高LET辐射致细胞恶性转化相关基因的克隆
作者：李刚 吴德昌 胡迎春 赵永良
单位：北京放射医学研究所 100850
关键词：α粒子；mRNA差异显示；细胞恶性转化；肿瘤相关基因
中华放射医学与防护杂志000105 【摘要】 目的 克隆α粒子辐射致细胞恶性转化相关基因。方法 采用mRNA差异显示技术识别原代大鼠气管上皮细胞同α粒子辐射诱发恶转的大鼠气管上皮细胞之间的差异表达基因。结果 共克隆到15个可能同α粒子辐射致细胞恶性转化相关的差异表达基因片段(ESTs)，共向GenBank登录7条新基因序列。其中克隆ZG 35同大鼠Annexin Ⅰ基因高度同源，Annexin Ⅰ作为表皮生长因子受体激酶的底物被认为可能参与细胞增殖信号的转导；克隆ZC 52同大鼠羧酸酯酶前体物基因高度同源；克隆ZA 73为新基因片段；克隆ZC 66同肿瘤转移抑制基因 nm 23高度同源，序列分析提示nm 23在此恶转细胞中存在突变；以克隆ZG 52为探针，通过筛选cDNA文库，克隆到一个长约3.36 kb的新基因，序列同源性分析提示该基因可能为一个同SR蛋白激酶Ⅱ相关的新型激酶基因，其可能的功能为参与前mRNA剪切加工的调控。Northern杂交证实了上述基因片段在恶转的大鼠气管上皮细胞中高表达。结论 上述结果为进一步深入研究辐射致癌、克隆辐射致癌相关基因提供了线索，并提示Annexin Ⅰ、nm 23、羧酸酯酶前体物基因、ZG 52等可能参与α粒子辐射诱发大鼠气管上皮细胞恶性转化的过程。
, 百拇医药
Cloning of genes involved in neoplastic transformation
induced by high-LET radiation
LI Gang WU Dechang HU Yingchun,et al.
(Institute of Radiation Medicine,Beijing 100850,China)
【Abstract】 Objective To clone genes involved in neoplastic transformation induced by α-particles. Methods Differential display technique was used to identify differentially exprssed RNA species between primary and neoplastic transformed rat tracheal epithelial(RTE) cells. Results Fifteen differentially displayed gene fragments were cloned and sequenced.Among them seven novel gene sequences were submitted to GenBank.Homology searching revealed that Clone ZG 35 was highly homologous to rat Annexin Ⅰ gene which has been thought to be involved in mitogenic signal transduction as a substrate of EGF receptor kinase, Clone ZC 52 was nearly identical to a novel rattus norvegicus gene for carboxylestrase precursor, and Clone ZC 66 was highly homologous to rat NDPK gene or metastasis suppressor gene nm23. Sequence analysis suggested that nm23 may be mutated in the transformed RTE cells.and Clone ZA73 was a novel gene fragment.Screening a rat cDNA library using the novel gene Clone ZG52 (Accession number:AF007838) as probe permitted the cloning of a 3.36-kb gene.Sequence analysis and homology searching indicated that the gene contained a unique 1409-bp 5'sequence and a 3' sequence showing high homology toward SRPK2,suggesting that it might be a novel SRPK2-related gene involved in pre-mRNA splicing.Northern hybridization confirmed that the above gene or gene fragments were up-regulated in the transformed RTE cells. Conclusion These results provide clues to elucidate the mechanisms of radiation oncogenesis and suggest that Annexin Ⅰ,nm23,and carboxylesterase precursor gene might be involved in the neoplastic transformation induced by α-partcle radiation.
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【Key words】 Alpha particles; mRNA differential display; Neoplastic transformation; Tumor related gene▲
研究表明体外细胞恶性转化的机理同体内致癌过程的机理类似，体外细胞恶性转化可比较精确而全面的重演体内致癌过程，可为研究致癌机理提供重要的实验模型。为对高LET辐射致癌机理进行研究，本实验室先后建立了6种α粒子辐射诱发的体外细胞恶性转化模型，包括：大鼠胚肺纤维母细胞、叙利亚地鼠胚胎细胞(SHE细胞)、大鼠气管上皮细胞、SV40转染的人胚肺纤维母细胞、SV40转染的人支气管上皮细胞(HBEM细胞)、HPV18转染的人支气管上皮细胞(BEP2D细胞)等。得到公认的是辐射可导致基因突变或染色体畸变，进而启动或推进细胞恶性转化，细胞恶性转化主要是基因突变、基因表达改变累积的结果[1]，因此阐明辐射致细胞恶性转化的机理需从基因水平进行研究。已有的研究局限于观察为数不多的已知重要癌基因、抑癌基因如：p53、c-myc、H，K，H-ras、Rb、端粒酶等基因在各种模型中的表达及突变状况，具有片面性，因为不可能通过观察数个基因的状况而理解细胞恶性转化的整个过程，而且辐射致癌或致细胞恶性转化本身存在相当的复杂性与异质性。因此许多学者意识到要阐明其机理需要从整体的角度，全面识别正常细胞同相应恶转细胞之间的差异表达基因，寻找未知的参与细胞恶性转化过程的基因。这在数年前只是一种理想，但目前随着分子遗传学技术的快速进展，尤其是在人类基因组计划的带动下，规模性识别不同功能状态细胞之间的差异表达基因在技术上成为可能，可供选择的方法有：ESTs图谱、代表性差异分析(RDA)、基因表达系列分析(SAGE)、基因芯片、mRNA差异显示等[2]。在各种识别差异表达基因的方法中，mRNA差异显示技术的应用较为广泛。在本实验室已建立的α粒子诱导的大鼠气管上皮细胞(RTE)体外恶性转化模型的基础上，本项研究选择mRNA差异显示技术比较该转化细胞同相应的原代细胞在基因表达方面的差异，克隆α粒子辐射致细胞恶性转化相关基因。
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材料和方法
1.细胞模型：按Gray等的方法分离、培养原代大鼠气管上皮细胞[3]。经239Pu α粒子放射源照射后恶转的RTE细胞系是由赵永良博士建立的，具有裸鼠致瘤性[4]。在含体积分数5%的小牛血清，5 μg/ml的胰岛素，0.3 μmol/L的氢化可的松的F12培养基中培养。
2.差异显示：差显引物购自GenHunter公司。采用Trizol试剂(Gibicol公司)提取总RNA。差异显示按Liang等人报道的方法[5]，略加改进，简述如下：mRNA的反转录：反应总体积50 μl，其中5×RT缓冲液10 μl,dNTP(250 μmol/L)4 μl，DTT(0.1 mol/L)5 μl，总RNA(2 μg/μl) 2 μl,锚定引物H-T11M(M可为A、C或G，2 μmol/L) 10 μl，dH2O 15 μl,混匀，65℃ 5 min,37℃ 10 min，然后加入MMLV反转录酶4 μl(200 U/μl)，37℃反应60 min，75℃ 5 min终止反应。PCR反应：dH2O 8.7 μl,10×PCR缓冲液2 μl,MgCl2(25 mmol/L) 1.2 μl,dNTP(25 μmol/L) 1.6 μl,随机引物(H-AP1-8，2 μmol/L)2 μl，锚定引物H-T11M(2 μmol/L)2 μl,反转录产物2 μl，α-[32P]dCTP(3.7×105Bq/μl)0.3 μl, AmpliTaq(5 U/μl) 0.2 μl，PCR反应条件：94℃ 30 s,40℃ 2 min,72℃ 30s,40个循环，72℃延长5 min。6%的聚丙烯酰氨凝胶电泳分离扩增产物，-80℃ X射线片曝光12～24 h。切下差异表达条带，煮沸法、醋酸钠/乙醇沉淀回收聚丙烯凝胶中的DNA[3]。PCR重扩增体系50 μl，除dNTP浓度增至250 μmol/L和不加同位素外，其他条件同前。使用TA载体系统(PCRTM2.1载体，Invitrogen公司)克隆重扩增产物。
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3.Northern杂交：按文献报道的方法[6]进行Northern杂交，1.2%甲醛变性胶电泳分离总RNA，真空转移法把RNA转移至尼龙膜上，随机引物法标记(prime-a-genelabelling,Promega)酶切后回收的差异表达基因片段作为探针进行杂交。
4.cDNA文库的筛选：构建于Uni-ZAPTMXR载体的大鼠脑cDNA文库购自于Stratagene公司，采用噬斑原位杂交的方法筛选cDNA文库，简述如下：5×105 pfu噬菌体被铺制于10张直径15 cm的NZY琼脂平板上，37℃倒置培养4～6 h；置于4℃至少1 h后，转印噬斑于尼龙膜(Colony/Plaque ScreenTM,DuPont NEN)；杂交在含1% SDS、2×SSC、10%硫酸葡聚糖、50%去离子甲酰氨、50 μg/ml变性鲑精DNA的杂交液中进行，探针浓度为1.67×105 Bq/ml杂交液；42℃杂交12～14 h。2×SSC室温洗膜10 min；2×SSC/0.5% SDS 42℃洗膜20 min，重复1次；0.2×SSC/0.5% SDS 42℃洗膜20 min，重复1次；最后进行放射自显影。根据第1轮筛选的结果，用牙签在每个杂交阳性斑点区域1 cm的范围内随机挑取30～40个克隆，排列成矩阵接种于细菌平板上，37℃培养过夜，将噬斑转印于尼龙膜上进行第2轮杂交。根据杂交结果识别阳性克隆，用牙签刺入具有最强杂交信号的噬斑，置牙签于1 ml SM噬菌体缓冲液中5 min，制成噬菌体母液。混合1 μl、10!μl噬菌体母液，200 μl感受态细菌；37℃温育15 min；加入3.0 ml顶层NZY琼脂糖培养基(48℃)；铺于10 cm的NZY琼脂平板上；37℃过夜生长，转膜、杂交、定位阳性克隆。合并使用ExAssistTM辅助噬菌体、SOLRTM细菌，把克隆在Uni-ZAPTMXR噬菌体载体中的阳性cDNA插入片段及其周围的部分序列剪切出来，转变为pBluescript SK(-)噬菌体质粒。EcoR ⅠXho Ⅰ双酶切鉴定插入片段长度。
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5.序列的测定及分析：PE/Model 373A型DNA序列自动分析仪测定克降序列。基因ZG 52的测序策略为引物步移法。以美国国立生物信息中心的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)作为序列同源的主要检索工具。对比数据库主要为NR库(包含CenBank+EMBL+DDBJ+PDB收录的所有非冗余序列)和ESTs库，检索程序主要采用BLASTN，BLASTX、TBLASTN作为补充。
结 果
1.mRNA差异显示：本实验在3’端采用3种引物，5’端采用8种引物，共24种引物组合进行mRNA差异显示，共观察到约80个差异条带，平均每对引物组合可观察到3个左右的差异条带。采用反向Northern杂交的方法对重扩增的片段进行初步筛选排除假阳性片段，根据筛选结果选择克隆了15个差异表达基因片段。
2.Northern杂交结果：32P标记各差异表达片段作为探针，进行Northern杂交。根据Northern杂交的结果可见克隆ZG52、ZG35、ZC52、ZA73、ZC66、ZG63在α粒子辐射诱发恶转的大鼠气管上皮细胞中相对于原代细胞高表达。
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3.克隆序列的同源性检索结果：测得克隆序列后，检索GenBank数据库，对序列进行同源性分析，结果发现：克隆ZG35同大鼠Calpactin Ⅱ基因高度同源，Calpactin Ⅱ又被称为Annexin Ⅰ；克隆ZG52同人SR蛋白激酶Ⅱ(SRPK2)基因的3’末端序列具微弱的同源性，目前SRPK2基因的大鼠同源体尚未被克隆出来，因此ZG52作为新序列被登录到GenBank，登录号为AF007838；克隆ZA73不同任何已知开放阅读框架的基因同源，但同数条来源于小鼠及人的表达序列标签(EST)具有一定程度的同源性，其作为新基因序列被登录到GenBank，登录号为AF011363；克隆ZC52同新型大鼠肝羧酸酯酶前体物基因具有高度同源性；克隆ZG63同人丝氨酸羟甲基转移酶基因具有微弱的同源性；克隆ZC66同大鼠的核苷二磷酸激酶(RatNDPK21)基因高度同源，尤其是在第47位碱基以后同该基因100%同源，NDPK基因即肿瘤转移抑制基因nm 23；另外尚有5条序列同已知基因无明显同源性。在上述工作的基础上，向GenBank登录7条新基因序列。上述克隆的简要情况总结于表1。
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表1 α粒子辐射致大鼠气管上皮细胞恶性转化相关基因克隆 克隆名称
长度*(bp)
GenBank索取号**
同源性分析(计分，E值，一致性)
表达状况
原代细胞
恶转细胞
ZG35
378
大鼠Calpactin Ⅱ基因[575，1e-162,96%]
+
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ZG52
384
AF007838
人SR蛋白激酶 Ⅱ[202,2e-50,88%]
+
ZA73
374
AF011363
新基因片段
+
ZC52
392
, 百拇医药 大鼠羧酸酯酶前体物基因[636，0.0，96%]
+
YG21
405
gb/U67990EST[609,e-172，95%]
+
ZG63
156
AF007837
人丝氨酸羟甲基转移酶基因[272，9e-72,98%]
+
YG82
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394
AF011366
新基因
+
YA14
345
AF011364
小鼠白介素 Ⅰ受体基因[196，1e-48,88%]
+
ZC66
327
大鼠核苷酸二磷酸激酶[513,1e-144,98%]
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+
YA49
334
AF01365
新基因
+
YG83
370
小鼠Calumenin基因[151,8e-35,90%]
+
ZG71
375
AF011367
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新基因片段
+
ZC33
180
小鼠蛋白质L基因[69.9,1e-10,93%]
+
ZG82
392
新基因
+
注：*引物序列未计算在内；**列出GenBank索取号者，其序列已由本实验室登录到GenBank
4.基因ZG52的全长序列克隆及序列分析：克隆ZG52同人SR蛋白激酶Ⅱ(SRPK2)基因的3’末端序列具有微弱的同源性，而激酶通常参与细胞某些过程的调控，因此采用筛选大鼠脑cDNA文库的方法克隆其全长基因序列，经3轮筛选最终筛选到了确定的单个阳性克隆。采用体内剪切的方式把克隆在Uni-ZAPTMXR噬菌体载体中的阳性cDNA插入片段及其周围的部分序列剪切出来，转变为pBluescript SK(-)噬菌体质粒：Eco RⅠ、Xho Ⅰ双酶切鉴定，根据酶切结果初步判断插入片段长度约为3.4 kb左右，该基因内部具有一个EcoR Ⅰ酶切位点。采用引物步移法(Primer-Walking)测定基因序列，序列数据见图1。
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图1 基因ZG52的序列
涂黑部分同人SRPK2基因高度同源
采用BLASTN检索程序检索GenBank的NR库、EST库，发现该基因的3’端(1 410～3 360 bp)同人的SRPK2基因以及小鼠的SRPK2基因高度同源，但其5’端(1～1 409 bp)不同任何已知基因同源，因此可以肯定该基因为新基因。因为对5’端的序列更感兴趣，便采用更为灵敏的检索序列之间微弱同源性的BLASTX程序，单纯检索1～1 410 bp段是否同一些基因具有同源性，结果发现：该基因的1!144～1!332 bp之间的序列同构巢曲霉菌的有丝分裂负性调控因子(negative regulator of mitosis)基因具有微弱的同源性。采用NCBI的ORF finder作为预测开放阅读框架的主要工具，发现在该基因中存在两个开放阅读框架(ORFA，ORFB)，ORFA编码125个氨基酸(1 612～1 989 bp)、ORFB编码126个氨基酸(2 576～3 136 bp)。同源性检索发现ORFA编码的氨基酸序列同小鼠、人的SRPK2蛋白的部分序列高度同源。另外其编码的序列还同酵母、线虫的激酶序列有一定的同源性，说明其编码的序列为较为保守的序列。
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讨 论
出于研究辐射致细胞恶性转化过程中基因表达谱改变的目的，本实验采用mRNA差异显示的方法比较原代大鼠气管上皮细胞同α粒子辐射诱发恶转的大鼠气管上皮细胞之间的基因表达差异状况，目前共克隆到15个差异表达基因片段，共向GenBank中登录7条新基因序列。
在已知的差异表达基因片段中，克隆ZG35同大鼠的Annexin Ⅰ基因高度同源，Annexin Ⅰ为钙依赖的磷脂结合蛋白，其N-端具有保守的酪氨酸残基，该残基可被表皮生长因子(EGF)受体激酶磷酸化[7]；Schlaepfer等发现：Annexin Ⅰ的磷酸化状态为细胞生长依赖及EGF刺激依赖，静止状态的细胞在血清、EGF等刺激下增殖时，其Annexin Ⅰ的表达水平可增高3～4倍。因此推测Annexin Ⅰ可能参与细胞内有丝分裂信号的转导、细胞增殖与分化的调控[8]。本研究观察到Annexin Ⅰ在恶转的RTE细胞中高表达，提示Annexin Ⅰ在细胞恶转过程中起着一定的作用，但上述研究并未阐明在恶转或肿瘤发生过程中Annexin Ⅰ的表达为何升高，Annexin Ⅰ的确切功能，Annexin Ⅰ表达升高及磷酸化/去磷酸化的后果等，因此需深入研究其功能以及在癌症发生过程中的作用。
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克隆ZC52同日本学者Sone等克隆的新型大鼠肝羧酸酯酶前体物基因具有高度同源性(一致性96%，E值=0)[9]。有关羧酸酯酶是否同肿瘤的发生相关的研究，只有Maki等报道：羧酸酯酶RL2可水解内源性的蛋白激酶C(PKC)激活物-双酰基甘油，而PKC被认为参与致癌过程以及细胞增殖的调控，提示RL2可能在大鼠肝癌发生的早期阶段起到一定的作用[10]。该新型酯酶1998年4月才正式被登录到GenBank，有关的实验数据尚未发表，是否同RL2具有类似功能尚不清楚。本研究发现：该新型羧酸酯酶在恶性转化的RTE细胞中高表达，提示值得深入研究其在细胞恶性转化过程中的作用。
克隆ZC66同大鼠的核苷二磷酸激酶基因(NDPK)高度同源，NDPK基因即肿瘤转移抑制基因nm23[11]。自nm 23发现10多年来，研究者的兴趣大都集中于研究nm 23在具有不同转移能力的肿瘤组织之间的差异表达状况，及其抑制肿瘤转移的机理，而对nm 23基因在肿瘤组织与相应的正常组织之间是否存在表达差异重视不够。本实验通过差异显示发现并经Northern杂交证实：nm 23基因在α粒子诱发恶转的大鼠气管上皮细胞中高表达(同原代细胞相比)。Huwer等用Western印记的方法也观察到类似的现象，nm 23蛋白在小细胞肺癌支气管冲洗液中的含量高出其在相应健康侧支气管冲洗液中含量的2～7倍[12]。上述结果说明本实验观察到的nm 23基因在恶转组织中的相对高表达并非特殊现象，但这似乎同nm 23基因在高转移的肿瘤组织中低表达相矛盾，一个尚待证实的解释是在此模型中 nm 23基因在恶转细胞中发生了突变，克隆ZC66在第47位碱基之前同大鼠 nm 23基因的序列并非完全一致，存在缺失及碱基的颠换/转换式突变，但不能排除此种差异是由于差异显示采用的PCR反应条件严格性较低的结果，需进一步实验验证。无论如何，上述结果提示nm 23除同肿瘤转移抑制有关外，还可能存在未知功能，除同肿瘤转移有关外还可能参与细胞恶转的原发过程。
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克隆ZG52为本课题获得的差异新基因片段(GenBank登录号：AF007838)，在恶性转化的大鼠气管上皮细胞中高表达。为阐明其功能，采用筛选cDNA文库的方法克隆其全长基因。最终克隆到一长约3 360 bp的基因。同源性检索发现该基因的3’端(1 410～3!360 bp)同小鼠以及人的SR蛋白激酶 Ⅱ(SRPK2)[13，14]基因高度同源，但其5’端(1～1!409 bp)不同任何已知基因同源，提示该基因可能是同SRPK2相关的新型激酶。Fu等在对SRPK2基因进行染色体定位时发现：人的SRPK2基因位于7号染色体，但根据该基因的保守序列制备的探针在8号、18号染色体上也检测到信号，提示可能存在未知的SRPK2相关的新型蛋白激酶。人类的SRPK2基因是于1997年3月被克隆的，为细胞周期相关的丝氨酸激酶基因，其底物为SR蛋白。SR蛋白[15]为前mRNA剪切因子的主要组成部分，参与pre-mRNA内含子的切除，因此SRPK2的可能功能为参与pre-mRNA的剪切调控。真核细胞中的绝大部分基因必须经过剪切，才能作为蛋白质合成的模板。其中许多基因可通过不同的剪切方式，即变换剪切而编码不同功能的蛋白。有研究报道基因的不同剪切方式同癌症的发生相关[16]。但基因的变换剪切及其调控机理并不清楚，剪切调控因子如SRPK2等的异常是否同肿瘤的发生相关，尚缺乏直接的实验证据。本研究发现SRPK2基因的大鼠同源体序列在恶转的RTE中高表达，提示基因剪切调控可能同RTE细胞的恶性转化相关。基因ZG52的功能需要深入研究。
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本实验只采用了24种引物组合进行mRNA差异显示，这不能函盖分化细胞中的所有基因。按理论计算(P=1-(0.96)n)，24种引物组合只能函盖分化细胞中的大约10!000种基因的28%[17]。可以想象增加引物组合，将会识别出更多的差异表达基因；被识别的差异表达基因片段中，有肿瘤转移抑制基因 nm 23、表皮生长因子激酶的底物Annexin-1、羧酸酯酶前体物基因、可能的mRNA剪切调控因子ZG52等，参与基因转录调控、信号转导、mRNA转录后剪切调控、细胞代谢等生命过程。上述结果进一步说明细胞恶性转化是多基因参与或者说“基因表达谱改变”的结果，涉及细胞生命活动的多方面。研究辐射致细胞恶性转化过程中基因表达谱的改变，有助于阐明辐射致癌的机理，甚至可为发展用于诊断或预后判断的肿瘤标志物、识别候选的药物靶标或具有药理学价值的蛋白质分子等提供依据。■
参考文献
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收稿日期:1999-06-10, 百拇医药
单位：北京放射医学研究所 100850
关键词：α粒子；mRNA差异显示；细胞恶性转化；肿瘤相关基因
中华放射医学与防护杂志000105 【摘要】 目的 克隆α粒子辐射致细胞恶性转化相关基因。方法 采用mRNA差异显示技术识别原代大鼠气管上皮细胞同α粒子辐射诱发恶转的大鼠气管上皮细胞之间的差异表达基因。结果 共克隆到15个可能同α粒子辐射致细胞恶性转化相关的差异表达基因片段(ESTs)，共向GenBank登录7条新基因序列。其中克隆ZG 35同大鼠Annexin Ⅰ基因高度同源，Annexin Ⅰ作为表皮生长因子受体激酶的底物被认为可能参与细胞增殖信号的转导；克隆ZC 52同大鼠羧酸酯酶前体物基因高度同源；克隆ZA 73为新基因片段；克隆ZC 66同肿瘤转移抑制基因 nm 23高度同源，序列分析提示nm 23在此恶转细胞中存在突变；以克隆ZG 52为探针，通过筛选cDNA文库，克隆到一个长约3.36 kb的新基因，序列同源性分析提示该基因可能为一个同SR蛋白激酶Ⅱ相关的新型激酶基因，其可能的功能为参与前mRNA剪切加工的调控。Northern杂交证实了上述基因片段在恶转的大鼠气管上皮细胞中高表达。结论 上述结果为进一步深入研究辐射致癌、克隆辐射致癌相关基因提供了线索，并提示Annexin Ⅰ、nm 23、羧酸酯酶前体物基因、ZG 52等可能参与α粒子辐射诱发大鼠气管上皮细胞恶性转化的过程。
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Cloning of genes involved in neoplastic transformation
induced by high-LET radiation
LI Gang WU Dechang HU Yingchun,et al.
(Institute of Radiation Medicine,Beijing 100850,China)
【Abstract】 Objective To clone genes involved in neoplastic transformation induced by α-particles. Methods Differential display technique was used to identify differentially exprssed RNA species between primary and neoplastic transformed rat tracheal epithelial(RTE) cells. Results Fifteen differentially displayed gene fragments were cloned and sequenced.Among them seven novel gene sequences were submitted to GenBank.Homology searching revealed that Clone ZG 35 was highly homologous to rat Annexin Ⅰ gene which has been thought to be involved in mitogenic signal transduction as a substrate of EGF receptor kinase, Clone ZC 52 was nearly identical to a novel rattus norvegicus gene for carboxylestrase precursor, and Clone ZC 66 was highly homologous to rat NDPK gene or metastasis suppressor gene nm23. Sequence analysis suggested that nm23 may be mutated in the transformed RTE cells.and Clone ZA73 was a novel gene fragment.Screening a rat cDNA library using the novel gene Clone ZG52 (Accession number:AF007838) as probe permitted the cloning of a 3.36-kb gene.Sequence analysis and homology searching indicated that the gene contained a unique 1409-bp 5'sequence and a 3' sequence showing high homology toward SRPK2,suggesting that it might be a novel SRPK2-related gene involved in pre-mRNA splicing.Northern hybridization confirmed that the above gene or gene fragments were up-regulated in the transformed RTE cells. Conclusion These results provide clues to elucidate the mechanisms of radiation oncogenesis and suggest that Annexin Ⅰ,nm23,and carboxylesterase precursor gene might be involved in the neoplastic transformation induced by α-partcle radiation.
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【Key words】 Alpha particles; mRNA differential display; Neoplastic transformation; Tumor related gene▲
研究表明体外细胞恶性转化的机理同体内致癌过程的机理类似，体外细胞恶性转化可比较精确而全面的重演体内致癌过程，可为研究致癌机理提供重要的实验模型。为对高LET辐射致癌机理进行研究，本实验室先后建立了6种α粒子辐射诱发的体外细胞恶性转化模型，包括：大鼠胚肺纤维母细胞、叙利亚地鼠胚胎细胞(SHE细胞)、大鼠气管上皮细胞、SV40转染的人胚肺纤维母细胞、SV40转染的人支气管上皮细胞(HBEM细胞)、HPV18转染的人支气管上皮细胞(BEP2D细胞)等。得到公认的是辐射可导致基因突变或染色体畸变，进而启动或推进细胞恶性转化，细胞恶性转化主要是基因突变、基因表达改变累积的结果[1]，因此阐明辐射致细胞恶性转化的机理需从基因水平进行研究。已有的研究局限于观察为数不多的已知重要癌基因、抑癌基因如：p53、c-myc、H，K，H-ras、Rb、端粒酶等基因在各种模型中的表达及突变状况，具有片面性，因为不可能通过观察数个基因的状况而理解细胞恶性转化的整个过程，而且辐射致癌或致细胞恶性转化本身存在相当的复杂性与异质性。因此许多学者意识到要阐明其机理需要从整体的角度，全面识别正常细胞同相应恶转细胞之间的差异表达基因，寻找未知的参与细胞恶性转化过程的基因。这在数年前只是一种理想，但目前随着分子遗传学技术的快速进展，尤其是在人类基因组计划的带动下，规模性识别不同功能状态细胞之间的差异表达基因在技术上成为可能，可供选择的方法有：ESTs图谱、代表性差异分析(RDA)、基因表达系列分析(SAGE)、基因芯片、mRNA差异显示等[2]。在各种识别差异表达基因的方法中，mRNA差异显示技术的应用较为广泛。在本实验室已建立的α粒子诱导的大鼠气管上皮细胞(RTE)体外恶性转化模型的基础上，本项研究选择mRNA差异显示技术比较该转化细胞同相应的原代细胞在基因表达方面的差异，克隆α粒子辐射致细胞恶性转化相关基因。
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材料和方法
1.细胞模型：按Gray等的方法分离、培养原代大鼠气管上皮细胞[3]。经239Pu α粒子放射源照射后恶转的RTE细胞系是由赵永良博士建立的，具有裸鼠致瘤性[4]。在含体积分数5%的小牛血清，5 μg/ml的胰岛素，0.3 μmol/L的氢化可的松的F12培养基中培养。
2.差异显示：差显引物购自GenHunter公司。采用Trizol试剂(Gibicol公司)提取总RNA。差异显示按Liang等人报道的方法[5]，略加改进，简述如下：mRNA的反转录：反应总体积50 μl，其中5×RT缓冲液10 μl,dNTP(250 μmol/L)4 μl，DTT(0.1 mol/L)5 μl，总RNA(2 μg/μl) 2 μl,锚定引物H-T11M(M可为A、C或G，2 μmol/L) 10 μl，dH2O 15 μl,混匀，65℃ 5 min,37℃ 10 min，然后加入MMLV反转录酶4 μl(200 U/μl)，37℃反应60 min，75℃ 5 min终止反应。PCR反应：dH2O 8.7 μl,10×PCR缓冲液2 μl,MgCl2(25 mmol/L) 1.2 μl,dNTP(25 μmol/L) 1.6 μl,随机引物(H-AP1-8，2 μmol/L)2 μl，锚定引物H-T11M(2 μmol/L)2 μl,反转录产物2 μl，α-[32P]dCTP(3.7×105Bq/μl)0.3 μl, AmpliTaq(5 U/μl) 0.2 μl，PCR反应条件：94℃ 30 s,40℃ 2 min,72℃ 30s,40个循环，72℃延长5 min。6%的聚丙烯酰氨凝胶电泳分离扩增产物，-80℃ X射线片曝光12～24 h。切下差异表达条带，煮沸法、醋酸钠/乙醇沉淀回收聚丙烯凝胶中的DNA[3]。PCR重扩增体系50 μl，除dNTP浓度增至250 μmol/L和不加同位素外，其他条件同前。使用TA载体系统(PCRTM2.1载体，Invitrogen公司)克隆重扩增产物。
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3.Northern杂交：按文献报道的方法[6]进行Northern杂交，1.2%甲醛变性胶电泳分离总RNA，真空转移法把RNA转移至尼龙膜上，随机引物法标记(prime-a-genelabelling,Promega)酶切后回收的差异表达基因片段作为探针进行杂交。
4.cDNA文库的筛选：构建于Uni-ZAPTMXR载体的大鼠脑cDNA文库购自于Stratagene公司，采用噬斑原位杂交的方法筛选cDNA文库，简述如下：5×105 pfu噬菌体被铺制于10张直径15 cm的NZY琼脂平板上，37℃倒置培养4～6 h；置于4℃至少1 h后，转印噬斑于尼龙膜(Colony/Plaque ScreenTM,DuPont NEN)；杂交在含1% SDS、2×SSC、10%硫酸葡聚糖、50%去离子甲酰氨、50 μg/ml变性鲑精DNA的杂交液中进行，探针浓度为1.67×105 Bq/ml杂交液；42℃杂交12～14 h。2×SSC室温洗膜10 min；2×SSC/0.5% SDS 42℃洗膜20 min，重复1次；0.2×SSC/0.5% SDS 42℃洗膜20 min，重复1次；最后进行放射自显影。根据第1轮筛选的结果，用牙签在每个杂交阳性斑点区域1 cm的范围内随机挑取30～40个克隆，排列成矩阵接种于细菌平板上，37℃培养过夜，将噬斑转印于尼龙膜上进行第2轮杂交。根据杂交结果识别阳性克隆，用牙签刺入具有最强杂交信号的噬斑，置牙签于1 ml SM噬菌体缓冲液中5 min，制成噬菌体母液。混合1 μl、10!μl噬菌体母液，200 μl感受态细菌；37℃温育15 min；加入3.0 ml顶层NZY琼脂糖培养基(48℃)；铺于10 cm的NZY琼脂平板上；37℃过夜生长，转膜、杂交、定位阳性克隆。合并使用ExAssistTM辅助噬菌体、SOLRTM细菌，把克隆在Uni-ZAPTMXR噬菌体载体中的阳性cDNA插入片段及其周围的部分序列剪切出来，转变为pBluescript SK(-)噬菌体质粒。EcoR ⅠXho Ⅰ双酶切鉴定插入片段长度。
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5.序列的测定及分析：PE/Model 373A型DNA序列自动分析仪测定克降序列。基因ZG 52的测序策略为引物步移法。以美国国立生物信息中心的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)作为序列同源的主要检索工具。对比数据库主要为NR库(包含CenBank+EMBL+DDBJ+PDB收录的所有非冗余序列)和ESTs库，检索程序主要采用BLASTN，BLASTX、TBLASTN作为补充。
结 果
1.mRNA差异显示：本实验在3’端采用3种引物，5’端采用8种引物，共24种引物组合进行mRNA差异显示，共观察到约80个差异条带，平均每对引物组合可观察到3个左右的差异条带。采用反向Northern杂交的方法对重扩增的片段进行初步筛选排除假阳性片段，根据筛选结果选择克隆了15个差异表达基因片段。
2.Northern杂交结果：32P标记各差异表达片段作为探针，进行Northern杂交。根据Northern杂交的结果可见克隆ZG52、ZG35、ZC52、ZA73、ZC66、ZG63在α粒子辐射诱发恶转的大鼠气管上皮细胞中相对于原代细胞高表达。
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3.克隆序列的同源性检索结果：测得克隆序列后，检索GenBank数据库，对序列进行同源性分析，结果发现：克隆ZG35同大鼠Calpactin Ⅱ基因高度同源，Calpactin Ⅱ又被称为Annexin Ⅰ；克隆ZG52同人SR蛋白激酶Ⅱ(SRPK2)基因的3’末端序列具微弱的同源性，目前SRPK2基因的大鼠同源体尚未被克隆出来，因此ZG52作为新序列被登录到GenBank，登录号为AF007838；克隆ZA73不同任何已知开放阅读框架的基因同源，但同数条来源于小鼠及人的表达序列标签(EST)具有一定程度的同源性，其作为新基因序列被登录到GenBank，登录号为AF011363；克隆ZC52同新型大鼠肝羧酸酯酶前体物基因具有高度同源性；克隆ZG63同人丝氨酸羟甲基转移酶基因具有微弱的同源性；克隆ZC66同大鼠的核苷二磷酸激酶(RatNDPK21)基因高度同源，尤其是在第47位碱基以后同该基因100%同源，NDPK基因即肿瘤转移抑制基因nm 23；另外尚有5条序列同已知基因无明显同源性。在上述工作的基础上，向GenBank登录7条新基因序列。上述克隆的简要情况总结于表1。
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表1 α粒子辐射致大鼠气管上皮细胞恶性转化相关基因克隆 克隆名称
长度*(bp)
GenBank索取号**
同源性分析(计分，E值，一致性)
表达状况
原代细胞
恶转细胞
ZG35
378
大鼠Calpactin Ⅱ基因[575，1e-162,96%]
+
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ZG52
384
AF007838
人SR蛋白激酶 Ⅱ[202,2e-50,88%]
+
ZA73
374
AF011363
新基因片段
+
ZC52
392
, 百拇医药 大鼠羧酸酯酶前体物基因[636，0.0，96%]
+
YG21
405
gb/U67990EST[609,e-172，95%]
+
ZG63
156
AF007837
人丝氨酸羟甲基转移酶基因[272，9e-72,98%]
+
YG82
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394
AF011366
新基因
+
YA14
345
AF011364
小鼠白介素 Ⅰ受体基因[196，1e-48,88%]
+
ZC66
327
大鼠核苷酸二磷酸激酶[513,1e-144,98%]
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+
YA49
334
AF01365
新基因
+
YG83
370
小鼠Calumenin基因[151,8e-35,90%]
+
ZG71
375
AF011367
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新基因片段
+
ZC33
180
小鼠蛋白质L基因[69.9,1e-10,93%]
+
ZG82
392
新基因
+
注：*引物序列未计算在内；**列出GenBank索取号者，其序列已由本实验室登录到GenBank
4.基因ZG52的全长序列克隆及序列分析：克隆ZG52同人SR蛋白激酶Ⅱ(SRPK2)基因的3’末端序列具有微弱的同源性，而激酶通常参与细胞某些过程的调控，因此采用筛选大鼠脑cDNA文库的方法克隆其全长基因序列，经3轮筛选最终筛选到了确定的单个阳性克隆。采用体内剪切的方式把克隆在Uni-ZAPTMXR噬菌体载体中的阳性cDNA插入片段及其周围的部分序列剪切出来，转变为pBluescript SK(-)噬菌体质粒：Eco RⅠ、Xho Ⅰ双酶切鉴定，根据酶切结果初步判断插入片段长度约为3.4 kb左右，该基因内部具有一个EcoR Ⅰ酶切位点。采用引物步移法(Primer-Walking)测定基因序列，序列数据见图1。
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图1 基因ZG52的序列
涂黑部分同人SRPK2基因高度同源
采用BLASTN检索程序检索GenBank的NR库、EST库，发现该基因的3’端(1 410～3 360 bp)同人的SRPK2基因以及小鼠的SRPK2基因高度同源，但其5’端(1～1 409 bp)不同任何已知基因同源，因此可以肯定该基因为新基因。因为对5’端的序列更感兴趣，便采用更为灵敏的检索序列之间微弱同源性的BLASTX程序，单纯检索1～1 410 bp段是否同一些基因具有同源性，结果发现：该基因的1!144～1!332 bp之间的序列同构巢曲霉菌的有丝分裂负性调控因子(negative regulator of mitosis)基因具有微弱的同源性。采用NCBI的ORF finder作为预测开放阅读框架的主要工具，发现在该基因中存在两个开放阅读框架(ORFA，ORFB)，ORFA编码125个氨基酸(1 612～1 989 bp)、ORFB编码126个氨基酸(2 576～3 136 bp)。同源性检索发现ORFA编码的氨基酸序列同小鼠、人的SRPK2蛋白的部分序列高度同源。另外其编码的序列还同酵母、线虫的激酶序列有一定的同源性，说明其编码的序列为较为保守的序列。
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讨 论
出于研究辐射致细胞恶性转化过程中基因表达谱改变的目的，本实验采用mRNA差异显示的方法比较原代大鼠气管上皮细胞同α粒子辐射诱发恶转的大鼠气管上皮细胞之间的基因表达差异状况，目前共克隆到15个差异表达基因片段，共向GenBank中登录7条新基因序列。
在已知的差异表达基因片段中，克隆ZG35同大鼠的Annexin Ⅰ基因高度同源，Annexin Ⅰ为钙依赖的磷脂结合蛋白，其N-端具有保守的酪氨酸残基，该残基可被表皮生长因子(EGF)受体激酶磷酸化[7]；Schlaepfer等发现：Annexin Ⅰ的磷酸化状态为细胞生长依赖及EGF刺激依赖，静止状态的细胞在血清、EGF等刺激下增殖时，其Annexin Ⅰ的表达水平可增高3～4倍。因此推测Annexin Ⅰ可能参与细胞内有丝分裂信号的转导、细胞增殖与分化的调控[8]。本研究观察到Annexin Ⅰ在恶转的RTE细胞中高表达，提示Annexin Ⅰ在细胞恶转过程中起着一定的作用，但上述研究并未阐明在恶转或肿瘤发生过程中Annexin Ⅰ的表达为何升高，Annexin Ⅰ的确切功能，Annexin Ⅰ表达升高及磷酸化/去磷酸化的后果等，因此需深入研究其功能以及在癌症发生过程中的作用。
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克隆ZC52同日本学者Sone等克隆的新型大鼠肝羧酸酯酶前体物基因具有高度同源性(一致性96%，E值=0)[9]。有关羧酸酯酶是否同肿瘤的发生相关的研究，只有Maki等报道：羧酸酯酶RL2可水解内源性的蛋白激酶C(PKC)激活物-双酰基甘油，而PKC被认为参与致癌过程以及细胞增殖的调控，提示RL2可能在大鼠肝癌发生的早期阶段起到一定的作用[10]。该新型酯酶1998年4月才正式被登录到GenBank，有关的实验数据尚未发表，是否同RL2具有类似功能尚不清楚。本研究发现：该新型羧酸酯酶在恶性转化的RTE细胞中高表达，提示值得深入研究其在细胞恶性转化过程中的作用。
克隆ZC66同大鼠的核苷二磷酸激酶基因(NDPK)高度同源，NDPK基因即肿瘤转移抑制基因nm23[11]。自nm 23发现10多年来，研究者的兴趣大都集中于研究nm 23在具有不同转移能力的肿瘤组织之间的差异表达状况，及其抑制肿瘤转移的机理，而对nm 23基因在肿瘤组织与相应的正常组织之间是否存在表达差异重视不够。本实验通过差异显示发现并经Northern杂交证实：nm 23基因在α粒子诱发恶转的大鼠气管上皮细胞中高表达(同原代细胞相比)。Huwer等用Western印记的方法也观察到类似的现象，nm 23蛋白在小细胞肺癌支气管冲洗液中的含量高出其在相应健康侧支气管冲洗液中含量的2～7倍[12]。上述结果说明本实验观察到的nm 23基因在恶转组织中的相对高表达并非特殊现象，但这似乎同nm 23基因在高转移的肿瘤组织中低表达相矛盾，一个尚待证实的解释是在此模型中 nm 23基因在恶转细胞中发生了突变，克隆ZC66在第47位碱基之前同大鼠 nm 23基因的序列并非完全一致，存在缺失及碱基的颠换/转换式突变，但不能排除此种差异是由于差异显示采用的PCR反应条件严格性较低的结果，需进一步实验验证。无论如何，上述结果提示nm 23除同肿瘤转移抑制有关外，还可能存在未知功能，除同肿瘤转移有关外还可能参与细胞恶转的原发过程。
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克隆ZG52为本课题获得的差异新基因片段(GenBank登录号：AF007838)，在恶性转化的大鼠气管上皮细胞中高表达。为阐明其功能，采用筛选cDNA文库的方法克隆其全长基因。最终克隆到一长约3 360 bp的基因。同源性检索发现该基因的3’端(1 410～3!360 bp)同小鼠以及人的SR蛋白激酶 Ⅱ(SRPK2)[13，14]基因高度同源，但其5’端(1～1!409 bp)不同任何已知基因同源，提示该基因可能是同SRPK2相关的新型激酶。Fu等在对SRPK2基因进行染色体定位时发现：人的SRPK2基因位于7号染色体，但根据该基因的保守序列制备的探针在8号、18号染色体上也检测到信号，提示可能存在未知的SRPK2相关的新型蛋白激酶。人类的SRPK2基因是于1997年3月被克隆的，为细胞周期相关的丝氨酸激酶基因，其底物为SR蛋白。SR蛋白[15]为前mRNA剪切因子的主要组成部分，参与pre-mRNA内含子的切除，因此SRPK2的可能功能为参与pre-mRNA的剪切调控。真核细胞中的绝大部分基因必须经过剪切，才能作为蛋白质合成的模板。其中许多基因可通过不同的剪切方式，即变换剪切而编码不同功能的蛋白。有研究报道基因的不同剪切方式同癌症的发生相关[16]。但基因的变换剪切及其调控机理并不清楚，剪切调控因子如SRPK2等的异常是否同肿瘤的发生相关，尚缺乏直接的实验证据。本研究发现SRPK2基因的大鼠同源体序列在恶转的RTE中高表达，提示基因剪切调控可能同RTE细胞的恶性转化相关。基因ZG52的功能需要深入研究。
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本实验只采用了24种引物组合进行mRNA差异显示，这不能函盖分化细胞中的所有基因。按理论计算(P=1-(0.96)n)，24种引物组合只能函盖分化细胞中的大约10!000种基因的28%[17]。可以想象增加引物组合，将会识别出更多的差异表达基因；被识别的差异表达基因片段中，有肿瘤转移抑制基因 nm 23、表皮生长因子激酶的底物Annexin-1、羧酸酯酶前体物基因、可能的mRNA剪切调控因子ZG52等，参与基因转录调控、信号转导、mRNA转录后剪切调控、细胞代谢等生命过程。上述结果进一步说明细胞恶性转化是多基因参与或者说“基因表达谱改变”的结果，涉及细胞生命活动的多方面。研究辐射致细胞恶性转化过程中基因表达谱的改变，有助于阐明辐射致癌的机理，甚至可为发展用于诊断或预后判断的肿瘤标志物、识别候选的药物靶标或具有药理学价值的蛋白质分子等提供依据。■
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收稿日期:1999-06-10, 百拇医药