1.16
17.32±1.35
10.51±1.07*
12.28±1.62
14.67±1.08
15.22±0.72
单 烧
45
Col Ⅳ
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18.63±1.15
22.17±1.78▲▲△△
30.81±2.27**▲▲△△
42.24±2.58**▲▲△△
30.82±2.13**▲▲△△
36.24±2.35**▲▲△△
22.73±1.68
单 放
60
Col Ⅳ
, 百拇医药
18.63±1.15
12.15±1.06
10.35±0.82*
7.28±0.68**
4.31±0.27**△
13.15±0.92
15.61±1.46
复合伤
60
Col Ⅳ
18.63±1.15
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13.33±0.91
12.42±0.75
9.62±0.33**
11.35±0.21*
15.27±0.58
17.28±0.72
注：与正常组比较*P<0.05，**P<0.01；与复合伤 组比较 ▲P<0.05，▲▲P<0.01；单烧组与单放组比较△P<0.05，△△P<0.01
不同组之间骨髓基质细胞VCAM-1表达水平的比较：单烧组>正常组>复合伤组>单放 组。单烧组VCAM-1的表达水平以伤后第7天水平最高，至伤后28天仍高于正常组、相应的 单放组和复合伤组(P<0.05)；单放组和复合伤组在伤后各时相点均低于相应的正常 组 ，且以伤后第3天和第7天最低，以后逐渐回升，至伤后28天仍未达正常组水平；复合伤组各 伤后时相点高于相应的单放组。
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除单烧组伤后第1和第3天骨髓基质细胞表达Fn的水平低于正常组(P>0.05)外，各组骨 髓基质细胞表达Fn、Ln和Col Ⅳ水平的特点和规律与VCAM-1表达的特点和规律相似。
2.骨髓基质细胞贴壁层对正常骨髓单个核细胞粘附能力的影响，见表2。
表2 骨髓单个核细胞对骨髓基质细胞
贴壁层的粘附百分比 (±s) 组别
动物只数
粘附百分比
伤后1天
伤后2天
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伤后3天
伤后7天
伤后14天
伤后2 8天
单烧
45
31.35±
33.71±
39.26±
42. 63±
30.26±
28.76±
1.06
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1.82▲
1.18*▲
1.84#▲
0.75△
0.68
单放
60
16.23±
14.28±
10.53
11.85±
17.27±
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19.61±
0.67#
1.05#
0.57#
0.66#
0.57
0.16
复合伤
60
19.42±
16.86±
11.52±
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15.15±
19.58±
21.26±
1.15
0.56*
0.82#
0.36*
0.57
0.83
注：正常组值为26.56±1.52; 与正常组比较*P<0.05,#P<0.01；与复 合伤组比较△P<0.05，▲P<0.01；单烧组与单放组比较P<0.05，P<0.01
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单烧组于伤后各时相点均高于正常组，以伤后第3天～7天为著((P<0.05～P <0.01) ；单放组则反之；复合伤组伤后各时相点均低于正常组，以伤后第3天为著(P<0.01) ，各组间比较：单烧组>正常组>复合伤组>单放组，复合伤组和单放组间差异无显著性(P>0.05)。
3.粘附分子单克隆抗体对烧伤小鼠骨髓基质细胞贴壁层的粘附阻断作用，见表3。
表3 几种粘附分子单抗对骨髓有核
细胞粘附百分比的影响 (±s) 组 别
正常组
单烧组
未加单抗
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26.56±1.52
42.63±2.62
加Anti-VCAM-1
12.37±1.05**
21.82±1.27**
加Anti-Fn
20.42±1.33
27.51±1.61*
加Anti-Ln
24.18±1.52
37.35±2.06
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加Anti-Col Ⅳ
23.71±1.27
35.58±1.83
加Anti-VCAM-1+Anti-Fn
10.15±0.93**
18.18±1.26**
加Anti-VCAM-1+Anti-Ln
10.83±1.05**
19.21±1.23**
加Anti-VCAM-1+Anti-Col Ⅳ
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11.35±1.16**
19.87±1.51 **
注：与未加单抗组比较*P<0.05，**P<0.01
正常组经培养28天的骨髓基质细胞层分别用VCAM-1、Fn、Ln和Col Ⅳ单抗处理后，骨 髓单个核细胞的粘附率较未加单抗组分别下降了53.43%、23.12%、8.97%和12.76%；VCA M-1单抗分别复合Fn、Ln和Col Ⅳ单抗处理后，骨髓单个核细胞的粘附率较未加单抗组分别 下降了61.7%、59.22%和57.27%；对单烧伤组伤后7天培养28天的骨髓基质细胞分别用VCA M-1、Fn、Ln和Col Ⅳ单抗处 理后，骨髓单个核细胞的粘附率较未加单抗组分别下降了48. 51%、35.09%、11.87%和16.05%；VCAM-1单抗分别复合Fn、Ln和Col Ⅳ单抗处理后，骨 髓单个核细胞的粘附率较未加单抗组分别下降了57.10%、54.67%和53.11%。
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讨 论
细胞粘附分子(Cell adhesion molecules,CAMs)是介导造血干、祖细胞特异的回髓定位以及 造血细胞和基质细胞密切接触和相互粘附作用的分子学基础，其种类繁多，功能相当复杂 [2]。整合素(Integrins)是广泛表达于造血实质细胞表面糖蛋白分子的粘附受体超家族 分子[3]。最迟出现抗原4(very late artigen-4,VLA-4)是Integrin β1亚家族 的成员之一，它和VLA亚家族的其他成员一样，具有与一种以上的配体结合的能力。骨髓基 质细胞除能够产生多种造血生长因子外，同时还具有各种细胞因子的受体，能结合和聚集外 来的因子于局部，形成不同细胞因子的不同浓度分布区[4]。此外，骨髓基质具有 广阔的胞浆和ECM，后者含Fibronectin、Laminin和Collagen Ⅳ，都与造血细胞的粘附有关 [5]。由基质细胞产生和分泌的ECM，通过氨基葡聚糖(glycos aminoglycans,AGA) 分子的残端及其粘附位点形成包裹造血细胞和基质细胞的网状结构[6]。ECM中的硫 酸类肝素(heparanulfate)能选择性地结合一些造血生长因子如IL-3、GM-CSF等，间接地 把带有相应受体的造血干细胞和祖细胞粘附于骨髓基质[7]。VCAM-1分子最初由美 国学者Harlan于1985年从人的脐带血管内皮细胞上发现的，这种分子在细胞与细胞间相互识 别和粘附的过程中发挥着重要的作用[8]。Dittel等[9]对28名经放射疗法 和 化疗药物预处理后接受骨髓移植的患者进行了研究，结果表明，骨髓移植后21～28天，患者 骨髓基质细胞VCAM-1表达水平以及骨髓基质细胞层支持造血祖细胞生长的能力均低于正常 对照组。郭琳琅等[10]观察了培养的人肺巨细胞癌和肺腺癌体外移动性的改变，结 果表明，加入外源性Fn和Ln后，两株癌细胞的移动性均增强。关于放射复合伤造血功能障碍 的造血调控的机理研究，以往主要侧重于对造血实质细胞损伤的观察，而对造血实质细胞赖 以生存的造血微环境在放射复合伤造血障碍中的作用及其机理的研究尚缺乏进一步的观察。 本实验的结果表明，从不同的损伤组、伤后不同时间的骨髓基质细胞表达VCAM-1、Fn、Ln 和Col Ⅳ等成分变化具有以单烧组>正常组>复合伤组>单放组的特点以及单烧组具有以伤 后3天和7天最高，单放组和复合伤组以伤后3天和伤后7天最低的时效特征。提示无论是单伤 或复合伤均可影响基质细胞的粘附功能。
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我们曾观察到，在相同损伤条件下和同一规格的培养皿中，单放组和复合伤组的骨髓基质细 胞集落形成能力(CFU-F)均以伤后第3、7天最低，至伤后第28天仍未达正常组水平(P < 0.01)；单烧伤组除伤后第3天低于正常组外(P<0.05)，至伤后第7天与正常组差异无显著性 。正常组和伤后不同时相点的单烧组，均在培养28天时形成长满培养皿底的基质细胞层 ；单放组在伤后28天并经培养第28天时仍未长满培养皿底[1]。为探讨放射复合伤 对骨髓基质细胞粘附功能的影响，本文作者采用细胞粘附试验的方法，检测了骨髓单个核细 胞对各损伤组骨髓基质细胞贴壁层的粘附百分率。结果表明，单烧组骨髓基质细胞的粘附能 力以伤后第3～7天最强；单放组则反之；复合伤组伤后各时相点均低于正常组，且以伤后第 3天为著(P<0.01)。提示伤后骨髓基质细胞集落生成能力的大小与其粘附能力的强弱 有关。然而，单烧组骨髓基质细胞集落生成能力于伤后第3天低于正常组(P<0.05)， 为何具有较强的粘附能力以及放射复合伤组骨髓基质细胞的粘附能力的减弱并非出现两单伤 之合的加重效应，提示烧伤因素可能具有刺激骨髓基质细胞粘附分子表达的作用，其机理有 待进一步研究。
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基于正常组和伤后不同时相点的单烧组的骨髓基质细胞在同一规格的培养皿中，均在培养28 天时形成长满培养皿底的基质细胞层以及单烧组骨髓基质细胞表达VCAM-1、Fn、Ln和Col Ⅳ等的水平以伤后第3～7天最高的特点，故本试验以正常组和单烧组伤后7天并经体外培 养28天的骨髓基质细胞贴壁层为观察时相点，采用细胞粘附阻断试验的方法，进一步验证VC AM-1、FN、Ln和Col Ⅳ等单抗对骨髓基质细胞粘附功能的影响。无论是骨髓单个核细胞对 伤后基质细胞粘附率，还是应用相应的单抗处理后对骨髓单个核细胞粘附的阻断率方面，均 显示出VCAM-1、Fn对基质细胞的粘附作用最大，Ln和Col Ⅳ的作用较小，采用VCAM-1、 Fn 、Ln和Col Ⅳ等单抗单独或联合作用后，不能完全阻断骨髓单个核细胞的粘附，说明造血实 质细胞表达的粘附分子配体也具有重要作用；此外参与造血细胞和基质细胞间的粘附分子种 类繁多，基质细胞分泌和产生的ECM分子也多种多样，这些分子在调节细胞粘附的过程中都 可能起着某些作用。Simmons等[11]采用抗Integrin α4 β1抗体163H.1R1处理 CD34+细胞或用抗VCAM-1抗体6G10处理基质细胞都能使CD34+细胞和骨髓基 质 细胞之间的粘附率减少3倍以上，本实验虽没有对造血干、祖细胞粘附分子的表达进行研究 ，也未观察到抗VCAM-1单抗的粘附阻断作用达到上述文献所报道的水平。本实验的初步结 果提示，骨髓微环境基质细胞粘附功能的损伤可能是影响放射复合伤造血功能障碍的原因 之一 ，有助于对放射复合伤造血障碍发生机理的认识。由于参与造血细胞和基质细胞间的粘附分 子种类繁多，基质细胞分泌和产生的ECM分子也多种多样，这些分子在放射复合伤造血调控 中的作用尚需进一步探讨。
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致谢：本课题得到程天民院士和粟永萍教授的指教，特此感谢
本课题受全军“八五”攻关基金资助
参考文献
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(收稿:1998-01-19 修回1998-04-06), 百拇医药
单位：陈幸华 重庆，第三军医大学附属新桥医院全军肿瘤中心;400037；罗成基、郭朝华 第三军医 大学全军复合伤研究所；王苹 附属新桥医院中西医结合科；邓学才 第三军医大学 基础部
关键词：放射复合伤；骨髓；基质细胞；细胞粘附；小鼠
中华放射医学与防护杂志990315 【摘要】 目的 初步探讨放射复合伤对骨髓造血微环境中基质细胞粘附功能损伤的机理。 方法 采用流式细胞仪、细胞粘附实验和细胞粘附阻断实验等方法，检测5 .0 Gy γ射线全身照射、15%体表面积Ⅲ度烧伤和放射复合伤小鼠骨髓基质细胞表达血管细 胞 粘附分子(VCAM-1)、纤维连接素(Fn)、层粘素(Ln)和Ⅳ型胶原(Col Ⅳ)等成分的变化以及 骨髓基质细胞贴壁层对骨髓单个核细胞粘附能力的影响。结果 ①骨髓基质细胞表达VCAM-1、Fn、Ln和Col Ⅳ的水平具有以单烧组 >正常组>复合伤组>单放组的特点。②伤后第3～7天，单烧组骨髓基质细胞的粘附能力显 著高于正常组(P<0.05～P<0.01)；单放组和伤后第3天的复合伤组则反之。③ 分别用 VCAM-1、Fn、Ln和Col Ⅳ单抗处理骨髓基质细胞贴壁层后，骨髓单个核细胞的粘附率较未 加单抗组均有不同程度的下降。结论 骨髓微环境基质细胞粘附功能的损伤可能是影响放射复合伤骨髓造 血功能障碍的原因之一。
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Primary observation on adherent function of bone marrow stroma l cells in mice post combined radiation-burn injury.
CHEN Xinghua,LUO Chengji,GUO Chaohua et al.Affiliated Xinqiao Hospital,Third Military Medical Unive rsity,Chongqing 400037,China.
【Abstract】 Objective To investigate the adherent function of bon e marrow stromal cells in hematopoietic inducive microenvironment post combined radiation-burn injury. Methods The expression of cell adhesion molecules including vascul a r cell adhesion molecule-1(VCAM-1),fibronection(Fn),laminin (Ln) and collagen ty pe IV (Col Ⅳ) on bone marrow stromal cells cultured in vitro was detected b y fl ow cytometry and the binding capacity of bone marrow mononuclear cells to stroma l cell adherence layer was tested by cell binding assay and cell binding blockin g assay respectively from mice treated with 5.0 Gy γ-ray 15% of total body sur face area (TBSA),third-degree burn injury and combined irradiation-burn injur y,respectively. Resul ts 1.The expression levels of molecules mentioned above in burn-injured m ice were the highest.The molecules levels in control mice were greater than thos e in radiation-injured mice,which were lower than those in mice with combined r adiation-burn injury.2.The binding capacity of stromal cell adherence layer in burn-injured mice was greater than that in control mice,and significantly incre ased from 3 to 7 days post injury as compared with that in controls,radiation-i njured mice and combined radiation-burn-injured mice, respectively (P<0. 0 5-0.01).Contrarily,the capacity of binding in the radiation-injured and combin ed radiation-burn-injured mice was the lowest from 3 to 7 days post injury.3.T he binding rate of bone marrow mononuclear cells to stromal cell adherence layer descended in different degrees after pre-treatment with monoclonal antibodies directed to VCAM-1,Fn,Ln,or Col Ⅳ respectively or VCAM-1 combined with a nti-Fn,anti-Ln or anti-Col Ⅳ,respectively,in stromal cell adherence layer. Conclusion The damage of cell adherent function for bone marrow hemat opoietic inducive microenvironment post combined radiation-burn injury might b e one of the important factors in hematopoietic disorder in combined radiation-b urn injury.
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【Key words】 Combined radiation-burn injury Bone marrow St romal cells Cell adherence Mice
为进一步探讨放射复合伤对造血微环境损伤的机理，本文作者观察了5.0 Gy 射线放射损 伤、15%Ⅲ度体表面积烧伤和放射复合伤小鼠骨髓基质细胞表达血管细胞粘附分子(Vascula r cell adhesion molecules-1,VCAM-1)、纤维连接素(Fibronectin,Fn)、层粘素(Laminin ,Ln)和Ⅳ型胶原(Collagen Ⅳ,Col Ⅳ)等成分的变化和放射复合伤小鼠骨髓基质细胞贴壁层 对正常骨髓单个核细胞的粘附能力以及分别或复合应用VCAM-1、Fn、Ln和胶原Ⅳ等单抗 对骨髓基质细胞粘附能力的影响。
材料和方法
1.实验动物与分组：昆明种健康雄性小鼠共210只，体重20～30?g，由本校实验动物中心提供。实验分为4组： ①单纯放射损伤组(简称单放组)：60只小鼠，用本室60Coγ源行一次性全身照射 ，距离1.5 m，照射总吸收剂量5.0?Gy，吸收剂量率0.4019～0.6646 Gy/min。②单纯 烧 伤组(简称单烧组)：45只小鼠，按本室常规方法，致成Ⅲ度烧伤，烧伤体表面积为15%(病理 切片证实)。③放射损伤复合烧伤组(简称复合伤组)：60只小鼠，照射剂量和烧伤面积的方 法同上；照射后30分钟内实施烧伤。④正常对照组(简称正常组)：45只小鼠。
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2.骨髓基质细胞培养：按我们既往报道的方法[1]。
3.流式细胞仪检测：采用间接免疫荧光法，台盼蓝染色判定骨髓基质细胞的成活率为95%以 上。在各样本管中分别加入一抗(VCAM-1,Fn,Ln和Col Ⅳ等单抗)，终浓度分别为20 μg/ml 、20?μg/ml、40?μg/ml和40?μg/ml；阴性对照分别用PBS和小鼠骨髓瘤蛋白IgG1、IgG 2a、IgG2b代替一抗，4℃过夜，离心弃上清，PBS洗3次。分别加1：50工作浓度的FITC标记 的二抗(羊抗鼠IgG，终浓度为10 μg/ml，37℃孵育30分钟，离心弃上清，PBS洗3次，即送 流 式细胞仪(Becton Dickinson公司，FACStar plus型)检测，测定前用戊二醛固定的鸡红细胞 调节仪器，使CV值稳定在4%左右，收集细胞10?000个，由仪器配备的软件LysisⅡ处理后， 计算出各检测指标的阳性细胞百分数。
4.细胞粘附实验和细胞粘附阻断实验[2]：取正常小鼠骨髓单个核细胞(5×106/ml)，用3.7×106 BqNa251CrO4共同孵 育30分钟，用10倍体积pH 7.4的PBS于4℃离心15分钟共3次；用含10%小牛血清的RPMI 1640 培养液重悬细胞，调整细胞浓度为1×106/ml。各损伤组和正常组经培养28天的骨髓基质 细胞贴壁层经弃液，RPMI 1640培养液冲洗，加入1 ml51Cr标记的骨髓单个核细 胞 。37℃孵育3小时，吸出培养液和未粘附的骨髓有核细胞，PBS洗3次；用含0.05%胰酶和0. 5 mmol/L EDTA消化脱落贴壁细胞并用吸管吹打分散细胞，收集粘附细胞悬液，测定其放射 性 (计数.min-1)。计算骨髓有核细胞的粘附率，计算公式如下：
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取正常组和单烧组伤后7天并经培养28天的骨髓基质细胞贴壁层，弃培养液，用RPMI 1640培 养液洗3次，各皿分别加入1 ml抗VCAM-1(20 μg/ml)、Fn(20 μg/ml)、Ln(40 μg/ml)和C ol Ⅳ(40 μg/ml)等单抗或联合加入上述相同浓度的单抗，阴性对照同前所述。37℃孵育30分 钟 后，弃液，再分别加入1 ml51Cr标记的正常鼠骨髓单个核细胞(1×106/ml)，3 7 ℃孵育30分钟，吸出孔内液体，用PBS洗3次，经胰酶消化脱落后测定粘附细胞悬液的放射性 强度(计数.min-1)。计数细胞粘附阻断率，计算公式如下：
5.实验数据的统计学处理：结果以
±s表示，t检验求出P值。, 百拇医药
结 果
1.放射复合伤骨髓基质细胞表达几种粘附分子的变化，见表1。
表1 骨髓基质细胞几种粘附分子表达的阳性细胞百分比 (
±s) 组别动物数
(只)
检 测
指 标
正常组
(45只)
阳性细胞百分比
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伤后1天
伤后2天
伤后3天
伤后7天
伤后14天
伤后28天
单 烧
45
VCAM-1
27.32▲▲△△1.58
24.37±1.45▲
36.48±1.91▲▲△△
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47.28±2.63*▲▲▲
56.22±3.57*▲▲△△
38.71±1.88▲▲△△
29.46±1.76
单 放
60
VCAM-1
27.32±1.58
12.26±0.72**
13.54±0.82**
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8.49±0.56**
8.64±0.52**
14.62±1.08**
20.15±1.62
复合伤
60
VCAM-1
27.32±1.58
19.57±1.26
13.83±0.95**
11.45±0.67**
, 百拇医药
13.56±0.97**
18.48±1.42
23.63±1.38
单 烧
45
Fn
41.26±2.36
38.43±2.18▲▲△△
36.48±2.33▲▲△△
48.28±2.71▲△△
57.33±2.26*▲▲△△
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45.91±2.37▲△△
43.62±2.53▲△△
单 放
60
Fn
41.26±2.36
20.41±1.23**
15.47±1.06**▲
10.82±0.83**▲▲△△
6.54±0.45**▲▲
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19.71±1.18**▲
25.28±1.51*
复合伤
60
Fn
41.26±2.36
18.64±1.22**
25.31±1.67*
32.36±1.78
38.51±2.15
31.26±1.53
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28.58±1.723
单 烧
45
Ln
16.32±1.28
18.63±1.54
22.55±1.83
45.17±2.46**▲▲△△
31.78±2.15**▲▲△△
26.16±1.97*▲▲△△
22.73±1.92
, 百拇医药
单 放
60
Ln
16.32±1.28
12.24±0.92
13.18±1.13
8.62±0.85**
10.27±0.95*
12.59±1.22
14.61±1.46
复合伤
, http://www.100md.com 60
Ln
16.32±1.28
14.28±1.16
17.32±1.35
10.51±1.07*
12.28±1.62
14.67±1.08
15.22±0.72
单 烧
45
Col Ⅳ
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18.63±1.15
22.17±1.78▲▲△△
30.81±2.27**▲▲△△
42.24±2.58**▲▲△△
30.82±2.13**▲▲△△
36.24±2.35**▲▲△△
22.73±1.68
单 放
60
Col Ⅳ
, 百拇医药
18.63±1.15
12.15±1.06
10.35±0.82*
7.28±0.68**
4.31±0.27**△
13.15±0.92
15.61±1.46
复合伤
60
Col Ⅳ
18.63±1.15
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13.33±0.91
12.42±0.75
9.62±0.33**
11.35±0.21*
15.27±0.58
17.28±0.72
注：与正常组比较*P<0.05，**P<0.01；与复合伤 组比较 ▲P<0.05，▲▲P<0.01；单烧组与单放组比较△P<0.05，△△P<0.01
不同组之间骨髓基质细胞VCAM-1表达水平的比较：单烧组>正常组>复合伤组>单放 组。单烧组VCAM-1的表达水平以伤后第7天水平最高，至伤后28天仍高于正常组、相应的 单放组和复合伤组(P<0.05)；单放组和复合伤组在伤后各时相点均低于相应的正常 组 ，且以伤后第3天和第7天最低，以后逐渐回升，至伤后28天仍未达正常组水平；复合伤组各 伤后时相点高于相应的单放组。
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除单烧组伤后第1和第3天骨髓基质细胞表达Fn的水平低于正常组(P>0.05)外，各组骨 髓基质细胞表达Fn、Ln和Col Ⅳ水平的特点和规律与VCAM-1表达的特点和规律相似。
2.骨髓基质细胞贴壁层对正常骨髓单个核细胞粘附能力的影响，见表2。
表2 骨髓单个核细胞对骨髓基质细胞
贴壁层的粘附百分比 (
±s) 组别动物只数
粘附百分比
伤后1天
伤后2天
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伤后3天
伤后7天
伤后14天
伤后2 8天
单烧
45
31.35±
33.71±
39.26±
42. 63±
30.26±
28.76±
1.06
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1.82▲
1.18*▲
1.84#▲
0.75△
0.68
单放
60
16.23±
14.28±
10.53
11.85±
17.27±
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19.61±
0.67#
1.05#
0.57#
0.66#
0.57
0.16
复合伤
60
19.42±
16.86±
11.52±
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15.15±
19.58±
21.26±
1.15
0.56*
0.82#
0.36*
0.57
0.83
注：正常组值为26.56±1.52; 与正常组比较*P<0.05,#P<0.01；与复 合伤组比较△P<0.05，▲P<0.01；单烧组与单放组比较P<0.05，P<0.01
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单烧组于伤后各时相点均高于正常组，以伤后第3天～7天为著((P<0.05～P <0.01) ；单放组则反之；复合伤组伤后各时相点均低于正常组，以伤后第3天为著(P<0.01) ，各组间比较：单烧组>正常组>复合伤组>单放组，复合伤组和单放组间差异无显著性(P>0.05)。
3.粘附分子单克隆抗体对烧伤小鼠骨髓基质细胞贴壁层的粘附阻断作用，见表3。
表3 几种粘附分子单抗对骨髓有核
细胞粘附百分比的影响 (
±s) 组 别正常组
单烧组
未加单抗
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26.56±1.52
42.63±2.62
加Anti-VCAM-1
12.37±1.05**
21.82±1.27**
加Anti-Fn
20.42±1.33
27.51±1.61*
加Anti-Ln
24.18±1.52
37.35±2.06
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加Anti-Col Ⅳ
23.71±1.27
35.58±1.83
加Anti-VCAM-1+Anti-Fn
10.15±0.93**
18.18±1.26**
加Anti-VCAM-1+Anti-Ln
10.83±1.05**
19.21±1.23**
加Anti-VCAM-1+Anti-Col Ⅳ
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11.35±1.16**
19.87±1.51 **
注：与未加单抗组比较*P<0.05，**P<0.01
正常组经培养28天的骨髓基质细胞层分别用VCAM-1、Fn、Ln和Col Ⅳ单抗处理后，骨 髓单个核细胞的粘附率较未加单抗组分别下降了53.43%、23.12%、8.97%和12.76%；VCA M-1单抗分别复合Fn、Ln和Col Ⅳ单抗处理后，骨髓单个核细胞的粘附率较未加单抗组分别 下降了61.7%、59.22%和57.27%；对单烧伤组伤后7天培养28天的骨髓基质细胞分别用VCA M-1、Fn、Ln和Col Ⅳ单抗处 理后，骨髓单个核细胞的粘附率较未加单抗组分别下降了48. 51%、35.09%、11.87%和16.05%；VCAM-1单抗分别复合Fn、Ln和Col Ⅳ单抗处理后，骨 髓单个核细胞的粘附率较未加单抗组分别下降了57.10%、54.67%和53.11%。
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讨 论
细胞粘附分子(Cell adhesion molecules,CAMs)是介导造血干、祖细胞特异的回髓定位以及 造血细胞和基质细胞密切接触和相互粘附作用的分子学基础，其种类繁多，功能相当复杂 [2]。整合素(Integrins)是广泛表达于造血实质细胞表面糖蛋白分子的粘附受体超家族 分子[3]。最迟出现抗原4(very late artigen-4,VLA-4)是Integrin β1亚家族 的成员之一，它和VLA亚家族的其他成员一样，具有与一种以上的配体结合的能力。骨髓基 质细胞除能够产生多种造血生长因子外，同时还具有各种细胞因子的受体，能结合和聚集外 来的因子于局部，形成不同细胞因子的不同浓度分布区[4]。此外，骨髓基质具有 广阔的胞浆和ECM，后者含Fibronectin、Laminin和Collagen Ⅳ，都与造血细胞的粘附有关 [5]。由基质细胞产生和分泌的ECM，通过氨基葡聚糖(glycos aminoglycans,AGA) 分子的残端及其粘附位点形成包裹造血细胞和基质细胞的网状结构[6]。ECM中的硫 酸类肝素(heparanulfate)能选择性地结合一些造血生长因子如IL-3、GM-CSF等，间接地 把带有相应受体的造血干细胞和祖细胞粘附于骨髓基质[7]。VCAM-1分子最初由美 国学者Harlan于1985年从人的脐带血管内皮细胞上发现的，这种分子在细胞与细胞间相互识 别和粘附的过程中发挥着重要的作用[8]。Dittel等[9]对28名经放射疗法 和 化疗药物预处理后接受骨髓移植的患者进行了研究，结果表明，骨髓移植后21～28天，患者 骨髓基质细胞VCAM-1表达水平以及骨髓基质细胞层支持造血祖细胞生长的能力均低于正常 对照组。郭琳琅等[10]观察了培养的人肺巨细胞癌和肺腺癌体外移动性的改变，结 果表明，加入外源性Fn和Ln后，两株癌细胞的移动性均增强。关于放射复合伤造血功能障碍 的造血调控的机理研究，以往主要侧重于对造血实质细胞损伤的观察，而对造血实质细胞赖 以生存的造血微环境在放射复合伤造血障碍中的作用及其机理的研究尚缺乏进一步的观察。 本实验的结果表明，从不同的损伤组、伤后不同时间的骨髓基质细胞表达VCAM-1、Fn、Ln 和Col Ⅳ等成分变化具有以单烧组>正常组>复合伤组>单放组的特点以及单烧组具有以伤 后3天和7天最高，单放组和复合伤组以伤后3天和伤后7天最低的时效特征。提示无论是单伤 或复合伤均可影响基质细胞的粘附功能。
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我们曾观察到，在相同损伤条件下和同一规格的培养皿中，单放组和复合伤组的骨髓基质细 胞集落形成能力(CFU-F)均以伤后第3、7天最低，至伤后第28天仍未达正常组水平(P < 0.01)；单烧伤组除伤后第3天低于正常组外(P<0.05)，至伤后第7天与正常组差异无显著性 。正常组和伤后不同时相点的单烧组，均在培养28天时形成长满培养皿底的基质细胞层 ；单放组在伤后28天并经培养第28天时仍未长满培养皿底[1]。为探讨放射复合伤 对骨髓基质细胞粘附功能的影响，本文作者采用细胞粘附试验的方法，检测了骨髓单个核细 胞对各损伤组骨髓基质细胞贴壁层的粘附百分率。结果表明，单烧组骨髓基质细胞的粘附能 力以伤后第3～7天最强；单放组则反之；复合伤组伤后各时相点均低于正常组，且以伤后第 3天为著(P<0.01)。提示伤后骨髓基质细胞集落生成能力的大小与其粘附能力的强弱 有关。然而，单烧组骨髓基质细胞集落生成能力于伤后第3天低于正常组(P<0.05)， 为何具有较强的粘附能力以及放射复合伤组骨髓基质细胞的粘附能力的减弱并非出现两单伤 之合的加重效应，提示烧伤因素可能具有刺激骨髓基质细胞粘附分子表达的作用，其机理有 待进一步研究。
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基于正常组和伤后不同时相点的单烧组的骨髓基质细胞在同一规格的培养皿中，均在培养28 天时形成长满培养皿底的基质细胞层以及单烧组骨髓基质细胞表达VCAM-1、Fn、Ln和Col Ⅳ等的水平以伤后第3～7天最高的特点，故本试验以正常组和单烧组伤后7天并经体外培 养28天的骨髓基质细胞贴壁层为观察时相点，采用细胞粘附阻断试验的方法，进一步验证VC AM-1、FN、Ln和Col Ⅳ等单抗对骨髓基质细胞粘附功能的影响。无论是骨髓单个核细胞对 伤后基质细胞粘附率，还是应用相应的单抗处理后对骨髓单个核细胞粘附的阻断率方面，均 显示出VCAM-1、Fn对基质细胞的粘附作用最大，Ln和Col Ⅳ的作用较小，采用VCAM-1、 Fn 、Ln和Col Ⅳ等单抗单独或联合作用后，不能完全阻断骨髓单个核细胞的粘附，说明造血实 质细胞表达的粘附分子配体也具有重要作用；此外参与造血细胞和基质细胞间的粘附分子种 类繁多，基质细胞分泌和产生的ECM分子也多种多样，这些分子在调节细胞粘附的过程中都 可能起着某些作用。Simmons等[11]采用抗Integrin α4 β1抗体163H.1R1处理 CD34+细胞或用抗VCAM-1抗体6G10处理基质细胞都能使CD34+细胞和骨髓基 质 细胞之间的粘附率减少3倍以上，本实验虽没有对造血干、祖细胞粘附分子的表达进行研究 ，也未观察到抗VCAM-1单抗的粘附阻断作用达到上述文献所报道的水平。本实验的初步结 果提示，骨髓微环境基质细胞粘附功能的损伤可能是影响放射复合伤造血功能障碍的原因 之一 ，有助于对放射复合伤造血障碍发生机理的认识。由于参与造血细胞和基质细胞间的粘附分 子种类繁多，基质细胞分泌和产生的ECM分子也多种多样，这些分子在放射复合伤造血调控 中的作用尚需进一步探讨。
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致谢：本课题得到程天民院士和粟永萍教授的指教，特此感谢
本课题受全军“八五”攻关基金资助
参考文献
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(收稿:1998-01-19 修回1998-04-06), 百拇医药