60Coγ射线照射后培养小鼠骨髓基质细胞内NF-κB的变化
作者：朱波 罗成基 郭朝华 程晓明 邹仲敏 周进明
单位：朱波(400038 重庆，第三军医大学复合伤研究所)；罗成基(400038 重庆，第三军医大学复合伤研究所)；郭朝华(400038 重庆，第三军医大学复合伤研究所)；程晓明(新桥医院呼吸病研究所)；邹仲敏(400038 重庆，第三军医大学复合伤研究所)；周进明(400038 重庆，第三军医大学复合伤研究所)
关键词：骨髓基质细胞；辐射；骨髓造血微环境；NF-κB
中华放射医学与防护杂志000505 【摘要】 目的 探讨辐射对培养小鼠骨髓基质细胞内NF-κB的影响。方法 采用免疫组化、Western blot及凝胶电泳迁移率实验。结果 免疫组化方法显示正常骨髓基质细胞细胞核的周围表达低水平的NF-κB,8.0 Gy60Coγ射线损伤后1 h即见其表达较正常显著升高并出现明显的核移位，4 h达高峰，6 h有所回落，8 h恢复正常；Western blot显示照射后骨髓基质细胞NF-κB的蛋白表达量较正常明显升高，8 h仍然未恢复正常；凝胶电泳迁移率实验发现正常骨髓基质细胞内存在低水平活性NF-κB，8.0 Gy60Coγ射线损伤后1 h即见其活性明显升高，4 h达高峰，8 h恢复正常。结论8.0 Gyγ射线损伤后培养小鼠骨髓基质细胞内NF-κB的表达升高并激活，这可能与骨髓微环境内基质细胞的抗辐射能力及造血功能的恢复有关。
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Changes of nuclear factor-κB (NF-κB) in cultured bone marrow stromal cells after 60Coγ-irradiation
ZHU Bo,LUO Chengji,GUO Chaohua,et al.
(Institute of Combined Injury,Third Military Medical University,Chongqing, 400038,China)
【Abstract】 Objective To explore the changes in bone marrow hematopoietic microenvironment after exposure to γ-radiation. Methods Immunohistochemistry,Western blot and electrophoretic mobility shift assay (EMSA)was used. Results The nuclear translocation was found in cultured bone marrow stromal cells after 60Coγ-irradiation with immunohistochemistry.The expression of NF-κB in the bone marrow stromal cells (BMSCs) on the level of protein was elevated after exposure to 60Coγ-rays at the dose of 8.0Gy with the uses of immunohistochemistry and Western blot.The activities of NF-κB in the BMSCs increased significantly after exposure to γ-radiation by using EMSA.The activity peak was at 4 hours after irradiation. Conclusion Our results suggest that the activation of NF-κB in the BMSCs by irradiation might be involved in the protection of BMSCs and in the recovery of hematopoiesis after γ-irradiation.
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【Key words】 Bone marrow stromal cells; Radiation; Bone marrow hematopoietic microenvironment; NF-κB
细胞核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)是细胞中一个重要的转录因子，它调控着基因编码急性时相蛋白、细胞因子和细胞粘附分子等。与造血相关的细胞因子IL-6、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、TNF-α等均受NF-κB编码调控[1]。此外，最近的研究表明，NF-κB能够抑制由辐射诱导的细胞凋亡[2]。本实验拟通过观察辐射损伤后培养的小鼠骨髓基质细胞内NF-κB蛋白表达及活性的改变来探讨骨髓基质细胞的辐射应激机理。
材料和方法
1.动物来源及分组：正常健康昆明种小鼠购于本校动物中心，鼠龄在6～8周，体重(18～22) g,雌雄不限。
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2.骨髓基质细胞的分离及培养：参照文献[3]。简述如下：各观察组小鼠颈椎脱臼后，置75%酒精浸泡消毒，无菌条件下取双侧股骨，剔除肌肉剪断股骨头，用RPMI 1640培养液冲出股骨内骨髓细胞，依次用7号针头和5号针头把细胞吹打成单细胞悬液，加入RPMI 1640(10%小牛血清、10%马血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素)内，37℃，体积分数为5% CO2培养，第21天收集细胞。
3.细胞照射：培养第21天细胞用本室钴源照射，吸收剂量率为1.07 Gy/min，总吸收剂量为8.0 Gy。
4.免疫组织化学SP染色：在各时相点挑取玻片，参考文献[4]，固定、封闭，加1∶100稀释的P65 (santa cruz美国)37℃ 3 h，4℃过夜，0.1 mol/L PBS漂洗3次，加生物素标记的二抗(Ig/Bio 1∶200)(SP-Kit,北京中山公司)，37℃2 h，0.1 mol/L PBS漂洗3次，加HRP/SP(1∶200)复合物37℃ 2 h，0.1 mol/L PBS漂洗3次，DAB法显色5 min，脱水、透明、DPX封片。
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5.Western blot用蛋白的提取：将培养21 d骨髓基质细胞在全细胞裂解液(0.1 mol/L NaCl,0.03 mol/L蔗糖，0.003 mol/L MgCl,1 mmol/L EDTA,1 mg/L Leupeptin、antipain、aprotinin和pepstatin,10 mmol/L PMSF)中冰上裂解20 min,4℃、12 500 r*min-1离心10 min，吸上清即为细胞总蛋白，以考马斯亮蓝法测定提取液蛋白浓度，并将其置于-70℃待用。
6.Western blot：将50 μg蛋白与等体积的加样缓冲液混合，煮沸90 s，加样，标准方法走电泳，将蛋白质转移到PVDF膜上，用5%牛血清白蛋白封闭，依次加1∶500封闭液稀释的一抗P65(santa cruz美国)，1∶300封闭液稀释的二抗、三抗后，最后用DAB法显色5 min，观察结果。
7.核蛋白的提取：核蛋白的提取方法按Daohong Zhou[5]报道的加以改良，细胞经PBS洗涤后，悬浮在缓冲液A 400 ml中(10 mmol/L Hepes,pH 7.9，10 mmol/L KCl,0.1 mmol/L EDTA,0.2%NP-40,1 mmol/L DTT,0.1 mmol/L PMSF,1 mg/L Leupeptin、antipain、aprotinin和pepstatin)，混匀后冰置15 min，加入10% NP-40 25 μl，剧烈震荡15 s,13 000 r*min-1、离心10 s，吸弃上清，加入50 μl缓冲液C(20 mmol/L Hepes,pH 7.9，420 mmol/L NaCl,0.1 mmol/L EDTA,1.5 mmol/L MgCl,25% glycerol,1 mmol/L DTT,0.1 mmol/L PMSF 1 mg/L Leupeptin、antipain、aprotinin和pepstatin)中，冰置30 min，剧烈震荡15 s，4℃、12 500 r*min-1离心10 min,取上清，以考马斯亮蓝法测定提取液蛋白浓度，并将其置于-70℃待用。
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8.凝胶电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)将5 μg核蛋白加入至15 μl的结合反应缓冲液中[HEPES、NaCl、EDTA、甘油、BSA和2.5 μg/ml poly(dI/dC)]冰上作用20 min。探针用具有与NF-κB转录因子结合位点的双链寡核苷酸，其序列为：5′-TCAGAGGGGACTTTCCGAGAGG-3′。探针经末端标记法用γ32P-ATP(Amershan)标记。用TE稀释后取1 μl探针加入反应液中与核蛋白孵育30 min，反应产物用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳恒压电泳3 h，真空加热干燥后，-70℃用X射线片放射自显影3 h。相同实验重复3次。
9.凝胶电泳迁移率竞争抑制实验：在凝胶电泳迁移率实验中设两组竞争性对照，一组为特异性竞争抑制实验，即在反应体系中加入200倍未标记的特异性NF-κB探针，另一组为非特异性竞争抑制实验，即在反应体系中加入200倍非特异性的未标记探针，非特异性未标记探针为GATA3寡核苷酸探针，其序列为：5′-TGCTAACAATCAGATAGAGG，5-CCTCTATCTGATTGTTAGCA-3′；室温下置10 min后加入标记探针。以后步骤同凝胶电泳迁移率实验。
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结 果
1.NF-κB免疫组化染色结果：正常培养骨髓基质细胞NF-κB蛋白主要位于细胞浆内细胞核的周围，免疫组化阳性反应较弱。8.0 Gy 60Coγ射线照射后1～2 h即见其表达升高并向核内转位。4 h在核内明显聚集，6 h表达开始下降，8 h恢复至正常。
2.P65 蛋白Western blot结果：正常培养骨髓基质细胞内P65蛋白少量表达，8.0 Gy 60Co γ射线照射后2～8 h各时相点均见其表达明显升高(图1)。
图1 Western blot检测NF-κB亚基p65的蛋白表达
条带1：正常对照 条带2～5：分别为辐照后2 h、4 h、6 h、8 h
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3.凝胶电泳迁移率实验检测NF-κB活性结果：8.0 Gy 60Co γ射线照射后培养小鼠骨髓基质细胞内NF-κB活性在1～2 h即见明显高于正常对照，4 h达到高峰，6 h开始下降，8 h恢复正常(图2)。100倍、200倍未标记的NF-κB寡核苷酸探针能阻断蛋白阻滞，200倍的GATA3未标记探针对蛋白阻滞实验无显著影响。
图2 凝胶电泳迁移率法检测正常和
照射后各时相点NF-κB活性结果
条带1：正常对照 条带2～6：分别为辐照后1 h、2 h、4 h、8 h
讨 论
骨髓基质细胞是造血微环境的重要组成成分，也是骨髓体内外产生造血活性所必须的结构基础[3]。它在骨髓中的作用主要有以下3方面：①为造血干细胞的生存提供不可缺少的物理支柱；②通过粘附分子作为桥梁与造血干、祖细胞形成“配体-整合蛋白-细胞骨架跨膜系数”，从而影响造血实质细胞的形态，调控基因表达，控制细胞的分化，，决定细胞的运动；③通过产生和分泌多种细胞因子如GM-CSF、G-CSF、M-CSF、IL-3、IL-6、TNF-α、TGF-β和其他活性物质调控造血干、祖细胞的增殖、分化和发育。骨髓对辐射损伤是敏感器官之一，射线主要杀伤骨髓内的造血细胞，但对造血细胞存在的微环境也有一定程度的损伤。辐射不但可以杀死骨髓内的基质细胞或启动细胞的凋亡，而且引起存活细胞基因表达的改变。有文献报道[6]：5.0 Gy照射后数小时内骨髓组织内IL-1α、IL-6、GM-CSF、IL-8和TNF-α在mRNA水平均见明显升高。骨髓组织内细胞因子的主要来源是骨髓内的基质细胞，由此我们不难推测辐射后骨髓组织内上述细胞因子的表达升高是由基质细胞内的基因表达的改变引起的。但辐射引起骨髓基质细胞内基因表达改变的具体机制目前仍不清楚。
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NF-κB是细胞中一个重要的转录因子，它调控基因编码急性时相蛋白、细胞因子、免疫相关分子等，同时与抗凋亡基因的诱导表达有关。在末受刺激的细胞中，NF-κB与抑制蛋白IκB形成复合体存在于胞浆内。在INF-α、LPS和辐射等作用下IκB磷酸化并从NF-κB上解离下来，此时活化的NF-κB转移入核内启动基因的转录[7]。
8.0 Gy辐射损伤是造成极重度放射病的剂量，同时也常被用于小鼠骨髓移植预处理模型。本实验通过免疫组化的方法发现8.0 Gy60Co γ射线照射后1～2 h培养骨髓基质细胞内NF-κB即有明显的核转位，1～2 h开始，4 h在核内明显聚集；为了进一步对NF-κB的蛋白表达量作定量分析，我们又用Western blot的方法检测了NF-κB的p65亚基，发现辐照能够引起p65亚基蛋白表达量明显升高，至照射后8 h仍然未恢复正常水平；同时用凝胶电泳迁移率实验证实辐射后NF-κB有较高水平的活化，辐照后培养骨髓基质细胞内1～2 h即见NF-κB有明显的激活，4 h达高峰、6 h开始下降、8 h恢复正常。对于该实验结果我们作如下分析：60Co γ 射线照射作为对机体的一种损伤因素杀死骨髓内的造血细胞、损伤骨髓微环境，包括基质细胞。骨髓基质细胞一方面要保护自身——修复DNA和/或抗凋亡，另一方面又要适应机体/周围环境的需要作出应激——动员、加快骨髓的造血功能。骨髓基质细胞通过激活NF-κB能达到上述的目的，其依据有如下两点：①激活的NF-κB可以诱导TRAF1(TNFR-associated factor 1)、TRAF2、c-IAP1(inhibitor-of-apoptosis)、cIAP-2等抑凋亡相关基因的表达，这些基因的表达可以抑制凋亡通路中的Caspase的活化[2]，从而抑制照射引起的骨髓基质细胞的凋亡。②骨髓基质细胞内活化的NF-κB可以调控其下游基因的表达，如细胞因子G-CSF、GM-CSF、M-CSF、IL-6、TNF-α等[8]，这些细胞因子可以促进骨髓内残留的造血干细胞增殖、分化及向外周血动员。从这两方面分析来看，60Co γ射线照射后NF-κB在骨髓基质细胞内的激活是机体对辐射损伤的一种保护性应激反应。但从炎症反应的角度来分析NF-κB在骨髓基质细胞内的激活则可能会参与辐射对骨髓微环境的继发性损伤，其原因主要是NF-κB能诱导骨髓基质细胞表达或分泌一些前炎症因子如IL-8、TNF-α、IL-6、IL-1B等，这些前炎症因子可以吸引中性粒细胞向骨髓微环境内趋化或抑制其凋亡[9]。中性粒细胞在参与炎症反应的同时也对骨髓微环境造成不同程度的损伤，这可能是辐射后骨髓微环境支持造血功能长期不能恢复和骨髓纤维化的原因之一。这方面的研究有待进一步深入。
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基金项目：全军“九五”指令性公关资助项目(P6L045)
参考文献
1， Albert S,Baldwin Jr.The NF-κB and IκB proteins:new discoveries and insights.Ann Rev Immunol,1996,14:649-683.
2，Cun YW,Marty WM.NF-κB antiapoptosis:introduction of TRAF1 and TRAF2 and c-IAP1 and c-IAP2 to suppress caspase-8 activation.Science,1998,281:1680-1683.
3，Dexter TM.Stromal cells associated hematopoiesis.J Cell Physiol,1982,1:87-94.
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4，蔡文琴，王伯云，主编.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术.成都：成都科学技术出版社，1994.406-409.
5，Zhou D.Characterization of a silencer element in the human aromatase gene.Arch Biochem Biophys,1998,353:213-220.
6，Chang CM,Limanni A,Baker WH,et al.Sublethal gamma irradiation increases IL-1α,IL-6,and TNF-α mRNA levels in murine hematopoietic tissues.J Interferon Cytokine Res,1997,17:567-572.
7，Timothy S,Blackwell,John W.The role of nuclear factor-kappa B in cytokine gene regulation.Am J Respir Cell Mol Biol,1997,17:3-9.
8，Thanos D,Maniatis T.NF-κB:a lesson in family values.Cell,1995,80:529-532.
9，Biffe WL,Morre EE,Barnett CC.Interleukin-6 delays neutrophil apoptosis.Arch Surgvol,1996,131:24-29.
(收稿日期:1999-12-24), 百拇医药
单位：朱波(400038 重庆，第三军医大学复合伤研究所)；罗成基(400038 重庆，第三军医大学复合伤研究所)；郭朝华(400038 重庆，第三军医大学复合伤研究所)；程晓明(新桥医院呼吸病研究所)；邹仲敏(400038 重庆，第三军医大学复合伤研究所)；周进明(400038 重庆，第三军医大学复合伤研究所)
关键词：骨髓基质细胞；辐射；骨髓造血微环境；NF-κB
中华放射医学与防护杂志000505 【摘要】 目的 探讨辐射对培养小鼠骨髓基质细胞内NF-κB的影响。方法 采用免疫组化、Western blot及凝胶电泳迁移率实验。结果 免疫组化方法显示正常骨髓基质细胞细胞核的周围表达低水平的NF-κB,8.0 Gy60Coγ射线损伤后1 h即见其表达较正常显著升高并出现明显的核移位，4 h达高峰，6 h有所回落，8 h恢复正常；Western blot显示照射后骨髓基质细胞NF-κB的蛋白表达量较正常明显升高，8 h仍然未恢复正常；凝胶电泳迁移率实验发现正常骨髓基质细胞内存在低水平活性NF-κB，8.0 Gy60Coγ射线损伤后1 h即见其活性明显升高，4 h达高峰，8 h恢复正常。结论8.0 Gyγ射线损伤后培养小鼠骨髓基质细胞内NF-κB的表达升高并激活，这可能与骨髓微环境内基质细胞的抗辐射能力及造血功能的恢复有关。
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Changes of nuclear factor-κB (NF-κB) in cultured bone marrow stromal cells after 60Coγ-irradiation
ZHU Bo,LUO Chengji,GUO Chaohua,et al.
(Institute of Combined Injury,Third Military Medical University,Chongqing, 400038,China)
【Abstract】 Objective To explore the changes in bone marrow hematopoietic microenvironment after exposure to γ-radiation. Methods Immunohistochemistry,Western blot and electrophoretic mobility shift assay (EMSA)was used. Results The nuclear translocation was found in cultured bone marrow stromal cells after 60Coγ-irradiation with immunohistochemistry.The expression of NF-κB in the bone marrow stromal cells (BMSCs) on the level of protein was elevated after exposure to 60Coγ-rays at the dose of 8.0Gy with the uses of immunohistochemistry and Western blot.The activities of NF-κB in the BMSCs increased significantly after exposure to γ-radiation by using EMSA.The activity peak was at 4 hours after irradiation. Conclusion Our results suggest that the activation of NF-κB in the BMSCs by irradiation might be involved in the protection of BMSCs and in the recovery of hematopoiesis after γ-irradiation.
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【Key words】 Bone marrow stromal cells; Radiation; Bone marrow hematopoietic microenvironment; NF-κB
细胞核因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)是细胞中一个重要的转录因子，它调控着基因编码急性时相蛋白、细胞因子和细胞粘附分子等。与造血相关的细胞因子IL-6、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、TNF-α等均受NF-κB编码调控[1]。此外，最近的研究表明，NF-κB能够抑制由辐射诱导的细胞凋亡[2]。本实验拟通过观察辐射损伤后培养的小鼠骨髓基质细胞内NF-κB蛋白表达及活性的改变来探讨骨髓基质细胞的辐射应激机理。
材料和方法
1.动物来源及分组：正常健康昆明种小鼠购于本校动物中心，鼠龄在6～8周，体重(18～22) g,雌雄不限。
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2.骨髓基质细胞的分离及培养：参照文献[3]。简述如下：各观察组小鼠颈椎脱臼后，置75%酒精浸泡消毒，无菌条件下取双侧股骨，剔除肌肉剪断股骨头，用RPMI 1640培养液冲出股骨内骨髓细胞，依次用7号针头和5号针头把细胞吹打成单细胞悬液，加入RPMI 1640(10%小牛血清、10%马血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素)内，37℃，体积分数为5% CO2培养，第21天收集细胞。
3.细胞照射：培养第21天细胞用本室钴源照射，吸收剂量率为1.07 Gy/min，总吸收剂量为8.0 Gy。
4.免疫组织化学SP染色：在各时相点挑取玻片，参考文献[4]，固定、封闭，加1∶100稀释的P65 (santa cruz美国)37℃ 3 h，4℃过夜，0.1 mol/L PBS漂洗3次，加生物素标记的二抗(Ig/Bio 1∶200)(SP-Kit,北京中山公司)，37℃2 h，0.1 mol/L PBS漂洗3次，加HRP/SP(1∶200)复合物37℃ 2 h，0.1 mol/L PBS漂洗3次，DAB法显色5 min，脱水、透明、DPX封片。
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5.Western blot用蛋白的提取：将培养21 d骨髓基质细胞在全细胞裂解液(0.1 mol/L NaCl,0.03 mol/L蔗糖，0.003 mol/L MgCl,1 mmol/L EDTA,1 mg/L Leupeptin、antipain、aprotinin和pepstatin,10 mmol/L PMSF)中冰上裂解20 min,4℃、12 500 r*min-1离心10 min，吸上清即为细胞总蛋白，以考马斯亮蓝法测定提取液蛋白浓度，并将其置于-70℃待用。
6.Western blot：将50 μg蛋白与等体积的加样缓冲液混合，煮沸90 s，加样，标准方法走电泳，将蛋白质转移到PVDF膜上，用5%牛血清白蛋白封闭，依次加1∶500封闭液稀释的一抗P65(santa cruz美国)，1∶300封闭液稀释的二抗、三抗后，最后用DAB法显色5 min，观察结果。
7.核蛋白的提取：核蛋白的提取方法按Daohong Zhou[5]报道的加以改良，细胞经PBS洗涤后，悬浮在缓冲液A 400 ml中(10 mmol/L Hepes,pH 7.9，10 mmol/L KCl,0.1 mmol/L EDTA,0.2%NP-40,1 mmol/L DTT,0.1 mmol/L PMSF,1 mg/L Leupeptin、antipain、aprotinin和pepstatin)，混匀后冰置15 min，加入10% NP-40 25 μl，剧烈震荡15 s,13 000 r*min-1、离心10 s，吸弃上清，加入50 μl缓冲液C(20 mmol/L Hepes,pH 7.9，420 mmol/L NaCl,0.1 mmol/L EDTA,1.5 mmol/L MgCl,25% glycerol,1 mmol/L DTT,0.1 mmol/L PMSF 1 mg/L Leupeptin、antipain、aprotinin和pepstatin)中，冰置30 min，剧烈震荡15 s，4℃、12 500 r*min-1离心10 min,取上清，以考马斯亮蓝法测定提取液蛋白浓度，并将其置于-70℃待用。
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8.凝胶电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)将5 μg核蛋白加入至15 μl的结合反应缓冲液中[HEPES、NaCl、EDTA、甘油、BSA和2.5 μg/ml poly(dI/dC)]冰上作用20 min。探针用具有与NF-κB转录因子结合位点的双链寡核苷酸，其序列为：5′-TCAGAGGGGACTTTCCGAGAGG-3′。探针经末端标记法用γ32P-ATP(Amershan)标记。用TE稀释后取1 μl探针加入反应液中与核蛋白孵育30 min，反应产物用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳恒压电泳3 h，真空加热干燥后，-70℃用X射线片放射自显影3 h。相同实验重复3次。
9.凝胶电泳迁移率竞争抑制实验：在凝胶电泳迁移率实验中设两组竞争性对照，一组为特异性竞争抑制实验，即在反应体系中加入200倍未标记的特异性NF-κB探针，另一组为非特异性竞争抑制实验，即在反应体系中加入200倍非特异性的未标记探针，非特异性未标记探针为GATA3寡核苷酸探针，其序列为：5′-TGCTAACAATCAGATAGAGG，5-CCTCTATCTGATTGTTAGCA-3′；室温下置10 min后加入标记探针。以后步骤同凝胶电泳迁移率实验。
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结 果
1.NF-κB免疫组化染色结果：正常培养骨髓基质细胞NF-κB蛋白主要位于细胞浆内细胞核的周围，免疫组化阳性反应较弱。8.0 Gy 60Coγ射线照射后1～2 h即见其表达升高并向核内转位。4 h在核内明显聚集，6 h表达开始下降，8 h恢复至正常。
2.P65 蛋白Western blot结果：正常培养骨髓基质细胞内P65蛋白少量表达，8.0 Gy 60Co γ射线照射后2～8 h各时相点均见其表达明显升高(图1)。
图1 Western blot检测NF-κB亚基p65的蛋白表达
条带1：正常对照 条带2～5：分别为辐照后2 h、4 h、6 h、8 h
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3.凝胶电泳迁移率实验检测NF-κB活性结果：8.0 Gy 60Co γ射线照射后培养小鼠骨髓基质细胞内NF-κB活性在1～2 h即见明显高于正常对照，4 h达到高峰，6 h开始下降，8 h恢复正常(图2)。100倍、200倍未标记的NF-κB寡核苷酸探针能阻断蛋白阻滞，200倍的GATA3未标记探针对蛋白阻滞实验无显著影响。
图2 凝胶电泳迁移率法检测正常和
照射后各时相点NF-κB活性结果
条带1：正常对照 条带2～6：分别为辐照后1 h、2 h、4 h、8 h
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骨髓基质细胞是造血微环境的重要组成成分，也是骨髓体内外产生造血活性所必须的结构基础[3]。它在骨髓中的作用主要有以下3方面：①为造血干细胞的生存提供不可缺少的物理支柱；②通过粘附分子作为桥梁与造血干、祖细胞形成“配体-整合蛋白-细胞骨架跨膜系数”，从而影响造血实质细胞的形态，调控基因表达，控制细胞的分化，，决定细胞的运动；③通过产生和分泌多种细胞因子如GM-CSF、G-CSF、M-CSF、IL-3、IL-6、TNF-α、TGF-β和其他活性物质调控造血干、祖细胞的增殖、分化和发育。骨髓对辐射损伤是敏感器官之一，射线主要杀伤骨髓内的造血细胞，但对造血细胞存在的微环境也有一定程度的损伤。辐射不但可以杀死骨髓内的基质细胞或启动细胞的凋亡，而且引起存活细胞基因表达的改变。有文献报道[6]：5.0 Gy照射后数小时内骨髓组织内IL-1α、IL-6、GM-CSF、IL-8和TNF-α在mRNA水平均见明显升高。骨髓组织内细胞因子的主要来源是骨髓内的基质细胞，由此我们不难推测辐射后骨髓组织内上述细胞因子的表达升高是由基质细胞内的基因表达的改变引起的。但辐射引起骨髓基质细胞内基因表达改变的具体机制目前仍不清楚。
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NF-κB是细胞中一个重要的转录因子，它调控基因编码急性时相蛋白、细胞因子、免疫相关分子等，同时与抗凋亡基因的诱导表达有关。在末受刺激的细胞中，NF-κB与抑制蛋白IκB形成复合体存在于胞浆内。在INF-α、LPS和辐射等作用下IκB磷酸化并从NF-κB上解离下来，此时活化的NF-κB转移入核内启动基因的转录[7]。
8.0 Gy辐射损伤是造成极重度放射病的剂量，同时也常被用于小鼠骨髓移植预处理模型。本实验通过免疫组化的方法发现8.0 Gy60Co γ射线照射后1～2 h培养骨髓基质细胞内NF-κB即有明显的核转位，1～2 h开始，4 h在核内明显聚集；为了进一步对NF-κB的蛋白表达量作定量分析，我们又用Western blot的方法检测了NF-κB的p65亚基，发现辐照能够引起p65亚基蛋白表达量明显升高，至照射后8 h仍然未恢复正常水平；同时用凝胶电泳迁移率实验证实辐射后NF-κB有较高水平的活化，辐照后培养骨髓基质细胞内1～2 h即见NF-κB有明显的激活，4 h达高峰、6 h开始下降、8 h恢复正常。对于该实验结果我们作如下分析：60Co γ 射线照射作为对机体的一种损伤因素杀死骨髓内的造血细胞、损伤骨髓微环境，包括基质细胞。骨髓基质细胞一方面要保护自身——修复DNA和/或抗凋亡，另一方面又要适应机体/周围环境的需要作出应激——动员、加快骨髓的造血功能。骨髓基质细胞通过激活NF-κB能达到上述的目的，其依据有如下两点：①激活的NF-κB可以诱导TRAF1(TNFR-associated factor 1)、TRAF2、c-IAP1(inhibitor-of-apoptosis)、cIAP-2等抑凋亡相关基因的表达，这些基因的表达可以抑制凋亡通路中的Caspase的活化[2]，从而抑制照射引起的骨髓基质细胞的凋亡。②骨髓基质细胞内活化的NF-κB可以调控其下游基因的表达，如细胞因子G-CSF、GM-CSF、M-CSF、IL-6、TNF-α等[8]，这些细胞因子可以促进骨髓内残留的造血干细胞增殖、分化及向外周血动员。从这两方面分析来看，60Co γ射线照射后NF-κB在骨髓基质细胞内的激活是机体对辐射损伤的一种保护性应激反应。但从炎症反应的角度来分析NF-κB在骨髓基质细胞内的激活则可能会参与辐射对骨髓微环境的继发性损伤，其原因主要是NF-κB能诱导骨髓基质细胞表达或分泌一些前炎症因子如IL-8、TNF-α、IL-6、IL-1B等，这些前炎症因子可以吸引中性粒细胞向骨髓微环境内趋化或抑制其凋亡[9]。中性粒细胞在参与炎症反应的同时也对骨髓微环境造成不同程度的损伤，这可能是辐射后骨髓微环境支持造血功能长期不能恢复和骨髓纤维化的原因之一。这方面的研究有待进一步深入。
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基金项目：全军“九五”指令性公关资助项目(P6L045)
参考文献
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6，Chang CM,Limanni A,Baker WH,et al.Sublethal gamma irradiation increases IL-1α,IL-6,and TNF-α mRNA levels in murine hematopoietic tissues.J Interferon Cytokine Res,1997,17:567-572.
7，Timothy S,Blackwell,John W.The role of nuclear factor-kappa B in cytokine gene regulation.Am J Respir Cell Mol Biol,1997,17:3-9.
8，Thanos D,Maniatis T.NF-κB:a lesson in family values.Cell,1995,80:529-532.
9，Biffe WL,Morre EE,Barnett CC.Interleukin-6 delays neutrophil apoptosis.Arch Surgvol,1996,131:24-29.
(收稿日期:1999-12-24), 百拇医药