RSP-CM对受不同剂量照射小鼠的疗效观察
作者：张霞 杨如俊 张新 杨云纺 金志军 项莺松
单位：张霞(200433 上海，第二军医大学放射医学教研室)；杨如俊(200433 上海，第二军医大学放射医学教研室)；张新(山东省新泰市第一人民医院传染科)；杨云纺(长征医院妇产科)；金志军(长征医院妇产科)；项莺松(200433 上海，第二军医大学放射医学教研室)
关键词：细胞因子；辐射损伤；小鼠
中华放射医学与防护杂志000404 【摘要】 目的 观察造血生长因子对受照射小鼠的防治作用。方法 用RSP-CM和LP3-CM来源的集落刺激因子治疗受不同剂量60Co γ射线照射的ICR小鼠。通过观察30 d存活率、死亡动物平均存活天数、保护系数及部分动物外周血白细胞计数、骨髓有核细胞计数和粒单系祖细胞集落培养，研究GM-CSF对受照射小鼠重建造血的疗效及量效、时效关系。结果 RSP-CM能显著提高7.5 Gy照射小鼠的存活率，而LP3-CM效果不显。提高剂量到8.0 Gy，只有RSP-CM治疗组有效。外周血WBC和BMC计数及祖细胞集落培养也显示治疗组优于预防组。8.5 Gy照射小鼠30 d内全部死亡，表明GM-CSF对大剂量照射小鼠疗效差。但从保护系数看，各实验组均有效，且存在量效、时效关系。结论 GM-CSF对受照射小鼠的骨髓损伤有促进造血恢复的作用，且存在量效、时效关系，单纯应用M-CSF则无效。
, http://www.100md.com
Radioprotective effect of RSP-CM on mice irradiated with different doses
ZHANG Xia, YANG Rujun,ZHANG Xin,et al.
(Department of Radiation Medicine,The Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)
【Abstract】 Objective To investigate the radioprotective effects of cytokines on hematopoietic impairment of irradiated mice. Methods Using RSP-CM and LP3-CM respectively originated GM-CSF and G-CSF to treat ICR mice irradiated with different doses of 60Co γ-rays.The 30-day survival rate of mice,the mean survival days of dead mice were determined and the numbers of peripheral white blood cells and BMC of part of the mice were counted.At the same time,GM clonogenic activity of BM was assayed. Results RSP-CM could effectively raise 30-day survival rate of mice irradiated with 7.5 Gy.However,LP3-CM had no obvious effect.Judging from the comparative survival ratio,only the RSP-CM treated group showed protective effect on the 8.0 Gy -irradiated mice.The 8.5 Gy-irradiated mice all died within 30 days,indicating that GM-CSF had weak effect on higher dose-irradiated mice. Conclusion GM-CSF can stimulate the hematopoietic system of irradiated mice,and has dose-effect and time-effect relations.M-CSF used singly has no obvious effect.
, 百拇医药
【Key words】 Cytokines; Radiation injury; Mice
细胞因子是由机体各种细胞合成和分泌的小分子多肽或蛋白，具有促进多种细胞增殖与分化、加速机体造血活动等多种功能。利用造血生长因子治疗急性辐射所致的骨髓损伤有较多的研究。但利用大鼠浆细胞株(RSP)纯化得到的粒单系集落刺激因子(GM-CSF)对放射损伤鼠的防护作用目前国内外尚少报道。本文作者应用RSP-CM，以受不同剂量照射小鼠为动物模型，着重研究了GM-CSF防治急性放射损伤的用药方式和剂量范围，现将结果报道如下。
材料和方法
1.GM-CSF的来源
(1)大鼠浆细胞株(RSP-2P3)的培养：大鼠浆细胞株由日本放射医学综合研究所色田斡雄博士惠赠。用IMDM培养液加5%马血清，培养RSP-2P3，一定时间后，收集培养上清(CM)，经合并离心去沉渣，低温保存备用。
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(2)RSP-CM活性测定：将上清以不同稀释度(20%～2.5%)作小鼠骨髓细胞CFU-GM的培养。测得每毫升RSP-CM为2 217单位(以美国学者Stanley赠给的部分纯化的L-cell的CSF-1为标准比较而得)[1]；集落经HE染色镜检，确认大部分为粒单系集落。
(3)小鼠成纤维细胞株(LP3)的培养及活性测定：小鼠成纤维细胞株由日本放射医学综合研究所色田斡雄博士惠赠。同上培养，收集上清，经离心去沉渣，作小鼠骨髓细胞CFU-GM测定，结果每毫升为2 368单位，所形成集落经染色确认为粒系集落，其中大部分为CFU-M[1]。
2.实验动物：ICR小鼠，体重18～28 g，雌雄各半，购自本校动物中心。各批实验动物为生后6～8周龄，体重相当，置于超净动物柜内，饲以消毒饼干和水。
3.实验分组
, 百拇医药
(1)低剂量照射：7.5 Gy照射小鼠，分为RSP-CM组、LP3-CM组及生理盐水对照组，全身接受照射，于照射前2 d至当天、照射后1 d至3 d，每天腹腔注射1次，每次 0.5 ml。
(2)中剂量照射：8.0 Gy照射小鼠，分为RSP防治、预防、治疗组及生理盐水对照组来观察存活率。用药途径及剂量同上，预防组于照射前2 d至当天，防治组于照射前2 d至照射后3 d，治疗组于照射后1、2和3 d用药。观察外周血白细胞变化分为RSP预防组、RSP治疗组、放射对照及正常对照组(10只)，用药同前，治疗组用药14 d。照射8.0 Gy，照射前及照射后抽尾静脉血作WBC计数、股骨髓BMC计数及粒单系祖细胞集落培养。
(3)大剂量照射：8.5 Gy照射组，依不同用药时间分为短期(照射后1 d至3 d)、中期(1 d至6 d)、长期(1 d至15 d)给药，长期给药又依不同用药剂量分3组。每组20只，体重23～28 g，用药途径同前。
, 百拇医药
4.照射条件：60Co γ射线照射源，受照射小鼠装在弧形的有机玻璃盒内，其中心点距地面1.1 m，距照射源1.5 m，吸收剂量率为1.54～1.45 Gy.min-1，吸收剂量7.5～8.5 Gy。
5.观察指标：受照射小鼠30 d存活率；死亡动物平均存活天数；计算保护系数(k)，即实验鼠30 d平均存活天数/对照鼠30 d平均存活天数。8.0 Gy照射小鼠，尾静脉取血用F-800微细胞计数仪作外周血WBC计数、股骨髓BMC计数及粒单系祖细胞集落培养。
6.数据统计学处理：采用单因素方差分析，计量资料用t检验，计数资料用χ2检验。
结 果
1.RSP-CM、LP3-CM对小鼠辐射损伤的疗效
, 百拇医药
全身照射7.5 Gy小鼠(n=20)，RSP防治组30 d存活率为100%，LP3组及对照组都为30%。RSP组与对照组存活率相比，差异有非常显著性(P<0.01)。死亡动物平均存活天数：LP3组及对照组分别为(14.3±0.78)d及(12.3±0.68)d，二者间差异无显著性(P>0.05)。RSP组及LP3组k值分别为1.7045与1.0795(一般认为k>1.25则有意义)。说明RSP组有明显疗效，LP3组未显效。
2.RSP-CM对小鼠辐射损伤的防治疗效观察
(1)存活率观察：动物全身吸收剂量为8.0 Gy。用药途径及用药剂量同上，预防组于照射前2 d至当天，防治组于照射前2 d至照射后3 d，治疗组于照射后1 d至3 d用药，见表1。动物的30 d存活率治疗组与对照组比，差异有非常显著性(P<0.01)，死亡动物平均存活天数治疗组与对照组比差异有显著性(P<0.05)，保护系数也只有RSP治疗组有效。
, 百拇医药
表1 RSP-CM对受照射小鼠的防治疗效 (
±s) 组别
样本数
n
30 d存活率
(%)
死亡动物平均
存活天数(d)
保护系数
(k)
对照组
20
, 百拇医药
30
10.0±1.91
—
RSP防治组
20
40
8.0±1.15
1.0500
RSP预防组
20
30
10.1±1.64
1.0062
, 百拇医药
RSP治疗组
20
80**
14.5±1.50*
1.6312
注：与对照组比，*P<0.05，**P<0.01
(2)外周血白细胞变化：ICR小鼠，分组及用药同前。吸收剂量为8.0 Gy，照射前及照射后抽尾静脉血，F-800微细胞计数仪作WBC计数。结果见图1。
图1 受照射小鼠外周血细胞总数变化
, 百拇医药
由图1可见，3个照射实验组都是照射后至第3天急剧下降，白细胞总数降至最低值；治疗组的白细胞下降速度明显慢于其他两组，白细胞最低值亦明显高于其他两组。由开始回升至照射后18 d，治疗组与预防组比较，也有明显差别。总之，外周血白细胞变化，是治疗组优于预防组，即治疗组下降的慢，回升的快，说明GM-CSF对外周血白细胞下降在照射早期有防护作用，恢复期有促进作用。
(3)BMC计数：ICR小鼠，体重20～25 g，分组及用药同前。照射后7、14和21 d分别取股骨髓作有核细胞计数(表2)，同时作BMC粒单系祖细胞集落培养(图2)。
表2 受照射小鼠股骨髓有核细胞计数 组别
样本数n
BMC(×105/支股骨，±s)
, 百拇医药
7 d
14 d
21 d
正常对照组
20
134.0±13.4
180.7±8.4
115.3±5.1
RSP预防组
20
42.8±5.4
87.7±3.0
, 百拇医药 109.8±24.2
RSP治疗组
20
85.0±3.5*
178.0±9.2**
128.0±7.6
照射对照组
20
43.6±3.2
150.3±3.2
118.0±8.4
注：治疗组与预防组及照射对照组比，*P<0.05，**P<0.01 照射后7 d，治疗组与预防组及照射对照组比较差异有显著性(P<0.05)，照射后14 d，差异有非常显著性(P<0.01)，照射后21 d，各实验组与正常对照组比，差异无显著性(P>0.05)，表示各实验组BMC均恢复达正常水平。
, 百拇医药
(4)粒单系造血祖细胞集落培养：取受试小鼠股骨髓有核细胞按每毫升体系1×105，接种于含20%马血清，20%体积的1%的琼脂，GM-CSF 20 ng*ml-1，50 ng*ml-1，20%单倍，20%双倍McCoy'5A培养基，混匀后置于24孔培养板，37℃，体积分数为5%的CO2及饱和湿度下培养7 d，计数CFU-GM。结果见图2。可见，照射后7和14 d骨髓祖细胞CFU-GM集落形成能力明显高于预防组及照射对照组，与正常对照组相似。预防组与照射对照组差异无显著
图2 受照小鼠骨髓有核细胞粒单系集落数
性。照射后21 d，各实验组与正常对照组比差异无显著性，表明各实验组已恢复。
3.不同用药时间及用药剂量RSP-CM对受照射小鼠的疗效
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(1)不同用药时间：ICR小鼠，全身照射剂量为8.5 Gy，吸收剂量率为1.54～1.45 Gy*min-1，RSP-CM用量为每只0.5 ml，30 d内实验动物全部死亡，各实验组与对照组比较，分别延长存活天数，差异有显著性。从保护系数看，各实验组均显示有疗效。各实验组间两两比较，差异无显著性，说明RSP-CM疗效随用药时间延长，效果显著(见表3)。
(2)不同用药剂量：ICR小鼠，全身照射剂量为8.5 Gy，吸收剂量率为1.54～1.45 Gy*min-1，RSP-CM用药15 d，在30 d内实验动物全部死亡，死亡动物平均存活天数各实验组与对照组比差异均有显著性，P<0.05或P<0.01，见表4。保护系数只有大、中药物剂量组疗效明显。各实验组间两两比较，差异有显著性，说明RSP-CM疗效用药剂量越大，效果越显著。
表3 实验动物给药0.5 ml/只时
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不同用药时间组RSP-CM疗效(±s) 组别
用药天数(d)
死亡动物平均
存活天数(d)
保护系数
(k)
对照组
8.3±0.7
-
A
1～3
, 百拇医药
9.5±0.6*
1.3194
B
1～6
13.0±0.6*△▲
1.4130
C
1～15
14.7±1.2**△
1.3868
注：A、B、C组与对照组比，*P<0.05，**P<0.01；B、C组与A组比，ΔP<0.05；B组与C组比，▲P<0.05；n=20表4 实验动物用药15 d时不同用药剂量组RSP-CM疗效
, 百拇医药
(±s) 组别
用药剂量
(ml)
死亡动物平均
存活天数(d)
保护系数
(k)
对照组
—
10.6±0.7
—
A
, 百拇医药
0.5
14.7±1.2**
1.3868
B
0.3
13.5±0.8*△▲
1.2736
C
0.1
12.5±1.0*△
1.1792
注：A、B、C组与对照组比，*P<0.05，**P<0.01；B、C组与A组比，ΔP<0.05；B组与C组比，▲P<0.05；n=20讨 论
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1.GM-CSF抗小鼠的辐射损伤剂量范围：GM-CSF与M-CSF分别从RSP-2P3细胞株培养上清液(RSP-CM)及LP3细胞株培养上清(LP3-CM)中得到。从实验结果可见二者对造血系损伤的防护作用存在明显差别。7.5 Gy照射小鼠，用GM-CSF防治，全部存活，而M-CSF无效。8.0 Gy照射小鼠，用GM-CSF防治组和预防组的结果，同对照组比未显示疗效，而治疗组则有效；外周血白细胞变化和BMC计数及祖细胞集落培养也显示治疗组均优于预防组及对照组。说明GM-CSF对受照射小鼠的造血在照射早期有防护作用，恢复期有促进作用。8.5 Gy照射的小鼠，用GM-CSF治疗，均未能提高存活率，仅延长存活时间，表明GM-CSF对大剂量照射小鼠疗效相对较差。但延长用药时间或加大用药剂量可延长存活时间。表明二者间存在量效、时效关系。
2.GM-CSF对辐射损伤的作用机理：GM-CSF是一种由机体多种细胞合成或分泌的小分子多肽，在体内含量少，但具有多种功能。它可通过与靶细胞表面少量高亲和力的特异性受体结合而发挥作用。造血型急性放射病主要是造血功能障碍，障碍程度与受照剂量有关，当照射剂量较低时，残存的造血干、祖细胞较多，靶细胞表面的细胞因子受体破坏少，因而只要给予一定的造血生长因子，就能促进造血功能的恢复。当剂量增加到一定程度时，残留的造血干、祖细胞已不足于自身重建造血，再用造血生长因子也无济于事。预防用药不如治疗用药的可能原因，是预防用药促使照射前造血细胞增殖活跃大量祖细胞从G0转入G1期，较多的放射敏感细胞在照射时被杀伤，不利于造血的恢复。
, 百拇医药
3.用药方式对疗效有重要影响：如前所述预防用药不如治疗用药；另一方面造血生长因子在体内的生物半衰期短，故如何在造血重建之前设法维持其在体内的浓度，是发挥其作用的关键，有待于进一步探讨。
4.临床上恶性肿瘤的治疗，除了传统的手术方法外，放疗和化疗日益受到重视。但放、化疗的最严重副作用之一是骨髓抑制导致全血细胞减少或粒细胞、血小板严重降低，从而引发不易控制的感染或出血。而输注粒细胞或血小板同样有严重的副作用发生。利用造血生长因子治疗急性放射所导致的骨髓损伤副作用小，目前研究较多。Neta等研究发现IL-1、TNF-α具有辐射防护作用[2-4]，IFN-γ和CSF、IL-3可明显提高经致死剂量照射小鼠的存活率，对受照射小鼠的造血系统具有防护作用[5，6]。大量动物实验也证明重组M-CSF和GM-CSF不仅能刺激正常机体的造血活动，同样具有加速受照射动物重建造血的功能[7，8]。受致死剂量或亚致死剂量60Co γ射线照射的小鼠造血系统的损伤与临床卵巢癌化、放疗对造血系的损伤有相类似的病理过程。本实验利用这一动物模型，首次利用RSP-CM，着重研究了GM-CSF对受照射小鼠造血系统的防治作用，为临床上各种血液病及各系统恶性肿瘤放、化疗后的造血支持治疗提供了实验依据。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39600077)
参考文献
1， 杨如俊，张明华，朱世英，等.LP3细胞系分泌CSF的影响因素及活性测定.第二军医大学学报，1989，10：375-378.
2， Neta R，Oppenheim JJ,Wang JM,et al.Synergy of IL-1 and stem cell factor in radioprotective of mice is associated with IL-1 up ragulation of mRNA and protein expression for c-kit on bone marrow cells.J Immunol,1994,153:1536-1543.
3， Vavrova J.Role of IL-1 and TNF in the ribomunyl-induced radio-protection.Folia Biol Praha,1995,41:23-30.
, 百拇医药
4， Baier JE,Neumann HA,Moeller T,et al.Radiation protective through cytokin release by n-acetylcysteine.Strahlenther Onkol,1996,172:91-98.
5， Wu DD,Bosch B,Keating A,et al.Hematopoitic cytokines enhance survival of SCID mice undergoing high dose irradiation.Exp Hematol,1994,22:202-207.
6， Hudak S,Leach MW,Xu Y,et al.Radioprotective effects of flk-2/flk-3 ligand.Exp Hematol,1998,26:515-522.
7， Kadar E,Sureda A,Mangues MA,et al.Serum levels of G-CSF IL-3 IL-6 and GM-CSF after a single introperitoneal dose of rhG-CSF in lethally irradiated B6D2F1 mice.Acta Haematol,1997,98:119-124.
8， Kyoizumi S,Mccune JM,Namikawa R.Direct evaluation of radiation damage in human hematopoitic progenitor cells in vivo.Radiat Res,1994,137:76-83.
(收稿日期:1999-10-29), 百拇医药
单位：张霞(200433 上海，第二军医大学放射医学教研室)；杨如俊(200433 上海，第二军医大学放射医学教研室)；张新(山东省新泰市第一人民医院传染科)；杨云纺(长征医院妇产科)；金志军(长征医院妇产科)；项莺松(200433 上海，第二军医大学放射医学教研室)
关键词：细胞因子；辐射损伤；小鼠
中华放射医学与防护杂志000404 【摘要】 目的 观察造血生长因子对受照射小鼠的防治作用。方法 用RSP-CM和LP3-CM来源的集落刺激因子治疗受不同剂量60Co γ射线照射的ICR小鼠。通过观察30 d存活率、死亡动物平均存活天数、保护系数及部分动物外周血白细胞计数、骨髓有核细胞计数和粒单系祖细胞集落培养，研究GM-CSF对受照射小鼠重建造血的疗效及量效、时效关系。结果 RSP-CM能显著提高7.5 Gy照射小鼠的存活率，而LP3-CM效果不显。提高剂量到8.0 Gy，只有RSP-CM治疗组有效。外周血WBC和BMC计数及祖细胞集落培养也显示治疗组优于预防组。8.5 Gy照射小鼠30 d内全部死亡，表明GM-CSF对大剂量照射小鼠疗效差。但从保护系数看，各实验组均有效，且存在量效、时效关系。结论 GM-CSF对受照射小鼠的骨髓损伤有促进造血恢复的作用，且存在量效、时效关系，单纯应用M-CSF则无效。
, http://www.100md.com
Radioprotective effect of RSP-CM on mice irradiated with different doses
ZHANG Xia, YANG Rujun,ZHANG Xin,et al.
(Department of Radiation Medicine,The Second Military Medical University,Shanghai 200433,China)
【Abstract】 Objective To investigate the radioprotective effects of cytokines on hematopoietic impairment of irradiated mice. Methods Using RSP-CM and LP3-CM respectively originated GM-CSF and G-CSF to treat ICR mice irradiated with different doses of 60Co γ-rays.The 30-day survival rate of mice,the mean survival days of dead mice were determined and the numbers of peripheral white blood cells and BMC of part of the mice were counted.At the same time,GM clonogenic activity of BM was assayed. Results RSP-CM could effectively raise 30-day survival rate of mice irradiated with 7.5 Gy.However,LP3-CM had no obvious effect.Judging from the comparative survival ratio,only the RSP-CM treated group showed protective effect on the 8.0 Gy -irradiated mice.The 8.5 Gy-irradiated mice all died within 30 days,indicating that GM-CSF had weak effect on higher dose-irradiated mice. Conclusion GM-CSF can stimulate the hematopoietic system of irradiated mice,and has dose-effect and time-effect relations.M-CSF used singly has no obvious effect.
, 百拇医药
【Key words】 Cytokines; Radiation injury; Mice
细胞因子是由机体各种细胞合成和分泌的小分子多肽或蛋白，具有促进多种细胞增殖与分化、加速机体造血活动等多种功能。利用造血生长因子治疗急性辐射所致的骨髓损伤有较多的研究。但利用大鼠浆细胞株(RSP)纯化得到的粒单系集落刺激因子(GM-CSF)对放射损伤鼠的防护作用目前国内外尚少报道。本文作者应用RSP-CM，以受不同剂量照射小鼠为动物模型，着重研究了GM-CSF防治急性放射损伤的用药方式和剂量范围，现将结果报道如下。
材料和方法
1.GM-CSF的来源
(1)大鼠浆细胞株(RSP-2P3)的培养：大鼠浆细胞株由日本放射医学综合研究所色田斡雄博士惠赠。用IMDM培养液加5%马血清，培养RSP-2P3，一定时间后，收集培养上清(CM)，经合并离心去沉渣，低温保存备用。
, http://www.100md.com
(2)RSP-CM活性测定：将上清以不同稀释度(20%～2.5%)作小鼠骨髓细胞CFU-GM的培养。测得每毫升RSP-CM为2 217单位(以美国学者Stanley赠给的部分纯化的L-cell的CSF-1为标准比较而得)[1]；集落经HE染色镜检，确认大部分为粒单系集落。
(3)小鼠成纤维细胞株(LP3)的培养及活性测定：小鼠成纤维细胞株由日本放射医学综合研究所色田斡雄博士惠赠。同上培养，收集上清，经离心去沉渣，作小鼠骨髓细胞CFU-GM测定，结果每毫升为2 368单位，所形成集落经染色确认为粒系集落，其中大部分为CFU-M[1]。
2.实验动物：ICR小鼠，体重18～28 g，雌雄各半，购自本校动物中心。各批实验动物为生后6～8周龄，体重相当，置于超净动物柜内，饲以消毒饼干和水。
3.实验分组
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(1)低剂量照射：7.5 Gy照射小鼠，分为RSP-CM组、LP3-CM组及生理盐水对照组，全身接受照射，于照射前2 d至当天、照射后1 d至3 d，每天腹腔注射1次，每次 0.5 ml。
(2)中剂量照射：8.0 Gy照射小鼠，分为RSP防治、预防、治疗组及生理盐水对照组来观察存活率。用药途径及剂量同上，预防组于照射前2 d至当天，防治组于照射前2 d至照射后3 d，治疗组于照射后1、2和3 d用药。观察外周血白细胞变化分为RSP预防组、RSP治疗组、放射对照及正常对照组(10只)，用药同前，治疗组用药14 d。照射8.0 Gy，照射前及照射后抽尾静脉血作WBC计数、股骨髓BMC计数及粒单系祖细胞集落培养。
(3)大剂量照射：8.5 Gy照射组，依不同用药时间分为短期(照射后1 d至3 d)、中期(1 d至6 d)、长期(1 d至15 d)给药，长期给药又依不同用药剂量分3组。每组20只，体重23～28 g，用药途径同前。
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4.照射条件：60Co γ射线照射源，受照射小鼠装在弧形的有机玻璃盒内，其中心点距地面1.1 m，距照射源1.5 m，吸收剂量率为1.54～1.45 Gy.min-1，吸收剂量7.5～8.5 Gy。
5.观察指标：受照射小鼠30 d存活率；死亡动物平均存活天数；计算保护系数(k)，即实验鼠30 d平均存活天数/对照鼠30 d平均存活天数。8.0 Gy照射小鼠，尾静脉取血用F-800微细胞计数仪作外周血WBC计数、股骨髓BMC计数及粒单系祖细胞集落培养。
6.数据统计学处理：采用单因素方差分析，计量资料用t检验，计数资料用χ2检验。
结 果
1.RSP-CM、LP3-CM对小鼠辐射损伤的疗效
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全身照射7.5 Gy小鼠(n=20)，RSP防治组30 d存活率为100%，LP3组及对照组都为30%。RSP组与对照组存活率相比，差异有非常显著性(P<0.01)。死亡动物平均存活天数：LP3组及对照组分别为(14.3±0.78)d及(12.3±0.68)d，二者间差异无显著性(P>0.05)。RSP组及LP3组k值分别为1.7045与1.0795(一般认为k>1.25则有意义)。说明RSP组有明显疗效，LP3组未显效。
2.RSP-CM对小鼠辐射损伤的防治疗效观察
(1)存活率观察：动物全身吸收剂量为8.0 Gy。用药途径及用药剂量同上，预防组于照射前2 d至当天，防治组于照射前2 d至照射后3 d，治疗组于照射后1 d至3 d用药，见表1。动物的30 d存活率治疗组与对照组比，差异有非常显著性(P<0.01)，死亡动物平均存活天数治疗组与对照组比差异有显著性(P<0.05)，保护系数也只有RSP治疗组有效。
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表1 RSP-CM对受照射小鼠的防治疗效 (
±s) 组别样本数
n
30 d存活率
(%)
死亡动物平均
存活天数(d)
保护系数
(k)
对照组
20
, 百拇医药
30
10.0±1.91
—
RSP防治组
20
40
8.0±1.15
1.0500
RSP预防组
20
30
10.1±1.64
1.0062
, 百拇医药
RSP治疗组
20
80**
14.5±1.50*
1.6312
注：与对照组比，*P<0.05，**P<0.01
(2)外周血白细胞变化：ICR小鼠，分组及用药同前。吸收剂量为8.0 Gy，照射前及照射后抽尾静脉血，F-800微细胞计数仪作WBC计数。结果见图1。
图1 受照射小鼠外周血细胞总数变化
, 百拇医药
由图1可见，3个照射实验组都是照射后至第3天急剧下降，白细胞总数降至最低值；治疗组的白细胞下降速度明显慢于其他两组，白细胞最低值亦明显高于其他两组。由开始回升至照射后18 d，治疗组与预防组比较，也有明显差别。总之，外周血白细胞变化，是治疗组优于预防组，即治疗组下降的慢，回升的快，说明GM-CSF对外周血白细胞下降在照射早期有防护作用，恢复期有促进作用。
(3)BMC计数：ICR小鼠，体重20～25 g，分组及用药同前。照射后7、14和21 d分别取股骨髓作有核细胞计数(表2)，同时作BMC粒单系祖细胞集落培养(图2)。
表2 受照射小鼠股骨髓有核细胞计数 组别
样本数n
BMC(×105/支股骨，
±s), 百拇医药
7 d
14 d
21 d
正常对照组
20
134.0±13.4
180.7±8.4
115.3±5.1
RSP预防组
20
42.8±5.4
87.7±3.0
, 百拇医药 109.8±24.2
RSP治疗组
20
85.0±3.5*
178.0±9.2**
128.0±7.6
照射对照组
20
43.6±3.2
150.3±3.2
118.0±8.4
注：治疗组与预防组及照射对照组比，*P<0.05，**P<0.01 照射后7 d，治疗组与预防组及照射对照组比较差异有显著性(P<0.05)，照射后14 d，差异有非常显著性(P<0.01)，照射后21 d，各实验组与正常对照组比，差异无显著性(P>0.05)，表示各实验组BMC均恢复达正常水平。
, 百拇医药
(4)粒单系造血祖细胞集落培养：取受试小鼠股骨髓有核细胞按每毫升体系1×105，接种于含20%马血清，20%体积的1%的琼脂，GM-CSF 20 ng*ml-1，50 ng*ml-1，20%单倍，20%双倍McCoy'5A培养基，混匀后置于24孔培养板，37℃，体积分数为5%的CO2及饱和湿度下培养7 d，计数CFU-GM。结果见图2。可见，照射后7和14 d骨髓祖细胞CFU-GM集落形成能力明显高于预防组及照射对照组，与正常对照组相似。预防组与照射对照组差异无显著
图2 受照小鼠骨髓有核细胞粒单系集落数
性。照射后21 d，各实验组与正常对照组比差异无显著性，表明各实验组已恢复。
3.不同用药时间及用药剂量RSP-CM对受照射小鼠的疗效
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(1)不同用药时间：ICR小鼠，全身照射剂量为8.5 Gy，吸收剂量率为1.54～1.45 Gy*min-1，RSP-CM用量为每只0.5 ml，30 d内实验动物全部死亡，各实验组与对照组比较，分别延长存活天数，差异有显著性。从保护系数看，各实验组均显示有疗效。各实验组间两两比较，差异无显著性，说明RSP-CM疗效随用药时间延长，效果显著(见表3)。
(2)不同用药剂量：ICR小鼠，全身照射剂量为8.5 Gy，吸收剂量率为1.54～1.45 Gy*min-1，RSP-CM用药15 d，在30 d内实验动物全部死亡，死亡动物平均存活天数各实验组与对照组比差异均有显著性，P<0.05或P<0.01，见表4。保护系数只有大、中药物剂量组疗效明显。各实验组间两两比较，差异有显著性，说明RSP-CM疗效用药剂量越大，效果越显著。
表3 实验动物给药0.5 ml/只时
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不同用药时间组RSP-CM疗效(
±s) 组别用药天数(d)
死亡动物平均
存活天数(d)
保护系数
(k)
对照组
8.3±0.7
-
A
1～3
, 百拇医药
9.5±0.6*
1.3194
B
1～6
13.0±0.6*△▲
1.4130
C
1～15
14.7±1.2**△
1.3868
注：A、B、C组与对照组比，*P<0.05，**P<0.01；B、C组与A组比，ΔP<0.05；B组与C组比，▲P<0.05；n=20表4 实验动物用药15 d时不同用药剂量组RSP-CM疗效
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(
±s) 组别用药剂量
(ml)
死亡动物平均
存活天数(d)
保护系数
(k)
对照组
—
10.6±0.7
—
A
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0.5
14.7±1.2**
1.3868
B
0.3
13.5±0.8*△▲
1.2736
C
0.1
12.5±1.0*△
1.1792
注：A、B、C组与对照组比，*P<0.05，**P<0.01；B、C组与A组比，ΔP<0.05；B组与C组比，▲P<0.05；n=20讨 论
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1.GM-CSF抗小鼠的辐射损伤剂量范围：GM-CSF与M-CSF分别从RSP-2P3细胞株培养上清液(RSP-CM)及LP3细胞株培养上清(LP3-CM)中得到。从实验结果可见二者对造血系损伤的防护作用存在明显差别。7.5 Gy照射小鼠，用GM-CSF防治，全部存活，而M-CSF无效。8.0 Gy照射小鼠，用GM-CSF防治组和预防组的结果，同对照组比未显示疗效，而治疗组则有效；外周血白细胞变化和BMC计数及祖细胞集落培养也显示治疗组均优于预防组及对照组。说明GM-CSF对受照射小鼠的造血在照射早期有防护作用，恢复期有促进作用。8.5 Gy照射的小鼠，用GM-CSF治疗，均未能提高存活率，仅延长存活时间，表明GM-CSF对大剂量照射小鼠疗效相对较差。但延长用药时间或加大用药剂量可延长存活时间。表明二者间存在量效、时效关系。
2.GM-CSF对辐射损伤的作用机理：GM-CSF是一种由机体多种细胞合成或分泌的小分子多肽，在体内含量少，但具有多种功能。它可通过与靶细胞表面少量高亲和力的特异性受体结合而发挥作用。造血型急性放射病主要是造血功能障碍，障碍程度与受照剂量有关，当照射剂量较低时，残存的造血干、祖细胞较多，靶细胞表面的细胞因子受体破坏少，因而只要给予一定的造血生长因子，就能促进造血功能的恢复。当剂量增加到一定程度时，残留的造血干、祖细胞已不足于自身重建造血，再用造血生长因子也无济于事。预防用药不如治疗用药的可能原因，是预防用药促使照射前造血细胞增殖活跃大量祖细胞从G0转入G1期，较多的放射敏感细胞在照射时被杀伤，不利于造血的恢复。
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3.用药方式对疗效有重要影响：如前所述预防用药不如治疗用药；另一方面造血生长因子在体内的生物半衰期短，故如何在造血重建之前设法维持其在体内的浓度，是发挥其作用的关键，有待于进一步探讨。
4.临床上恶性肿瘤的治疗，除了传统的手术方法外，放疗和化疗日益受到重视。但放、化疗的最严重副作用之一是骨髓抑制导致全血细胞减少或粒细胞、血小板严重降低，从而引发不易控制的感染或出血。而输注粒细胞或血小板同样有严重的副作用发生。利用造血生长因子治疗急性放射所导致的骨髓损伤副作用小，目前研究较多。Neta等研究发现IL-1、TNF-α具有辐射防护作用[2-4]，IFN-γ和CSF、IL-3可明显提高经致死剂量照射小鼠的存活率，对受照射小鼠的造血系统具有防护作用[5，6]。大量动物实验也证明重组M-CSF和GM-CSF不仅能刺激正常机体的造血活动，同样具有加速受照射动物重建造血的功能[7，8]。受致死剂量或亚致死剂量60Co γ射线照射的小鼠造血系统的损伤与临床卵巢癌化、放疗对造血系的损伤有相类似的病理过程。本实验利用这一动物模型，首次利用RSP-CM，着重研究了GM-CSF对受照射小鼠造血系统的防治作用，为临床上各种血液病及各系统恶性肿瘤放、化疗后的造血支持治疗提供了实验依据。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39600077)
参考文献
1， 杨如俊，张明华，朱世英，等.LP3细胞系分泌CSF的影响因素及活性测定.第二军医大学学报，1989，10：375-378.
2， Neta R，Oppenheim JJ,Wang JM,et al.Synergy of IL-1 and stem cell factor in radioprotective of mice is associated with IL-1 up ragulation of mRNA and protein expression for c-kit on bone marrow cells.J Immunol,1994,153:1536-1543.
3， Vavrova J.Role of IL-1 and TNF in the ribomunyl-induced radio-protection.Folia Biol Praha,1995,41:23-30.
, 百拇医药
4， Baier JE,Neumann HA,Moeller T,et al.Radiation protective through cytokin release by n-acetylcysteine.Strahlenther Onkol,1996,172:91-98.
5， Wu DD,Bosch B,Keating A,et al.Hematopoitic cytokines enhance survival of SCID mice undergoing high dose irradiation.Exp Hematol,1994,22:202-207.
6， Hudak S,Leach MW,Xu Y,et al.Radioprotective effects of flk-2/flk-3 ligand.Exp Hematol,1998,26:515-522.
7， Kadar E,Sureda A,Mangues MA,et al.Serum levels of G-CSF IL-3 IL-6 and GM-CSF after a single introperitoneal dose of rhG-CSF in lethally irradiated B6D2F1 mice.Acta Haematol,1997,98:119-124.
8， Kyoizumi S,Mccune JM,Namikawa R.Direct evaluation of radiation damage in human hematopoitic progenitor cells in vivo.Radiat Res,1994,137:76-83.
(收稿日期:1999-10-29), 百拇医药