诺维本联合放射对人鼻咽癌离体细胞系的作用
作者：戴惠芳 张鸿未 陈旭峰 钱丽娟 胡福军
单位：310022 杭州，浙江省肿瘤医院
关键词：
中华放射医学与防护杂志000516 诺维本(Navelbine,NVB)是一个半合成的长春花生物碱，主要作用于有丝分裂微管，对轴突微管的神经毒性较小[1]，故被认为是有效和安全的抗癌药物。由于其独特的作用机理-阻滞微管蛋白的聚合，我们用人鼻咽癌细胞系(CNE)进行了NVB联合放射对细胞离体增殖抑制作用及细胞凋亡的研究，发现两者联合作用能提前引起细胞凋亡，并进一步加速诱导细胞的死亡。
一、材料和方法
1.材料：细胞：人鼻咽癌细胞系(CNE)，上海肿瘤医院放射生物室赠送，RPMI-1640培养液含10%小牛血清，37℃单层贴壁生长。药物：诺维本(Pierre Fabre.Co.)照射条件：60Co γ射线，SSD 80 cm，射野35 cm×35 cm，吸收剂量率120 cGy/min。
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2.方法
(1)药物对细胞的抑制：取对数生长期的CNE细胞，制成单细胞悬液(1×105/ml)，10 μl/孔细胞悬液加入到96孔培养板，体积分数为5%CO2孵箱培养24 h后，用无血清培液使细胞同步化，48 h后，换含不同浓度(20、40、60、80、100 μmol/L)药物的培养液、24 h后每孔加10 μl MTT(5 mg/ml)液，继续培养4～6 h后，加100 μl酸化异丙醇中止反应，震荡10 min，酶标仪(Clini Bio 400 ATC)570 nm测量A值，并求其抑制率。
抑制率(%)=(1-实验组平均A值/对照组平均A值)×100
(2)药物对细胞作用的时间依赖性
将3×105/瓶及1×104/孔细胞悬液分别接种到有盖片的25 ml培养瓶及96孔板中，细胞经上述同步化后，分别加入不同浓度(20、60 μmol/L)的NVB，培养至4、8、12、24、48、72 h后，分别进行以下各指标检测：①药物对细胞抑制的时间依赖性：用MTT法检测，方法同前。②细胞核分裂指数：在上述不同的时间各取一片盖片固定于95%酒精中，H.E.染色后，高倍镜下计数2000个细胞，计算核分裂指数。③流式细胞术的细胞周期分析：各组按常规的流式细胞术检测法收集并固定细胞；检测前细胞经200 g离心后，倾去上清，按顺序加入A(含胰酶等)，B(含胰酶抑制剂及RNase A)，C(含PI)液各10 min，(A，B，C液B.D.inc.U.S.A.)，流式细胞仪(FACS Calibur,B.D.U.S.A.)检测PI标记的细胞核。
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(3)药物联合放射对细胞凋亡的影响
取对数生长期的细胞，以1×105/ml细胞共3 ml/瓶等量接种在25 ml培养瓶中，细胞按上述同步化后，随机分组：①对照组(C)；②单纯放射组(R)：一次600 cGy照射；③单纯药物组(N)：NVB (20 μm)作用24 h后，置以新鲜培液培养；④药物加放射组(N+R)：NVB (20 μmol/L)作用24 h，接着一次600 cGy照射后，置以新鲜培液培养。
流式细胞术的细胞凋亡分析：经药物及放射处理后0、4、24、48、72 h时，分别收集各组细胞，按上述流式细胞术方法处理并分析各组细胞的凋亡小峰。
DNA琼脂糖电泳检测：上述在不同时间收集的各组细胞，经PBS洗涤后悬浮于0.1 ml的裂解缓冲液(5 mmol/L Tris-HCl pH 8，0.25% NP-40,1 mmol/L EDTA,10 mg/ml RNase),37℃水浴1 h，再加入蛋白酶K(20 mg/ml)2.5 μl，37℃水浴再孵育1～2 h，结束后取15 μl上样液，在1.5%琼脂糖凝胶上，60 V稳压条件下电泳1.5 h，溴乙啶染色并在紫外透射光源下观察。
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二、结果和讨论
1.药物对细胞的抑制
用MTT比色法检测不同浓度(20、40、60、80、100 μmol/L)的NVB对细胞的抑制，作用24 h后，其抑制率分别为6.15、20.8、51.95、76.2和90.9%。ID50为60.71 μmol/L。
2.药物对细胞作用的时间依赖性
(1)药物对细胞抑制的时间依赖性
用MTT法检测结果，NVB低浓度(20 μmol/L)时，基本上无明显的抑制作用，而在高浓度时(60 μmol/L)具明显的时间依赖性，见图1。
, 百拇医药 图1 药物对细胞抑制时间关系
(2)药物对细胞核分裂指数的影响
从图2可见，与对照组相比，低浓度的NVB(20 μmol/L)作用至8 h时细胞的核分裂相明显增加，但随着药物持续时间的增加，细胞的核分裂相迅速减少。高浓度的NVB(60 μmol/L)在作用的早期就明显抑制细胞生长。
图2 药物对细胞核分裂指数的影响
(3)流式细胞术的细胞周期分析
从流式细胞术的细胞周期分析结果发现(图3)，低浓度(20 μmol/L)的NVB作用至12 h后，G2+M相细胞明显高于对照组，综合图2结果分析，NVB(20 μmol/L)主要使该细胞阻滞于G2期，而使G2进入M期的细胞明显减少。在高浓度时(60 μmol/L)主要以不可逆的直接杀伤效应作用于该细胞。
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图3 药物对(G2+M)期细胞比例的影响
(3)药物联合放射对细胞凋亡的影响
通过高分子量DNA琼脂糖电泳及流式细胞术检测发现，20 μmol/L NVB作用24 h后，继续培养，24 h开始出现DNA 梯状和凋亡小峰，但至48 h DNA 梯状不明显；单纯600 cGy照射后的细胞，至72 h才出现DNA “Ladder”及凋亡小峰，而经NVB (20 μm)作用24 h后再经600 cGy照射的细胞，即刻至72 h均出现DNA 梯状条带及凋亡小峰(见图4、5)。
各组细胞在不同时间内的平均凋亡 %分别为：C组5.214±4.470，R组6.116±6.663，N组10.07±9.053，(N+R)组17.68±8.967，经统计学分析，(N+R)组与C组和R组相比，P均<0.05。
我们的研究结果发现，当一定浓度的诺维本作用于CNE细胞24 h后，对细胞生长的抑制呈一定的剂量依赖性关系。从细胞有丝分裂及流式细胞术检测的(G2+M)期细胞的比例发现NVB作用的靶点是G2期，从而进一步证实了NVB致使微管蛋白解聚的作用机理，这与Bine[4]的报道相似。
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由于诺维本主要作用于细胞G2期，故为细胞周期特异性药物，而G2期细胞对射线最敏感，所以二者合用有一定的协同效应，即增强放射线的敏感性。Edelstein[5]等也发现，诺维本能增强射线对人小细胞肺癌细胞系(NCI-H460)的敏感性。我们从流式细胞术的细胞凋亡分析结果也发现，单纯诺维本或放射导致的细胞程序性死亡(Apoptosis)都有一定的时间性和局限性，且单纯600 cGy照射后的细胞，至72 h才出现明显的凋亡小峰及DNA梯状条带，而经诺维本联合放射作用后的细胞，即刻至72 h均出现了凋亡小峰及DNA 梯状条带，可见诺维本联合放射能提前引起细胞进入凋亡状态，且这种迅速引起的凋亡诱导作用具有较长的时间延续性，从而最终导致细胞的不可逆死亡，表明在细胞离体生长状态下，诺维本除了诱导细胞生长阻止在G2期，从而增加细胞对放射的敏感性及自身对细胞的凋亡诱导作用外，并能增强辐射对细胞凋亡的诱导作用。
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图4 PI-流式细胞术检测细胞周期分布及凋亡小峰
图5 大分子量DNA琼脂糖电泳结果，示DNA“Ladder”的形成
a.L-1-5示对照组细胞DNA电泳结果 R-1-5示单纯放射后0、4、24、48、72 h细胞DNA电泳结果 b.L-1-5示NVB作用后0、4、24、48、72 h后细胞DNA电泳结果 R-1-5示NVB联合放射作用后0、4、24、48、72 h细胞DNA电泳结果
参考文献
1，Binet S,Fellous A,Lataste H,et al.In situ analysis of the action of Navelbine on various types of microtubules using immunofluorescence.Semin Oncol,1989,16(Suppl 4):5-8.
, http://www.100md.com
2，Johnson SA,Harper P,Hortobsgyi GN,et al.Vinorelbine:an overview.Can Treat Rev,1996,22:127-142.
3，张湘如，孙燕.新抗肿瘤药异长春花碱.北京医学，1992，14：168-193.
4，Binet S,Chaineau E,Fellous A,et al.Immunofluorecence study of the action of Navelbine,Vincristine and Vinblastine on mitotic and axonal microtubules.Int J Cancer,1990,46:262-266.
5，Edelstein MP,Wolfe LA,Duch D S.Potentiation of radiotherapy by Navelbine (NVB) in human non-small cell lung cancer (NSCLC) line.Proc Am Ass Cancer Res,1995,36:A3637.
(收稿日期:1999-12-11), 百拇医药
单位：310022 杭州，浙江省肿瘤医院
关键词：
中华放射医学与防护杂志000516 诺维本(Navelbine,NVB)是一个半合成的长春花生物碱，主要作用于有丝分裂微管，对轴突微管的神经毒性较小[1]，故被认为是有效和安全的抗癌药物。由于其独特的作用机理-阻滞微管蛋白的聚合，我们用人鼻咽癌细胞系(CNE)进行了NVB联合放射对细胞离体增殖抑制作用及细胞凋亡的研究，发现两者联合作用能提前引起细胞凋亡，并进一步加速诱导细胞的死亡。
一、材料和方法
1.材料：细胞：人鼻咽癌细胞系(CNE)，上海肿瘤医院放射生物室赠送，RPMI-1640培养液含10%小牛血清，37℃单层贴壁生长。药物：诺维本(Pierre Fabre.Co.)照射条件：60Co γ射线，SSD 80 cm，射野35 cm×35 cm，吸收剂量率120 cGy/min。
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2.方法
(1)药物对细胞的抑制：取对数生长期的CNE细胞，制成单细胞悬液(1×105/ml)，10 μl/孔细胞悬液加入到96孔培养板，体积分数为5%CO2孵箱培养24 h后，用无血清培液使细胞同步化，48 h后，换含不同浓度(20、40、60、80、100 μmol/L)药物的培养液、24 h后每孔加10 μl MTT(5 mg/ml)液，继续培养4～6 h后，加100 μl酸化异丙醇中止反应，震荡10 min，酶标仪(Clini Bio 400 ATC)570 nm测量A值，并求其抑制率。
抑制率(%)=(1-实验组平均A值/对照组平均A值)×100
(2)药物对细胞作用的时间依赖性
将3×105/瓶及1×104/孔细胞悬液分别接种到有盖片的25 ml培养瓶及96孔板中，细胞经上述同步化后，分别加入不同浓度(20、60 μmol/L)的NVB，培养至4、8、12、24、48、72 h后，分别进行以下各指标检测：①药物对细胞抑制的时间依赖性：用MTT法检测，方法同前。②细胞核分裂指数：在上述不同的时间各取一片盖片固定于95%酒精中，H.E.染色后，高倍镜下计数2000个细胞，计算核分裂指数。③流式细胞术的细胞周期分析：各组按常规的流式细胞术检测法收集并固定细胞；检测前细胞经200 g离心后，倾去上清，按顺序加入A(含胰酶等)，B(含胰酶抑制剂及RNase A)，C(含PI)液各10 min，(A，B，C液B.D.inc.U.S.A.)，流式细胞仪(FACS Calibur,B.D.U.S.A.)检测PI标记的细胞核。
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(3)药物联合放射对细胞凋亡的影响
取对数生长期的细胞，以1×105/ml细胞共3 ml/瓶等量接种在25 ml培养瓶中，细胞按上述同步化后，随机分组：①对照组(C)；②单纯放射组(R)：一次600 cGy照射；③单纯药物组(N)：NVB (20 μm)作用24 h后，置以新鲜培液培养；④药物加放射组(N+R)：NVB (20 μmol/L)作用24 h，接着一次600 cGy照射后，置以新鲜培液培养。
流式细胞术的细胞凋亡分析：经药物及放射处理后0、4、24、48、72 h时，分别收集各组细胞，按上述流式细胞术方法处理并分析各组细胞的凋亡小峰。
DNA琼脂糖电泳检测：上述在不同时间收集的各组细胞，经PBS洗涤后悬浮于0.1 ml的裂解缓冲液(5 mmol/L Tris-HCl pH 8，0.25% NP-40,1 mmol/L EDTA,10 mg/ml RNase),37℃水浴1 h，再加入蛋白酶K(20 mg/ml)2.5 μl，37℃水浴再孵育1～2 h，结束后取15 μl上样液，在1.5%琼脂糖凝胶上，60 V稳压条件下电泳1.5 h，溴乙啶染色并在紫外透射光源下观察。
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二、结果和讨论
1.药物对细胞的抑制
用MTT比色法检测不同浓度(20、40、60、80、100 μmol/L)的NVB对细胞的抑制，作用24 h后，其抑制率分别为6.15、20.8、51.95、76.2和90.9%。ID50为60.71 μmol/L。
2.药物对细胞作用的时间依赖性
(1)药物对细胞抑制的时间依赖性
用MTT法检测结果，NVB低浓度(20 μmol/L)时，基本上无明显的抑制作用，而在高浓度时(60 μmol/L)具明显的时间依赖性，见图1。
, 百拇医药 图1 药物对细胞抑制时间关系
(2)药物对细胞核分裂指数的影响
从图2可见，与对照组相比，低浓度的NVB(20 μmol/L)作用至8 h时细胞的核分裂相明显增加，但随着药物持续时间的增加，细胞的核分裂相迅速减少。高浓度的NVB(60 μmol/L)在作用的早期就明显抑制细胞生长。
图2 药物对细胞核分裂指数的影响
(3)流式细胞术的细胞周期分析
从流式细胞术的细胞周期分析结果发现(图3)，低浓度(20 μmol/L)的NVB作用至12 h后，G2+M相细胞明显高于对照组，综合图2结果分析，NVB(20 μmol/L)主要使该细胞阻滞于G2期，而使G2进入M期的细胞明显减少。在高浓度时(60 μmol/L)主要以不可逆的直接杀伤效应作用于该细胞。
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图3 药物对(G2+M)期细胞比例的影响
(3)药物联合放射对细胞凋亡的影响
通过高分子量DNA琼脂糖电泳及流式细胞术检测发现，20 μmol/L NVB作用24 h后，继续培养，24 h开始出现DNA 梯状和凋亡小峰，但至48 h DNA 梯状不明显；单纯600 cGy照射后的细胞，至72 h才出现DNA “Ladder”及凋亡小峰，而经NVB (20 μm)作用24 h后再经600 cGy照射的细胞，即刻至72 h均出现DNA 梯状条带及凋亡小峰(见图4、5)。
各组细胞在不同时间内的平均凋亡 %分别为：C组5.214±4.470，R组6.116±6.663，N组10.07±9.053，(N+R)组17.68±8.967，经统计学分析，(N+R)组与C组和R组相比，P均<0.05。
我们的研究结果发现，当一定浓度的诺维本作用于CNE细胞24 h后，对细胞生长的抑制呈一定的剂量依赖性关系。从细胞有丝分裂及流式细胞术检测的(G2+M)期细胞的比例发现NVB作用的靶点是G2期，从而进一步证实了NVB致使微管蛋白解聚的作用机理，这与Bine[4]的报道相似。
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由于诺维本主要作用于细胞G2期，故为细胞周期特异性药物，而G2期细胞对射线最敏感，所以二者合用有一定的协同效应，即增强放射线的敏感性。Edelstein[5]等也发现，诺维本能增强射线对人小细胞肺癌细胞系(NCI-H460)的敏感性。我们从流式细胞术的细胞凋亡分析结果也发现，单纯诺维本或放射导致的细胞程序性死亡(Apoptosis)都有一定的时间性和局限性，且单纯600 cGy照射后的细胞，至72 h才出现明显的凋亡小峰及DNA梯状条带，而经诺维本联合放射作用后的细胞，即刻至72 h均出现了凋亡小峰及DNA 梯状条带，可见诺维本联合放射能提前引起细胞进入凋亡状态，且这种迅速引起的凋亡诱导作用具有较长的时间延续性，从而最终导致细胞的不可逆死亡，表明在细胞离体生长状态下，诺维本除了诱导细胞生长阻止在G2期，从而增加细胞对放射的敏感性及自身对细胞的凋亡诱导作用外，并能增强辐射对细胞凋亡的诱导作用。
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图4 PI-流式细胞术检测细胞周期分布及凋亡小峰
图5 大分子量DNA琼脂糖电泳结果，示DNA“Ladder”的形成
a.L-1-5示对照组细胞DNA电泳结果 R-1-5示单纯放射后0、4、24、48、72 h细胞DNA电泳结果 b.L-1-5示NVB作用后0、4、24、48、72 h后细胞DNA电泳结果 R-1-5示NVB联合放射作用后0、4、24、48、72 h细胞DNA电泳结果
参考文献
1，Binet S,Fellous A,Lataste H,et al.In situ analysis of the action of Navelbine on various types of microtubules using immunofluorescence.Semin Oncol,1989,16(Suppl 4):5-8.
, http://www.100md.com
2，Johnson SA,Harper P,Hortobsgyi GN,et al.Vinorelbine:an overview.Can Treat Rev,1996,22:127-142.
3，张湘如，孙燕.新抗肿瘤药异长春花碱.北京医学，1992，14：168-193.
4，Binet S,Chaineau E,Fellous A,et al.Immunofluorecence study of the action of Navelbine,Vincristine and Vinblastine on mitotic and axonal microtubules.Int J Cancer,1990,46:262-266.
5，Edelstein MP,Wolfe LA,Duch D S.Potentiation of radiotherapy by Navelbine (NVB) in human non-small cell lung cancer (NSCLC) line.Proc Am Ass Cancer Res,1995,36:A3637.
(收稿日期:1999-12-11), 百拇医药