照射后不同p53基因状态胃癌细胞的G1期阻滞和凋亡
作者：张珊文 肖卫群 吕有勇
单位：张珊文、肖卫群 100036，北京医科大学临床肿瘤学院放疗科；吕有勇 北京市肿瘤分子生物学实验室
关键词：抑癌基因p53；凋亡；辐射
中华放射医学与防护杂志/990510 【摘要】 目的 评价抑癌基因p53(野生型p53)对照射后人胃癌细胞系(BGC-823)的G1期阻滞和凋亡的控制作用。方法 3种具有不同p53状态的人胃癌细胞系，即转染人野生型p53基因的BGC-823-wtp53细胞、转染人突变型p53基因的BGC-823-mutp53细胞和转染无p53基因的空载质粒的BGC-823-vect细胞，用流式细胞计分析细胞，4Gy照射后0、8和24小时后各细胞时相分布和凋亡的反应。结果 照射4Gy后8小时和24小时后的BGC-823-wtp53细胞出现强烈的G1期阻滞(分别占原细胞总数的67.9%和61.1%)，而BGC-823-mutp53、BGC-823-vect细胞几乎没有G1期阻滞；照射4Gy后8小时和24小时后的BGC-823-wtp53细胞出现明显的预示凋亡的亚G1峰，凋亡细胞比例分别达13.0%和15.3%；而BGC-823-mutp53和BGC-823-vect细胞几乎没有出现亚G1峰和凋亡细胞比例都为零。结论 野生型p53基因具有促进照射后肿瘤细胞的G1期阻滞和凋亡作用，而p53变异和缺失则减低了肿瘤细胞对放射线的反应。
, 百拇医药
G1 arrest and apoptosis of BGC-823 cell lines with different p53 status after irradiation
ZHANG Shanwen,XIAO Weiqun， LU Youyong.
Dept.of Radiotherapy,The School of Oncology,Beijing Medical University,Beijing 10036,China
【Abstract】 Objective To assess the role of the p53 tumor suppressor gene(wild-type p53) in G1 arrest and apoptosis after irradiation in human gastric carcinoma 823 cell lines(BGC823). Methods Three human gastric carcinoma 823 cell lines with different p53 status,i.e.BGC823-wtp53 cells with wild-type p53,BGC823-mutp53 cell with mutant p53 alleles and BGC823-vect without p53 gene,were used.Various cell phase distribution and apoptosis were analyzed by flow cytometry in 0,8 and 24h following irradiation with 4Gy. Results The BGC823-wtp53 cells had strong arrest in G1 phase at 8 and 24h following radiation with 4Gy (67.9% and 61.1% of original population,respectively),while the BGC823-mutp53 and BGC823-vect cells had almost no arrest in G1 phase at 8 and 24h following radiation with 4Gy.In the BGC823-wtp53 cells,a sub-G1 phase peak of apoptosis could be observed at 8 and 24h after irradiation with 4Gy,apoptotic cell rates being 13.0% and 15.3%,respectively,while the BGC823-mutp53 and BGC823-vect cells had no apoptotic response after irradiation with 4Gy. Conclusion Wild-type p53 genes promote G1 phase arrest and apoptosis of tumor cells following irradiation,while those with mutant or vect p53 genes abrogate this response to irradiation.
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【Key words】 Tumor suppressor gene p53 Apoptosis Irradiation
癌基因和抑癌基因在放射线引起的肿瘤细胞周期G1期阻滞和凋亡效应中起重要的调控作用。野生型抑癌基因p53参与放射线引起的细胞G1期阻滞和凋亡，它可使DNA受损的细胞增殖周期阻断在G1期以进行DNA修复，或启动细胞凋亡程序清除受损细胞。以往报道运用流式细胞计(FCM)，测定DNA的含量，显示各细胞时相分布和凋亡。在DNA直方图上，G1峰的左侧出现亚二倍体细胞群的峰型，这种Sub-G1峰的出现提示凋亡的存在[3，6，7]。p53状态与细胞周期的阻滞、凋亡和细胞放射敏感性关系的研究，为肿瘤放疗寻找新的靶点，提高放射治疗疗效提供新的途径。作者分析了照射后3种不同p53基因状态的人胃癌823细胞系的细胞周期变化和凋亡，为下一步展开野生型p53基因提高放射敏感性的研究提供可靠的依据。
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材料和方法
1.细胞系：通过脂质体介导将构建有野生型p53基因、突变型p53基因及无p53的空载质粒转染于有p53基因缺陷的人胃癌BGC823细胞中，其中转染人野生型p53为BGC823-wtp53细胞(简称wtp53细胞)，转染突变型p53为BGC823-mutp53细胞(简称mutp53细胞)，转染无p53空载质粒为BGC823-vect细胞(简称vectp53细胞)。实验证实了wtp53细胞的生长速度及集落形成率都明显低于后两种细胞，致瘤性也弱于后两种细胞[5]。
2.培养基：细胞培养在DNEM(GIB Co)培养基中，该培养基含有10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和50 U/ml链霉素并置于含5%CO2空气的37℃恒温的CO2孵育箱中。
3.流式细胞分析：接种106细胞于35 mm培养皿中，置于CO2孵育箱中，翌日用60Coγ射线照射细胞，吸收剂量4Gy，假照射细胞组作为对照组。细胞照射4 Gy后在CO2孵育箱中分别放置0、8、24小时后收获细胞，PBS洗2遍，离心和再悬液成106/ml，75% ethanol(5ml)固定，于4℃下过夜，冰PBS洗2遍后，37℃ Rnase 100U/ml处理1小时，Propidium iodide 50U/ml染DNA。使用Coulter-profilo Ⅱ(Coulter Co)型流式细胞计，测定细胞DNA含量，计算机绘制细胞周期分布的直方图，在G0/G1峰前出现独特的亚二倍体细胞群的Sub-G1峰被确定为特异的伴DNA降解的凋亡细胞。对照组和照射组照射后置于CO2孵育箱中不同时间点收获细胞的每一次实验都是2个培养皿，并重复实验2次以上。
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结果
对照组和4 Gy剂量照射后0小时3种细胞周期分布和凋亡的直方图显示：3种细胞的G0/G1、S和G2/M期峰相似，G0/G1峰前都没有出现Sub-G1峰。如图1显示：0 Gy剂量照射后8小时后3种细胞周期分布和凋亡的直方图，可以看出A、C、E图显示3种细胞G0/G1、S和G2/M期峰相似，G0/G1峰前都没有出现Sub-G1峰。B、D、F图为3种细胞4 Gy照射8小时后各时相的直方图，只有B图显示wtp53细胞G0/G1期峰明显变化和在G0/G1峰前出现Sub-G1峰提示凋亡细胞存在，而其他两种细胞G0/G1、S和G2/M期峰无明显变化，G0/G1峰前都没有出现Sub-G1峰。4 Gy剂量照射后24小时后3种细胞时相分布和凋亡的直方图也和图1结果一样，只显示wtp53细胞G0/G1期峰明显变化和在G0/G1峰前出现Sub-G1峰提示凋亡细胞存在。
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图1 3种不同p53状态胃癌823细胞
0 Gy和4 Gyγ射线照射后流式细胞分析图
对照组和4 Gy剂量照射后0、8、24小时后各细胞时相分布比例和凋亡细胞比例的结果表明，3种细胞对照组，G0/G1、S、G2/M细胞各时相分布比例无明显差异，凋亡细胞比例都为零。4 Gy照射后0小时也和对照组一样，细胞各时相分布比例无明显变化和差异，凋亡细胞比例都为零。仅有wtp53细胞在4 Gy剂量照射后8、24小时后细胞各时相比例出现明显变化，表现在G2/M期比例期明显减少(P<0.05)，G1期比例明显增加(P<0.05)，分别占原细胞总数的67.9%和61.1%，比其他两种p53异常细胞明显增加(P<0.05)；并出现明显的凋亡，凋亡细胞比例分别达13.0%和15.3%；而其他两种细胞在同样的条件下G1期比例无明显变化，凋亡细胞比例都为零。
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讨论
细胞受照射后，可诱导或抑制一些基因和蛋白的产生，细胞受射线损伤的同时伴以产生一系列包括DNA损伤修复在内的基因。放射线引起细胞的反应表现在细胞周期G1期阻滞和细胞凋亡效应上。野生型抑癌基因p53(正常p53基因)参与放射线引起的细胞G1期阻滞和凋亡，它可使DNA受损的细胞增殖周期阻断在G1期以进行DNA修复，或启动细胞凋亡程序清除受损细胞。如果p53基因缺失或突变将会减弱甚至破坏这些放射效应[1-4]。本实验的结果证明具有正常p53功能的wtp53细胞在4 Gy剂量照射后8和24小时后出现明显的G1期阻滞(分别占原细胞总数的67.9%和61.1%)和细胞凋亡(分别达13.0%和15.3%)。而p53基因突变或缺失的mutp53细胞或vectp53细胞在同样的条件下G1期比例无明显变化，凋亡细胞比例都为零。本文的结果与国外学者的研究结果相同[2-4，6]。本研究结果充分说明正常p53明显促进放射引起的细胞G1期阻滞和凋亡效应，p53功能缺失或突变将会减弱甚至破坏这些放射效应。p53基因缺失和突变几乎存在于所有恶性肿瘤中，各种恶性肿瘤的p53异常频率约为50%左右。这是恶性肿瘤对放射性治疗反应性降低和放疗后局部复发率高并导致远处转移的内在原因之一。本结果为进一步研究将野生型p53导入有p53缺陷的肿瘤细胞中提高放射敏感性的研究，提供了可靠的依据。
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本课题受九五规划，国家自然科学基金课题资助(项目号：39670234)
参考文献
1 Ling CC,Endlich.B.Radioresistance induced by oncogenic transformation.Radiat Res,1989,120:267-279.
2 Lowe SW,Bodis S,McClatchey A,et al.p53 status and the efficacy of cancer therapy in vivo.Science,1994,266:807-810.
3 O'Connor PM,Jackman J,Joniel D,et al.Role of the p53 tumor suppressor gene in cell cycle arrest and radiosensitivity of Burkitt's lymphoma cell lines.Cancer Res,1993,53:4776-4780.
, 百拇医药
4 Mcllwrath AJ, Vasey PA,Ross GM,et al.Cell cycle arrests and radiosensi tivity of human tumor cell lines:dependence on wild-type p53 for radiosensitivity.Cancer Res,1994,54:3718-3722.
5 孙梅，吕有勇.外源性p53基因对人胃癌细胞恶性增殖的影响.科学通报，1996，41：825-828.
6 Zhen W Denault CM,Loviscek K,et al.The relative radiosensitivity of TK6 and WI-L2-NS lymphoblastoid cells derived from a common source is primarily determined by their p53 mutational status.Mutat Res,1995,346:85-92.
7 Sun Hong,Wang Yongchao.Apoptosis of human leukemic HL-60 cells induced to differentiate by treatment with RA of DMSO.Cell Res,1995,5:181-186.
(收稿:1998-06-07 修回1998-11-22), http://www.100md.com
单位：张珊文、肖卫群 100036，北京医科大学临床肿瘤学院放疗科；吕有勇 北京市肿瘤分子生物学实验室
关键词：抑癌基因p53；凋亡；辐射
中华放射医学与防护杂志/990510 【摘要】 目的 评价抑癌基因p53(野生型p53)对照射后人胃癌细胞系(BGC-823)的G1期阻滞和凋亡的控制作用。方法 3种具有不同p53状态的人胃癌细胞系，即转染人野生型p53基因的BGC-823-wtp53细胞、转染人突变型p53基因的BGC-823-mutp53细胞和转染无p53基因的空载质粒的BGC-823-vect细胞，用流式细胞计分析细胞，4Gy照射后0、8和24小时后各细胞时相分布和凋亡的反应。结果 照射4Gy后8小时和24小时后的BGC-823-wtp53细胞出现强烈的G1期阻滞(分别占原细胞总数的67.9%和61.1%)，而BGC-823-mutp53、BGC-823-vect细胞几乎没有G1期阻滞；照射4Gy后8小时和24小时后的BGC-823-wtp53细胞出现明显的预示凋亡的亚G1峰，凋亡细胞比例分别达13.0%和15.3%；而BGC-823-mutp53和BGC-823-vect细胞几乎没有出现亚G1峰和凋亡细胞比例都为零。结论 野生型p53基因具有促进照射后肿瘤细胞的G1期阻滞和凋亡作用，而p53变异和缺失则减低了肿瘤细胞对放射线的反应。
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G1 arrest and apoptosis of BGC-823 cell lines with different p53 status after irradiation
ZHANG Shanwen,XIAO Weiqun， LU Youyong.
Dept.of Radiotherapy,The School of Oncology,Beijing Medical University,Beijing 10036,China
【Abstract】 Objective To assess the role of the p53 tumor suppressor gene(wild-type p53) in G1 arrest and apoptosis after irradiation in human gastric carcinoma 823 cell lines(BGC823). Methods Three human gastric carcinoma 823 cell lines with different p53 status,i.e.BGC823-wtp53 cells with wild-type p53,BGC823-mutp53 cell with mutant p53 alleles and BGC823-vect without p53 gene,were used.Various cell phase distribution and apoptosis were analyzed by flow cytometry in 0,8 and 24h following irradiation with 4Gy. Results The BGC823-wtp53 cells had strong arrest in G1 phase at 8 and 24h following radiation with 4Gy (67.9% and 61.1% of original population,respectively),while the BGC823-mutp53 and BGC823-vect cells had almost no arrest in G1 phase at 8 and 24h following radiation with 4Gy.In the BGC823-wtp53 cells,a sub-G1 phase peak of apoptosis could be observed at 8 and 24h after irradiation with 4Gy,apoptotic cell rates being 13.0% and 15.3%,respectively,while the BGC823-mutp53 and BGC823-vect cells had no apoptotic response after irradiation with 4Gy. Conclusion Wild-type p53 genes promote G1 phase arrest and apoptosis of tumor cells following irradiation,while those with mutant or vect p53 genes abrogate this response to irradiation.
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【Key words】 Tumor suppressor gene p53 Apoptosis Irradiation
癌基因和抑癌基因在放射线引起的肿瘤细胞周期G1期阻滞和凋亡效应中起重要的调控作用。野生型抑癌基因p53参与放射线引起的细胞G1期阻滞和凋亡，它可使DNA受损的细胞增殖周期阻断在G1期以进行DNA修复，或启动细胞凋亡程序清除受损细胞。以往报道运用流式细胞计(FCM)，测定DNA的含量，显示各细胞时相分布和凋亡。在DNA直方图上，G1峰的左侧出现亚二倍体细胞群的峰型，这种Sub-G1峰的出现提示凋亡的存在[3，6，7]。p53状态与细胞周期的阻滞、凋亡和细胞放射敏感性关系的研究，为肿瘤放疗寻找新的靶点，提高放射治疗疗效提供新的途径。作者分析了照射后3种不同p53基因状态的人胃癌823细胞系的细胞周期变化和凋亡，为下一步展开野生型p53基因提高放射敏感性的研究提供可靠的依据。
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材料和方法
1.细胞系：通过脂质体介导将构建有野生型p53基因、突变型p53基因及无p53的空载质粒转染于有p53基因缺陷的人胃癌BGC823细胞中，其中转染人野生型p53为BGC823-wtp53细胞(简称wtp53细胞)，转染突变型p53为BGC823-mutp53细胞(简称mutp53细胞)，转染无p53空载质粒为BGC823-vect细胞(简称vectp53细胞)。实验证实了wtp53细胞的生长速度及集落形成率都明显低于后两种细胞，致瘤性也弱于后两种细胞[5]。
2.培养基：细胞培养在DNEM(GIB Co)培养基中，该培养基含有10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和50 U/ml链霉素并置于含5%CO2空气的37℃恒温的CO2孵育箱中。
3.流式细胞分析：接种106细胞于35 mm培养皿中，置于CO2孵育箱中，翌日用60Coγ射线照射细胞，吸收剂量4Gy，假照射细胞组作为对照组。细胞照射4 Gy后在CO2孵育箱中分别放置0、8、24小时后收获细胞，PBS洗2遍，离心和再悬液成106/ml，75% ethanol(5ml)固定，于4℃下过夜，冰PBS洗2遍后，37℃ Rnase 100U/ml处理1小时，Propidium iodide 50U/ml染DNA。使用Coulter-profilo Ⅱ(Coulter Co)型流式细胞计，测定细胞DNA含量，计算机绘制细胞周期分布的直方图，在G0/G1峰前出现独特的亚二倍体细胞群的Sub-G1峰被确定为特异的伴DNA降解的凋亡细胞。对照组和照射组照射后置于CO2孵育箱中不同时间点收获细胞的每一次实验都是2个培养皿，并重复实验2次以上。
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结果
对照组和4 Gy剂量照射后0小时3种细胞周期分布和凋亡的直方图显示：3种细胞的G0/G1、S和G2/M期峰相似，G0/G1峰前都没有出现Sub-G1峰。如图1显示：0 Gy剂量照射后8小时后3种细胞周期分布和凋亡的直方图，可以看出A、C、E图显示3种细胞G0/G1、S和G2/M期峰相似，G0/G1峰前都没有出现Sub-G1峰。B、D、F图为3种细胞4 Gy照射8小时后各时相的直方图，只有B图显示wtp53细胞G0/G1期峰明显变化和在G0/G1峰前出现Sub-G1峰提示凋亡细胞存在，而其他两种细胞G0/G1、S和G2/M期峰无明显变化，G0/G1峰前都没有出现Sub-G1峰。4 Gy剂量照射后24小时后3种细胞时相分布和凋亡的直方图也和图1结果一样，只显示wtp53细胞G0/G1期峰明显变化和在G0/G1峰前出现Sub-G1峰提示凋亡细胞存在。
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图1 3种不同p53状态胃癌823细胞
0 Gy和4 Gyγ射线照射后流式细胞分析图
对照组和4 Gy剂量照射后0、8、24小时后各细胞时相分布比例和凋亡细胞比例的结果表明，3种细胞对照组，G0/G1、S、G2/M细胞各时相分布比例无明显差异，凋亡细胞比例都为零。4 Gy照射后0小时也和对照组一样，细胞各时相分布比例无明显变化和差异，凋亡细胞比例都为零。仅有wtp53细胞在4 Gy剂量照射后8、24小时后细胞各时相比例出现明显变化，表现在G2/M期比例期明显减少(P<0.05)，G1期比例明显增加(P<0.05)，分别占原细胞总数的67.9%和61.1%，比其他两种p53异常细胞明显增加(P<0.05)；并出现明显的凋亡，凋亡细胞比例分别达13.0%和15.3%；而其他两种细胞在同样的条件下G1期比例无明显变化，凋亡细胞比例都为零。
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讨论
细胞受照射后，可诱导或抑制一些基因和蛋白的产生，细胞受射线损伤的同时伴以产生一系列包括DNA损伤修复在内的基因。放射线引起细胞的反应表现在细胞周期G1期阻滞和细胞凋亡效应上。野生型抑癌基因p53(正常p53基因)参与放射线引起的细胞G1期阻滞和凋亡，它可使DNA受损的细胞增殖周期阻断在G1期以进行DNA修复，或启动细胞凋亡程序清除受损细胞。如果p53基因缺失或突变将会减弱甚至破坏这些放射效应[1-4]。本实验的结果证明具有正常p53功能的wtp53细胞在4 Gy剂量照射后8和24小时后出现明显的G1期阻滞(分别占原细胞总数的67.9%和61.1%)和细胞凋亡(分别达13.0%和15.3%)。而p53基因突变或缺失的mutp53细胞或vectp53细胞在同样的条件下G1期比例无明显变化，凋亡细胞比例都为零。本文的结果与国外学者的研究结果相同[2-4，6]。本研究结果充分说明正常p53明显促进放射引起的细胞G1期阻滞和凋亡效应，p53功能缺失或突变将会减弱甚至破坏这些放射效应。p53基因缺失和突变几乎存在于所有恶性肿瘤中，各种恶性肿瘤的p53异常频率约为50%左右。这是恶性肿瘤对放射性治疗反应性降低和放疗后局部复发率高并导致远处转移的内在原因之一。本结果为进一步研究将野生型p53导入有p53缺陷的肿瘤细胞中提高放射敏感性的研究，提供了可靠的依据。
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本课题受九五规划，国家自然科学基金课题资助(项目号：39670234)
参考文献
1 Ling CC,Endlich.B.Radioresistance induced by oncogenic transformation.Radiat Res,1989,120:267-279.
2 Lowe SW,Bodis S,McClatchey A,et al.p53 status and the efficacy of cancer therapy in vivo.Science,1994,266:807-810.
3 O'Connor PM,Jackman J,Joniel D,et al.Role of the p53 tumor suppressor gene in cell cycle arrest and radiosensitivity of Burkitt's lymphoma cell lines.Cancer Res,1993,53:4776-4780.
, 百拇医药
4 Mcllwrath AJ, Vasey PA,Ross GM,et al.Cell cycle arrests and radiosensi tivity of human tumor cell lines:dependence on wild-type p53 for radiosensitivity.Cancer Res,1994,54:3718-3722.
5 孙梅，吕有勇.外源性p53基因对人胃癌细胞恶性增殖的影响.科学通报，1996，41：825-828.
6 Zhen W Denault CM,Loviscek K,et al.The relative radiosensitivity of TK6 and WI-L2-NS lymphoblastoid cells derived from a common source is primarily determined by their p53 mutational status.Mutat Res,1995,346:85-92.
7 Sun Hong,Wang Yongchao.Apoptosis of human leukemic HL-60 cells induced to differentiate by treatment with RA of DMSO.Cell Res,1995,5:181-186.
(收稿:1998-06-07 修回1998-11-22), http://www.100md.com