X射线照射对小鼠EL-4细胞转录因子活性的影响
作者：何淑杰 刘树铮
单位：130021 长春，白求恩医科大学卫生部放射生物学重点实验室
关键词：
中华放射医学与防护杂志000512 转录因子NF-κB由Rel/NF-κB家族多肽的同源或异源二聚体构成，调节多种与免疫，炎症，以及辐射等所致的应激反应有关的基因的诱导表达。高剂量电离辐射具有免疫抑制作用，而低剂量电离辐射具有兴奋作用，可增强免疫功能，诱导机体的适应性反应等[1]。低剂量与高剂量电离辐射所引起的细胞或机体的反应，均与信号转导及转录因子的作用有关。本文应用免疫组织化学方法观察并比较EL-4细胞内NF-κB在不同剂量照射后活化程度及时程上的差异，为进一步阐明低剂量辐射兴奋效应机理提供理论依据。
一、材料和方法
1.细胞培养及照射条件：EL-4细胞为本室传代培养小鼠T淋巴瘤细胞株，用RPMI-1640培养液(含10%FCS)置于37℃，5% CO2孵箱中培养至对数生长期。用国产X.S.S.205(FZ)型固定式X射线深部治疗机照射，电压200 kV，电流10 mA，滤板0.5 mm Cu和1.0 mm Al，靶皮距分别为56 cm及247.3 cm，吸收剂量率相应为0.287 Gy/min及12.5 Gy/min。
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2.细胞涂片的制备：照射后不同时间取细胞，1300 r*min-1离心5 min，用0.01 mol/L PBS洗两次，调细胞浓度至5×106/ml，细胞悬液涂片，室温自然干燥，冷丙酮固定备用。
3.免疫组织化学染色：采用ABC免疫酶染色法，用1% H2O2封闭内源性过氧化物酶。兔抗鼠NF-κB p65，生物素标记羊抗兔IgG及链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶购自中山生物制剂公司。用3，3’二氨基联苯胺(DAB)及0.03% H2O2作为显色底物。
4.阳性细胞的计算：用加拿大Empix公司生产的Northern Eclipse图像分析仪，每张片摄取5个视野，计数总细胞数及胞核阳性细胞数。胞浆、胞核均匀淡染以及胞浆深染，胞核未着色者计为阴性细胞；胞浆淡染、胞核呈局域性深染者计为阴性细胞。
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二、结果
1. 75 mGy X射线照射后不同时间EL-4细胞内转录因子NF-κB核转位的动态变化
各组细胞于照射后即刻计时，到计划时间取出，免疫组织化学直观显示转录因子NF-κB p65亚基在胞浆及胞核中分布的变化。从表1可见，假照组细胞核内即有基础水平的p65亚基存在，在细胞受到75 mGy照射后30 min，NF-κB从胞浆转入胞核量明显增多，达26.7%，照后1、2 h逐渐增多，至照后4 h达到峰值，核阳性率为65%，随后缓慢下降，照后24 h下降到24.7%，但仍高于假照水平。
图1 X射线照射后不同时间EL-4
细胞内NF-κB核转位动态变化
, http://www.100md.com 表1 75mGy X射线照射对EL-4细胞内
NF-κB核转位的时程效应 照后时间(h)
总细胞数
胞核阳性细胞数
阳性百分率(%)
对照
487
73
15.0
0.5
386
103
, http://www.100md.com
26.7
1
297
134
45.1
2
265
90
34.0
4
230
150
65.2
, 百拇医药 8
196
95
48.2
12
322
146
45.3
24
154
38
24.7
2. 2 Gy X射线照射后不同时间EL-4细胞内NF-κB核转位的动态变化
, http://www.100md.com
2 Gy与75 mGy组为同次实验不同组别，故设同一组假照组。从表2可见，2 Gy照射诱导EL-4细胞内NF-κB核转位随时间延长而缓慢增多，动态变化类似于75 mGy照射组，峰值到达时间为12 h，转入率为51.1%，低于75 mGy照射组的峰值，24 h后下降至30.2%。以上结果提示，2 Gy X射线照射可诱导EL-4细胞转录因子核转位增多，与特定的核苷酸序列结合，从而诱导基因转录启动，使细胞于较高剂量X射线照射后仍可能有一部分存活。
表2 2Gy X射线照射对EL-4细胞内
NF-κB核转位的时程效应
照后时间(h)
总细胞数
胞核阳性细胞数
阳性百分率(%)
, http://www.100md.com
对照
487
73
15.0
0.5
411
65
15.8
1
313
54
17.3
2
, http://www.100md.com 335
94
28.1
4
379
116
30.6
8
215
75
34.9
12
444
227
, 百拇医药
51.1
24
361
109
30.2
三、讨论
NF-κB是一种可诱导的转录因子，参与胞核胞浆的信号转导并调节多种基因及病毒的表达[2]。电离辐射、UV等多种因子可激活NF-κB[3-5]。陈沙力等曾报道用凝胶电泳移动变化分析(EMSA)的方法检测75 mGy X射线全身照射诱导小鼠胸腺及脾淋巴细胞内NF-κB等转录因子DNA结合活性升高[3]。Prasad等[5]报道0.25～2 Gy γ射线照射诱导EBV转染的244B人淋巴样细胞内NF-κB表达及结合活性增加。Brach等[4]用2～50 Gy的高剂量诱导人KG-1髓系白血病细胞NF-κB DNA结合活性的激活。以上资料表明，不论低剂量或高剂量辐射均可诱导NF-κB转录激活，而在不同的细胞中，NF-κB的反应存在着差别。本实验结果提示，75 mGy诱导NF-κB核转位效应较2 Gy更迅速，幅度更大。75 mGy照射最大核转位发生在照后4 h，而2 Gy照射后最大在12 h。提示低水平照射诱导NF-κB的迅速活化，进一步调节细胞因子等特异基因的表达，促使机体免疫功能增强。这可能是低剂量辐射兴奋效应的机制之一。2 Gy照射也诱导NF-κB活化，使细胞在较高剂量照射后仍能存活，致使肿瘤细胞产生辐射抗性。Yamagishi等[6]表明Iκ Bα蛋白的过度表达，抑制NF-κB的活化，可增强细胞的放射敏感性。而且，NF-κB/Rel的抑制或破坏，可增强TNF-α或癌症治疗诱导的细胞凋亡[7]。因此，NF-κB的调节激活可能是决定细胞放射敏感性的内在反应之一。但不同剂量电离辐射通过哪些信号通路活化NF-κB，活化的NF-κB又激活哪些特异基因的转录，有待深入研究。
, http://www.100md.com
参考文献
1，刘树铮著.低水平辐射兴奋效应.北京：科学出版社，1996.152-316.
2，Bacuerle PA. The inducible transcription activator NF-κB:regulation by distinct protein subunits. Biochem Biophys Acta,1991,1072:63-68.
3，陈沙力，刘树铮.75 mGy X射线全身照射激活小鼠免疫细胞转录因子CREB、NF-κB及AP1.辐射研究与辐射工艺学报，1998，16：45-49.
4，Brach MA,Hase R,Sherman ML, et al. Ionizing radiation induced expression and binding activity of the nuclear factor κB. J Clin Invest,1991,88:691-695.
, 百拇医药
5，Prassad AV,Mohan N,Chandrasekar B, et al. Activation of nuclear factor κB in human lymphoblastoid cells by low-dose ionizing radiation. Radiat Res,1994,138:367-372.
6，Yamagishi N,Miyakoshi J,Takebe H. Enhanced radiosensitivity by inhibition of nuclear factor κB activation in human malignant glioma cells. Int J Radiat Biol，1997,72:157-162.
7，Wang CY,Mayo MW,Baldwin AS.TNF-and cancer therapy-induced apoptosis:potentiation by inhibition of NF-κB. Science,1996,274:784-787.
(收稿日期:1999-11-29), 百拇医药
单位：130021 长春，白求恩医科大学卫生部放射生物学重点实验室
关键词：
中华放射医学与防护杂志000512 转录因子NF-κB由Rel/NF-κB家族多肽的同源或异源二聚体构成，调节多种与免疫，炎症，以及辐射等所致的应激反应有关的基因的诱导表达。高剂量电离辐射具有免疫抑制作用，而低剂量电离辐射具有兴奋作用，可增强免疫功能，诱导机体的适应性反应等[1]。低剂量与高剂量电离辐射所引起的细胞或机体的反应，均与信号转导及转录因子的作用有关。本文应用免疫组织化学方法观察并比较EL-4细胞内NF-κB在不同剂量照射后活化程度及时程上的差异，为进一步阐明低剂量辐射兴奋效应机理提供理论依据。
一、材料和方法
1.细胞培养及照射条件：EL-4细胞为本室传代培养小鼠T淋巴瘤细胞株，用RPMI-1640培养液(含10%FCS)置于37℃，5% CO2孵箱中培养至对数生长期。用国产X.S.S.205(FZ)型固定式X射线深部治疗机照射，电压200 kV，电流10 mA，滤板0.5 mm Cu和1.0 mm Al，靶皮距分别为56 cm及247.3 cm，吸收剂量率相应为0.287 Gy/min及12.5 Gy/min。
, 百拇医药
2.细胞涂片的制备：照射后不同时间取细胞，1300 r*min-1离心5 min，用0.01 mol/L PBS洗两次，调细胞浓度至5×106/ml，细胞悬液涂片，室温自然干燥，冷丙酮固定备用。
3.免疫组织化学染色：采用ABC免疫酶染色法，用1% H2O2封闭内源性过氧化物酶。兔抗鼠NF-κB p65，生物素标记羊抗兔IgG及链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶购自中山生物制剂公司。用3，3’二氨基联苯胺(DAB)及0.03% H2O2作为显色底物。
4.阳性细胞的计算：用加拿大Empix公司生产的Northern Eclipse图像分析仪，每张片摄取5个视野，计数总细胞数及胞核阳性细胞数。胞浆、胞核均匀淡染以及胞浆深染，胞核未着色者计为阴性细胞；胞浆淡染、胞核呈局域性深染者计为阴性细胞。
, 百拇医药
二、结果
1. 75 mGy X射线照射后不同时间EL-4细胞内转录因子NF-κB核转位的动态变化
各组细胞于照射后即刻计时，到计划时间取出，免疫组织化学直观显示转录因子NF-κB p65亚基在胞浆及胞核中分布的变化。从表1可见，假照组细胞核内即有基础水平的p65亚基存在，在细胞受到75 mGy照射后30 min，NF-κB从胞浆转入胞核量明显增多，达26.7%，照后1、2 h逐渐增多，至照后4 h达到峰值，核阳性率为65%，随后缓慢下降，照后24 h下降到24.7%，但仍高于假照水平。
图1 X射线照射后不同时间EL-4
细胞内NF-κB核转位动态变化
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NF-κB核转位的时程效应 照后时间(h)
总细胞数
胞核阳性细胞数
阳性百分率(%)
对照
487
73
15.0
0.5
386
103
, http://www.100md.com
26.7
1
297
134
45.1
2
265
90
34.0
4
230
150
65.2
, 百拇医药 8
196
95
48.2
12
322
146
45.3
24
154
38
24.7
2. 2 Gy X射线照射后不同时间EL-4细胞内NF-κB核转位的动态变化
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2 Gy与75 mGy组为同次实验不同组别，故设同一组假照组。从表2可见，2 Gy照射诱导EL-4细胞内NF-κB核转位随时间延长而缓慢增多，动态变化类似于75 mGy照射组，峰值到达时间为12 h，转入率为51.1%，低于75 mGy照射组的峰值，24 h后下降至30.2%。以上结果提示，2 Gy X射线照射可诱导EL-4细胞转录因子核转位增多，与特定的核苷酸序列结合，从而诱导基因转录启动，使细胞于较高剂量X射线照射后仍可能有一部分存活。
表2 2Gy X射线照射对EL-4细胞内
NF-κB核转位的时程效应
照后时间(h)
总细胞数
胞核阳性细胞数
阳性百分率(%)
, http://www.100md.com
对照
487
73
15.0
0.5
411
65
15.8
1
313
54
17.3
2
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94
28.1
4
379
116
30.6
8
215
75
34.9
12
444
227
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51.1
24
361
109
30.2
三、讨论
NF-κB是一种可诱导的转录因子，参与胞核胞浆的信号转导并调节多种基因及病毒的表达[2]。电离辐射、UV等多种因子可激活NF-κB[3-5]。陈沙力等曾报道用凝胶电泳移动变化分析(EMSA)的方法检测75 mGy X射线全身照射诱导小鼠胸腺及脾淋巴细胞内NF-κB等转录因子DNA结合活性升高[3]。Prasad等[5]报道0.25～2 Gy γ射线照射诱导EBV转染的244B人淋巴样细胞内NF-κB表达及结合活性增加。Brach等[4]用2～50 Gy的高剂量诱导人KG-1髓系白血病细胞NF-κB DNA结合活性的激活。以上资料表明，不论低剂量或高剂量辐射均可诱导NF-κB转录激活，而在不同的细胞中，NF-κB的反应存在着差别。本实验结果提示，75 mGy诱导NF-κB核转位效应较2 Gy更迅速，幅度更大。75 mGy照射最大核转位发生在照后4 h，而2 Gy照射后最大在12 h。提示低水平照射诱导NF-κB的迅速活化，进一步调节细胞因子等特异基因的表达，促使机体免疫功能增强。这可能是低剂量辐射兴奋效应的机制之一。2 Gy照射也诱导NF-κB活化，使细胞在较高剂量照射后仍能存活，致使肿瘤细胞产生辐射抗性。Yamagishi等[6]表明Iκ Bα蛋白的过度表达，抑制NF-κB的活化，可增强细胞的放射敏感性。而且，NF-κB/Rel的抑制或破坏，可增强TNF-α或癌症治疗诱导的细胞凋亡[7]。因此，NF-κB的调节激活可能是决定细胞放射敏感性的内在反应之一。但不同剂量电离辐射通过哪些信号通路活化NF-κB，活化的NF-κB又激活哪些特异基因的转录，有待深入研究。
, http://www.100md.com
参考文献
1，刘树铮著.低水平辐射兴奋效应.北京：科学出版社，1996.152-316.
2，Bacuerle PA. The inducible transcription activator NF-κB:regulation by distinct protein subunits. Biochem Biophys Acta,1991,1072:63-68.
3，陈沙力，刘树铮.75 mGy X射线全身照射激活小鼠免疫细胞转录因子CREB、NF-κB及AP1.辐射研究与辐射工艺学报，1998，16：45-49.
4，Brach MA,Hase R,Sherman ML, et al. Ionizing radiation induced expression and binding activity of the nuclear factor κB. J Clin Invest,1991,88:691-695.
, 百拇医药
5，Prassad AV,Mohan N,Chandrasekar B, et al. Activation of nuclear factor κB in human lymphoblastoid cells by low-dose ionizing radiation. Radiat Res,1994,138:367-372.
6，Yamagishi N,Miyakoshi J,Takebe H. Enhanced radiosensitivity by inhibition of nuclear factor κB activation in human malignant glioma cells. Int J Radiat Biol，1997,72:157-162.
7，Wang CY,Mayo MW,Baldwin AS.TNF-and cancer therapy-induced apoptosis:potentiation by inhibition of NF-κB. Science,1996,274:784-787.
(收稿日期:1999-11-29), 百拇医药