内皮型一氧化氮合酶在急性放射性脑水肿中的表达
作者：刘保国 张保民 陈肖华 高亚兵 王德文
单位：刘保国(100039 北京北太平路医院)；张保民(100039 北京北太平路医院)；陈肖华(北京放射医学研究所)；高亚兵(北京放射医学研究所)；王德文(北京放射医学研究所)
关键词：内皮型一氧化氮合酶；急性放射性脑水肿；60Co；γ刀
中华放射医学与防护杂志000413 【摘要】 目的 探讨大剂量60Co γ刀照射后脑血管内皮细胞内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达变化及其与急性放射性脑水肿的关系。方法 单次200 Gy 60Co γ刀照射大鼠右侧尾状核头部，于照射后14 d内分批活杀动物，采用光镜、电镜、免疫组化及原位杂交技术研究照射后急性放射性脑水肿的发生发展及脑血管内皮细胞eNOS表达变化。结果 照射后2 h出现急性放射性脑水肿病理改变，照射后3 d达高峰；脑血管内皮细胞eNOS于照射后2 h亦出现明显表达增高，且持续时间长，伴行于放射性脑水肿急性发展阶段。结论 大剂量60Co γ刀照射后eNOS的表达增高可能与急性放射性脑水肿的发生发展有关。
, 百拇医药
Expression of endothelial nitric oxide synthase in acute radiation-induced cerebral edema
LIU Baoguo, ZHANG Baomin, CHEN Xiaohua, et al.
(North Taiping Road Hospital, Beijing 100850,China)
【Abstract】 Objective To study the relation between changes in expression of endothelial nitric oxide synthase(eNOS)in brain vascular endothelial cells and acute radiation-induced cerebral edema after 60Co gamma knife irradiation with a high dose. Methods The right caudate nucleus of rats were irradiated with 200 Gy 60Co gamma knife. The rats were sacrificed within 14 days after irradiation. By a light microscopy, electron microscopy, immunohistochemistry and in situ hybridization, we studied the formation and development of acute radiation-induced cerebral edema as well as the expression of eNOS in brain vascular endothelial cells. Results Acute radiation-induced cerebral edema was observed morphologically 2 hours after irradiation and peaked on day 3 after irradiation. The expression of eNOS in brain vascular endothelial cells markedly increased 2 hours after irradiation, which could be consistently visualized during the acute developmental phase of radiation-induced cerebral edema. Conclusion The increased expression of eNOS may be related to the formation and development of acute radiation-induced cerebral edema after 60Co gamma knife irradiation with a high dose.
, 百拇医药
【Key words】 Endothelial nitric oxide synthase; Acute radiation-induced cerebral edema; 60Co gamma knife
急性放射性脑水肿是临床上用γ刀治疗脑部疾病特别是功能性疾病时较为严重的照射后副反应，限制了其剂量应用。NO是近年来发现的中枢神经系统新型神经递质与自由基，与多种神经损害的发病机理有重要关系[1]。本实验对大剂量60Co γ刀照射后急性放射性脑水肿及脑血管内皮细胞内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达变化进行动态研究，以探讨eNOS在照射后急性放射性脑水肿中的意义和作用，为其制定治疗措施提供实验依据。
材料和方法
1.实验动物及分组：健康雄性Wistar大鼠56只，体重(200±20) g，随机分为两组，正常对照组28只，γ刀照射组28只。
, 百拇医药
2.照射方式及条件：用以60Co为放射源的旋转式头部γ刀进行照射，选择大鼠右侧尾状核头部为靶点，中心剂量200 Gy，照射时间4 000 s。
3.灌注取材及切片制作：动物分别于照射后2、6、12 h及1、3、7、14 d活杀。2%戊巴比妥钠30 mg/kg 体重腹腔麻醉成功后，用微型蠕动泵(流速5～8 ml/min)经左心室行4%多聚甲醛(pH 7.4)灌注固定后取脑。脑组织经液氮冷冻，OCT 包埋，用恒温冷冻切片机制成20 μm厚冠状位切片。
4.病理形态学检查：常规HE 染色观察急性放射性脑水肿的发展过程。于照射区域及照射周边区域取小块脑组织，切成1 mm×1 mm×1mm大小，2.5%戊二醛固定，电镜制片，CM120 型透射电镜下观察。
5.免疫组化染色：eNOS单克隆抗体购自北京中山生物技术有限公司，1∶50稀释，以ABC 试剂盒(1∶1∶100，vector)检测。以PBS代替一抗作为阴性对照。eNOS免疫组化染色阳性为血管内皮细胞浆内出现棕黄色颗粒。
, 百拇医药
图1 照射后2 h照射区血管内皮细胞
微绒毛形成增多，胞浆胞饮小囊泡增加
电镜 ×35 000
6.原位杂交：eNOS cDNA 探针购自北京医科大学分子病理实验室，采用Boehringer,Mannheim 公司的“DIG DNA Labeling and Detectin kit”进行标记和检测。参照蔡文琴[2]等方法，略加改进后进行原位杂交操作。以不加探针和杂交前以RNase A 消化切片30 min作为阴性对照。eNOS原位杂交阳性杂交信号为血管内皮细胞胞浆内出现深蓝色颗粒。
结 果
1.光镜及电镜检查结果
照射后2 h照射区域及照射周边区域即出现急性放射性脑水肿的的病理学改变，电镜下可见靶区微血管内皮细胞微绒毛形成增多，内皮细胞胞浆胞饮小囊泡增加等(见图1)。照射后6 h急性放射性脑水肿改变趋于显著，光镜下表现为微血管内皮细胞肿胀，血管周围间隙扩大，脑组织结构疏松，呈海绵样结构。电镜下微血管基膜膨胀，附于血管内皮细胞上的星状胶质细胞胞突肿胀。照射后3 d，上述改变达到高峰。脑组织间质水肿显著，微血管周围间隙中有较多水肿液积聚。微血管内皮细胞胞膜受损害，微血管基膜有破裂，附于内皮细胞上的星状胶质细胞足板脱离。照射后7 d，间质出现微小出血灶和小血栓。照射后14 d，神经纤维网和间质有空泡形成。
, 百拇医药
正常对照组大鼠脑为正常组织结构，微血管超微结构未见异常。
2. eNOS免疫组化及原位杂交结果
eNOS免疫组化染色及原位杂交结果如表1所示。可见正常对照组靶区及靶周围区血管内皮细胞eNOS免疫组化染色及原位杂交结果弱阳性。照射后2 h靶区血管内皮细胞eNOS免疫反应及eNOSmRNA杂交信号即呈强阳性，靶周围区血管内皮细胞eNOS免疫反应及eNOS mRNA杂交信号呈中度阳性。eNOS表达增高持续时间较长，照射后3 d靶区血管内皮细胞eNOS仍呈强阳性表达，照射后14 d靶区血管内皮细胞eNOS表达方恢复至正常对照组水平。靶远隔区脑组织血管内皮细胞eNOS免疫反应及eNOS mRNA杂交信号无异常改变。
表1 eNOS 免疫组化染色及原位杂交观察结果 照射后时间
结果
, http://www.100md.com
靶区
靶周围区
靶远隔区
对照组
+
+
+
照射后
2 h
+
6 h
, 百拇医药
+
12 h
+
1 d
+
3 d
, 百拇医药
+
7 d
+
+
14 d
+
+
+
注：+为“弱阳性”；为“中度阳性”；为“强阳性”讨 论
, http://www.100md.com
急性放射性脑水肿主要是血管源性脑水肿。血管源性脑水肿是由于血脑屏障受损、破坏，使毛细血管通透性增加，一些血浆大分子物质如蛋白等经血管壁渗透到细胞外液中，水分渗出增多，积聚于血管周围及细胞间隙所致[3]。毛细血管内皮及其紧密连接是血脑屏障的基本结构。Janjigro[4]等应用小片膜电压钳实验表明NO可以调整血脑屏障内皮细胞的高极化激活电流从而调节离子、营养物质和其他分子的跨血脑屏障转运，证实NO可能调节离体脑血管内皮细胞的通透性。作者实验发现，大剂量60Co γ刀照射后2 h靶区及靶周围区脑组织已出现血管源性脑水肿的病理改变，主要表现为微血管内皮细胞胞浆胞饮小囊泡增加，微绒毛形成增多，内皮细胞通透性增高等。这与Ridger[5]等报道的大剂量照射后2 h脑组织出现血脑屏障功能障碍及内皮细胞通透性增高的报道相符合。此时作者通过免疫组化染色及原位杂交发现照射区域血管内皮细胞eNOS表达有明显的增高。放射性脑水肿在照射后6 h趋于显著，照射后3 d达高峰。而血管内皮细胞eNOS表达增高持续时间亦较长，伴行于放射性脑水肿急性发展阶段。根据以上结果作者推测照射后血管内皮细胞eNOS表达增高与血脑屏障通透性增加及急性放射性脑水肿的发生发展有关。近年研究报道，NO与羟自由基(HO.)等超氧自由基反应生成超氧亚硝酸根离子(ONOO-)，导致血管内皮细胞损伤，可能是血脑屏障通透性增高的重要机理。eNOS表达增高后在脑血管内皮细胞中催化L-精氨酸产生大量NO，NO与超氧自由基反应生成ONOO-等具高度氧化活性的过氧亚硝酸阴离子。ONOO-可使内皮细胞膜上的重要组成成分含多聚不饱和脂肪酸较多的磷脂发生过氧化作用，使内皮细胞膜结构与功能受损，膜通透性增加[6]；ONOO-干扰内皮细胞三羧酸循环中关键酶的活性而造成内皮细胞能量代谢障碍，而使ATP产生减少，内皮形态构象改变，正常内皮细胞连接无法维持而致血脑屏障通透性增加[7]。另外NO还可介导缓激肽、白三烯、花生四烯酸等血管活性物质对微血管通透性的影响[8]。
, 百拇医药
参考文献
1， Garthwaite J,Bovlton CL. Nitric oxide signaling in the central nervous system.Ann Rev Physiol,1995,57:683.
2， 蔡文琴，王伯纭.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术.成都：四川科学技术出版社，1994.421-422.
3， 彭家仪，马志忠.脑水肿的诊断与治疗.北京：人民军医出版社，1996.38.
4， Janjigro D, West GA, Nguyen TS, et al. Regulation of blood-brain barrier endothelial cells by nitric oxide. Cir Res,1994,75:528.
, 百拇医药
5， Ridger VC, Greenacre S,Handy R,et al. Effect of peroxynitrite on plasma extravasation, microvascular blood flow and nociception in the rat.Br J Pharmacol,1997,122:1083.
6， Crow JP,Beckman JS, Calum JG, et al. Reactions between nitric oxide, superoxide and peroxynitrite: footprints of peroxynitrite in vivo. Adv Pharmacol,1995,34:17-20.
7， Salzman AL, Andrew L, Micheal J,et al.Nitric oxide dilares tight junction and depletes ATP in cultured Cao-2BBe intestinal epithelial monolyers.Am J Physiol, 1995,268:G861-870.
8， Yuan Y,Granger HJ, Iawieja DC,et al. Histsamin increase veneular permeability via a phospholipase C-NO synthase guanylate cyclase cascade.Am J Physiol, 1993,264:H17354.
(收稿日期:1999-10-08), 百拇医药
单位：刘保国(100039 北京北太平路医院)；张保民(100039 北京北太平路医院)；陈肖华(北京放射医学研究所)；高亚兵(北京放射医学研究所)；王德文(北京放射医学研究所)
关键词：内皮型一氧化氮合酶；急性放射性脑水肿；60Co；γ刀
中华放射医学与防护杂志000413 【摘要】 目的 探讨大剂量60Co γ刀照射后脑血管内皮细胞内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达变化及其与急性放射性脑水肿的关系。方法 单次200 Gy 60Co γ刀照射大鼠右侧尾状核头部，于照射后14 d内分批活杀动物，采用光镜、电镜、免疫组化及原位杂交技术研究照射后急性放射性脑水肿的发生发展及脑血管内皮细胞eNOS表达变化。结果 照射后2 h出现急性放射性脑水肿病理改变，照射后3 d达高峰；脑血管内皮细胞eNOS于照射后2 h亦出现明显表达增高，且持续时间长，伴行于放射性脑水肿急性发展阶段。结论 大剂量60Co γ刀照射后eNOS的表达增高可能与急性放射性脑水肿的发生发展有关。
, 百拇医药
Expression of endothelial nitric oxide synthase in acute radiation-induced cerebral edema
LIU Baoguo, ZHANG Baomin, CHEN Xiaohua, et al.
(North Taiping Road Hospital, Beijing 100850,China)
【Abstract】 Objective To study the relation between changes in expression of endothelial nitric oxide synthase(eNOS)in brain vascular endothelial cells and acute radiation-induced cerebral edema after 60Co gamma knife irradiation with a high dose. Methods The right caudate nucleus of rats were irradiated with 200 Gy 60Co gamma knife. The rats were sacrificed within 14 days after irradiation. By a light microscopy, electron microscopy, immunohistochemistry and in situ hybridization, we studied the formation and development of acute radiation-induced cerebral edema as well as the expression of eNOS in brain vascular endothelial cells. Results Acute radiation-induced cerebral edema was observed morphologically 2 hours after irradiation and peaked on day 3 after irradiation. The expression of eNOS in brain vascular endothelial cells markedly increased 2 hours after irradiation, which could be consistently visualized during the acute developmental phase of radiation-induced cerebral edema. Conclusion The increased expression of eNOS may be related to the formation and development of acute radiation-induced cerebral edema after 60Co gamma knife irradiation with a high dose.
, 百拇医药
【Key words】 Endothelial nitric oxide synthase; Acute radiation-induced cerebral edema; 60Co gamma knife
急性放射性脑水肿是临床上用γ刀治疗脑部疾病特别是功能性疾病时较为严重的照射后副反应，限制了其剂量应用。NO是近年来发现的中枢神经系统新型神经递质与自由基，与多种神经损害的发病机理有重要关系[1]。本实验对大剂量60Co γ刀照射后急性放射性脑水肿及脑血管内皮细胞内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达变化进行动态研究，以探讨eNOS在照射后急性放射性脑水肿中的意义和作用，为其制定治疗措施提供实验依据。
材料和方法
1.实验动物及分组：健康雄性Wistar大鼠56只，体重(200±20) g，随机分为两组，正常对照组28只，γ刀照射组28只。
, 百拇医药
2.照射方式及条件：用以60Co为放射源的旋转式头部γ刀进行照射，选择大鼠右侧尾状核头部为靶点，中心剂量200 Gy，照射时间4 000 s。
3.灌注取材及切片制作：动物分别于照射后2、6、12 h及1、3、7、14 d活杀。2%戊巴比妥钠30 mg/kg 体重腹腔麻醉成功后，用微型蠕动泵(流速5～8 ml/min)经左心室行4%多聚甲醛(pH 7.4)灌注固定后取脑。脑组织经液氮冷冻，OCT 包埋，用恒温冷冻切片机制成20 μm厚冠状位切片。
4.病理形态学检查：常规HE 染色观察急性放射性脑水肿的发展过程。于照射区域及照射周边区域取小块脑组织，切成1 mm×1 mm×1mm大小，2.5%戊二醛固定，电镜制片，CM120 型透射电镜下观察。
5.免疫组化染色：eNOS单克隆抗体购自北京中山生物技术有限公司，1∶50稀释，以ABC 试剂盒(1∶1∶100，vector)检测。以PBS代替一抗作为阴性对照。eNOS免疫组化染色阳性为血管内皮细胞浆内出现棕黄色颗粒。
, 百拇医药
图1 照射后2 h照射区血管内皮细胞
微绒毛形成增多，胞浆胞饮小囊泡增加
电镜 ×35 000
6.原位杂交：eNOS cDNA 探针购自北京医科大学分子病理实验室，采用Boehringer,Mannheim 公司的“DIG DNA Labeling and Detectin kit”进行标记和检测。参照蔡文琴[2]等方法，略加改进后进行原位杂交操作。以不加探针和杂交前以RNase A 消化切片30 min作为阴性对照。eNOS原位杂交阳性杂交信号为血管内皮细胞胞浆内出现深蓝色颗粒。
结 果
1.光镜及电镜检查结果
照射后2 h照射区域及照射周边区域即出现急性放射性脑水肿的的病理学改变，电镜下可见靶区微血管内皮细胞微绒毛形成增多，内皮细胞胞浆胞饮小囊泡增加等(见图1)。照射后6 h急性放射性脑水肿改变趋于显著，光镜下表现为微血管内皮细胞肿胀，血管周围间隙扩大，脑组织结构疏松，呈海绵样结构。电镜下微血管基膜膨胀，附于血管内皮细胞上的星状胶质细胞胞突肿胀。照射后3 d，上述改变达到高峰。脑组织间质水肿显著，微血管周围间隙中有较多水肿液积聚。微血管内皮细胞胞膜受损害，微血管基膜有破裂，附于内皮细胞上的星状胶质细胞足板脱离。照射后7 d，间质出现微小出血灶和小血栓。照射后14 d，神经纤维网和间质有空泡形成。
, 百拇医药
正常对照组大鼠脑为正常组织结构，微血管超微结构未见异常。
2. eNOS免疫组化及原位杂交结果
eNOS免疫组化染色及原位杂交结果如表1所示。可见正常对照组靶区及靶周围区血管内皮细胞eNOS免疫组化染色及原位杂交结果弱阳性。照射后2 h靶区血管内皮细胞eNOS免疫反应及eNOSmRNA杂交信号即呈强阳性，靶周围区血管内皮细胞eNOS免疫反应及eNOS mRNA杂交信号呈中度阳性。eNOS表达增高持续时间较长，照射后3 d靶区血管内皮细胞eNOS仍呈强阳性表达，照射后14 d靶区血管内皮细胞eNOS表达方恢复至正常对照组水平。靶远隔区脑组织血管内皮细胞eNOS免疫反应及eNOS mRNA杂交信号无异常改变。
表1 eNOS 免疫组化染色及原位杂交观察结果 照射后时间
结果
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靶区
靶周围区
靶远隔区
对照组
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照射后
2 h
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6 h
, 百拇医药
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注：+为“弱阳性”；
为“中度阳性”；为“强阳性”讨 论, http://www.100md.com
急性放射性脑水肿主要是血管源性脑水肿。血管源性脑水肿是由于血脑屏障受损、破坏，使毛细血管通透性增加，一些血浆大分子物质如蛋白等经血管壁渗透到细胞外液中，水分渗出增多，积聚于血管周围及细胞间隙所致[3]。毛细血管内皮及其紧密连接是血脑屏障的基本结构。Janjigro[4]等应用小片膜电压钳实验表明NO可以调整血脑屏障内皮细胞的高极化激活电流从而调节离子、营养物质和其他分子的跨血脑屏障转运，证实NO可能调节离体脑血管内皮细胞的通透性。作者实验发现，大剂量60Co γ刀照射后2 h靶区及靶周围区脑组织已出现血管源性脑水肿的病理改变，主要表现为微血管内皮细胞胞浆胞饮小囊泡增加，微绒毛形成增多，内皮细胞通透性增高等。这与Ridger[5]等报道的大剂量照射后2 h脑组织出现血脑屏障功能障碍及内皮细胞通透性增高的报道相符合。此时作者通过免疫组化染色及原位杂交发现照射区域血管内皮细胞eNOS表达有明显的增高。放射性脑水肿在照射后6 h趋于显著，照射后3 d达高峰。而血管内皮细胞eNOS表达增高持续时间亦较长，伴行于放射性脑水肿急性发展阶段。根据以上结果作者推测照射后血管内皮细胞eNOS表达增高与血脑屏障通透性增加及急性放射性脑水肿的发生发展有关。近年研究报道，NO与羟自由基(HO.)等超氧自由基反应生成超氧亚硝酸根离子(ONOO-)，导致血管内皮细胞损伤，可能是血脑屏障通透性增高的重要机理。eNOS表达增高后在脑血管内皮细胞中催化L-精氨酸产生大量NO，NO与超氧自由基反应生成ONOO-等具高度氧化活性的过氧亚硝酸阴离子。ONOO-可使内皮细胞膜上的重要组成成分含多聚不饱和脂肪酸较多的磷脂发生过氧化作用，使内皮细胞膜结构与功能受损，膜通透性增加[6]；ONOO-干扰内皮细胞三羧酸循环中关键酶的活性而造成内皮细胞能量代谢障碍，而使ATP产生减少，内皮形态构象改变，正常内皮细胞连接无法维持而致血脑屏障通透性增加[7]。另外NO还可介导缓激肽、白三烯、花生四烯酸等血管活性物质对微血管通透性的影响[8]。
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参考文献
1， Garthwaite J,Bovlton CL. Nitric oxide signaling in the central nervous system.Ann Rev Physiol,1995,57:683.
2， 蔡文琴，王伯纭.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术.成都：四川科学技术出版社，1994.421-422.
3， 彭家仪，马志忠.脑水肿的诊断与治疗.北京：人民军医出版社，1996.38.
4， Janjigro D, West GA, Nguyen TS, et al. Regulation of blood-brain barrier endothelial cells by nitric oxide. Cir Res,1994,75:528.
, 百拇医药
5， Ridger VC, Greenacre S,Handy R,et al. Effect of peroxynitrite on plasma extravasation, microvascular blood flow and nociception in the rat.Br J Pharmacol,1997,122:1083.
6， Crow JP,Beckman JS, Calum JG, et al. Reactions between nitric oxide, superoxide and peroxynitrite: footprints of peroxynitrite in vivo. Adv Pharmacol,1995,34:17-20.
7， Salzman AL, Andrew L, Micheal J,et al.Nitric oxide dilares tight junction and depletes ATP in cultured Cao-2BBe intestinal epithelial monolyers.Am J Physiol, 1995,268:G861-870.
8， Yuan Y,Granger HJ, Iawieja DC,et al. Histsamin increase veneular permeability via a phospholipase C-NO synthase guanylate cyclase cascade.Am J Physiol, 1993,264:H17354.
(收稿日期:1999-10-08), 百拇医药