电离辐射对大鼠伤口中性粒细胞肌动蛋白的影响
作者：陈晓红 程天民 冉新泽
单位：(400038 重庆，第三军医大学中国人民解放军复合伤研究所)
关键词：放射复合伤； 中性粒细胞； 肌动蛋白
中华放射医学与防护杂志00604 【摘要】 目的 从伤口早期中性粒细胞(Neu)肌动蛋白(actin)的变化方面探讨全身γ射线照射后Neu吞噬、趋化功能变化的机理及促愈药康复新(W11-a12)的作用机理。方法 以大鼠6 Gy全身照射复合皮肤切割伤为模型，收集伤口细胞。用Fluorescein-鬼笔环肽标记Neu F-actin进行测定和观察。结果 复合伤组Neu F-actin含量先高后低，对FMLP反应性减弱，FMLP刺激后解聚慢，康复新能改善Neu F-actin的功能状态。结论 电离辐射引起Neu 肌动蛋白功能异常可能是Neu趋化、吞噬活性降低的重要原因，改善Neu F-actin的功能状态是康复新提高Neu吞噬和趋化功能的作用机理。
, 百拇医药
Effects of irradiation on actin in wound neutrophils of rats
CHEN Xiaohong,CHENG Tianmin,RAN Xinze.
(Institute of Combined Injury of PLA,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China)
【Abstract】 Objective To explore the mechanism of decreased phagocyotic and chemotactic function of neutrophils (Neu) and the mechanism of W11-a12's pharmacological action by studying the changes of actin of Neu in wound after total body irradiation of rats. Methods Cells were collected from incision wounds on back of rats after 6 Gy whole body-irradiation.F-actin in Neu was stained with Fluorescein-phalloidin. Results There were increased (3～12 h) and decreased (24 h,48 h) basal levels of F-actin,a lower responsiveness to stimulation and a reduced rate of actin depolymerization after combined radiation injury compared with simple wound group,which were important causes of Neu dysfunction. Conclusion W11-a12 could improve the functional state of Neu actin,which may contribute to the improved chemotactic and phagocytotic function of Neu after administration of this drug.
, 百拇医药
【Key words】 Wound combined with radiation injury; Neutrophils; Actin
全身放射损伤导致伤口愈合延缓，主要与造血功能受抑制，伤口局部炎细胞减少有关[1]。我们前期的研究表明，大鼠6 Gy全身照射后，伤口中性粒细胞(neutrophils,Neu)的数量和吞噬、趋化功能在伤后24 h以前就明显降低，促愈药康复新则能显著提高伤口Neu的数量和功能。本研究将从Neu肌动蛋白(F-actin)方面探讨这些变化发生的机理。
材料和方法
1.康复新原药，主要成分为多元醇类化合物W11-a12,由云南大理医学院药理教研室李树楠教授提供。
2.实验动物与分组：Wistar大鼠144只，体重(200±20) g，雌雄兼用，由本校动物所提供。动物随机分为4个组，单纯创伤组(单创组，SW)；6 Gy放射复合创伤组(6RW)；SW用药组和6RW的用药组。
, 百拇医药
3.致伤模型：将海绵切成0.9 cm×1\^2 cm×4 cm大小，经煮沸消毒，分别浸入无菌生理盐水或10 mg/ml的康复新生理盐水中过夜，备用。动物经麻醉后，在背部脊柱两侧1.5 cm处各切开皮肤8 cm长，切口深达皮下浅筋膜，压迫止血后，随机选择一侧埋入生理盐水海绵两个，另一侧埋入康复新海绵两个，缝合切口。复合伤各组动物在60Co γ射线照射后1 h内致创伤。
4.伤口细胞收集：致伤后3、6、12、24和48 h活杀动物，取出海绵，分离细胞。
5.F-actin含量测定：FITC-鬼笔环肽(F-432，Molecular probe)标记F-actin按产品说明书进行。荧光分光光度计测定F-actin相对含量，按公式计算[2]：
FMLP刺激30 s F-actin增加倍数=(FMLP作用30 s F-actin含量)/(未加FMLP时F-actin含量)
, 百拇医药
FMLP刺激5 min后F-actin的解聚率=(FMLP作用30 s F-actin含量-FMLP作用5 min时F-actin含量)/(FMLP作用30 s时F-actin含量)×100%
6.F-actin形态观察：Neu涂于载玻片上，F-actin荧光染色同上，激光共聚焦显微镜(Leica NTS16521)观察，照像。
7.Neu扫描电镜观察：常规方法。
8.统计处理：数据经Microsoft excel统计程序处理，t检验求出P值。
表1 6RW组伤口Neu F-actin含量变化及康复新的作用(n=6) 组别
F-actin含量
伤后3 h
, 百拇医药
伤后6 h
伤后12 h
伤后24 h
伤后48 h
单创组
37.43±6.66
38.44±5.81
40.71±4.62
47.69±8.94
49.18±12.66
单创+康复新
-
, 百拇医药
-
-
44.20±5.19
-
6RW
44.25±8.92
62.76±8.84**
46.20±7.53
34.40±4.30**
30.61±5.27
6RW+康复新
-
, 百拇医药
-
-
45.80±9.81＃
-
注：“-”表示未测相应值；6RW与单创组比，**P<0.01;与未用药组比，#P<0.05结 果
1.F-actin含量和功能变化
表1结果显示，6RW组伤口Neu中F-actin相对含量在伤后3 h至12 h先高于单创组，24 h后又低于单创组。使用康复新后，单创组24 h时相点Neu F-actin含量无明显变化。6RW组伤后24 h相应值明显升高。经FMLP刺激后F-actin增加的倍数及解聚率，6RW组均较单创组低(表2)。由于我们以前的实验表明，康复新对Neu数量增加及Neu吞噬、趋化功能的改善，在伤后24 h、48 h差异才有显著性，故我们以24 h时相点为代表，观察该药对Neu F-actin的影响。使用康复新后，单创组、6RW组伤后24 h的Neu经FMLP刺激后F-actin增加倍数及解聚率明显提高(P<0.05)。
, 百拇医药
2.F-actin激光共聚焦显微镜观察：6RW组伤口Neu的F-actin形态与单创组无明显差异，其F-actin荧光强度变化趋势及FMLP刺激后的变化与荧光光度计测定结果相符(数据未列出)。
表2 大鼠伤口Neu F-actin
增加倍数及解聚率变化(n=6) 伤后时间(h)
F-actin增加倍数
F-actin解聚率
单创组
6RW
单创组
6RW
3
, 百拇医药
1.79±0.09
1.70±0.21
0.30±0.43
0.29±0.08
6
1.72±0.11
1.25±0.18**
0.33±0.06
0.15±0.06**
12
1.66±0.22
, 百拇医药
1.35±0.22*
0.32±0.11
0.18±0.07*
24
1.70±0.29
1.18±0.30*
0.35±0.06
0.22±0.04**
用药组24
1.98±0.16#
, http://www.100md.com 1.53±0.19#
0.41±0.03#
0.28±0.05#
48
1.62±0.39
1.12±0.28*
0.32±0.11
0.13±0.05**
注：与单创组比，*P<0.05;**P<0.01;与未用药组比，#P<0.05
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图1 扫描电镜观察单创组24 h伤口中性粒
细胞(见细胞表面突起较多 ×7 000)
图2 扫描电镜观察放射复合伤组24 h伤口中性粒细胞
(见细胞表面突起较少，细胞变得较为平滑 ×3 500)
3.伤口Neu扫描电镜观察：伤后24 h，单创组伤口Neu外表面有很多伪足样突起(图1)，同一时相点，6RW组Neu细胞的表面这种突起变少，表面较平滑的Neu增多(图2)，6 Gy复合伤+康复新组，细胞表面较平滑的细胞明显减少，与单创组表面形态相似的细胞增多。
讨 论
Neu向炎症部位的迁移过程包括胞内微丝系统一系列动力学变化。肌动蛋白(actin)占Neu胞浆蛋白重量的10%，是Neu细胞骨架的主要成分，一旦激活，它迅速聚集成为F-actin，产生力量，参与细胞的运动、变形、伪足形成、吞噬、分泌等[3]。伤口液中有一定水平细胞因子刺激F-actin形成，故单创组Neu表面表现为较多伪足样突起，复合伤组24 h Neu表面伪足明显少于单创组，细胞表面变平滑，说明该组细胞F-actin聚合少。维持细胞运动活性，需要不断地修饰微丝网络，包括肌动蛋白聚合(F-actin)与解聚状态(G-actin)的转换及肌动蛋白与其调节蛋白的相互作用等[4]。本研究发现，6RW组大鼠伤口Neu F-actin含量在3～12 h高于单创组，这可能与复合伤引起机体更强的应激反应，大量的细胞因子，如PAF，IL-8，LTB及内毒素等释放入血及局部伤口，激活Neu有关。舒崇湘等报道[5]，放烧复合伤1 d后，Neu的自身氧化代谢产物增加。氧化代谢产物可以破坏骨架，抑制F-actin形成[6]，所以复合伤组Neu中自身氧化增加，可能是伤后24、48 h 6RW组伤口Neu F-actin含量的降低的原因。
, 百拇医药
F-actin基础值过高或过低均可能引起Neu吞噬、趋化等功能降低[7，8]。
FMLP刺激Neu后，Neu内F-actin迅速增多，30～60 s达到峰值，然后F-actin解聚，含量逐渐下降，用1 μmol/L FMLP刺激，10 min后F-actin含量已基本降至基础值。我们在预实验中发现6RW与单创组Neu经FMLP刺激后的反应曲线相似，峰值均在30 s，于是重点测定了1 μmol/L FMLP刺激后30 s(峰值)F-actin的增加倍数及5 min后F-actin的解聚率。结果显示，无论6 RW组伤口Neu的F-actin基础值较单创组高或是低，FMLP引起的F-actin增加倍数及解聚率均较单创组低，说明①6RW组伤口Neu对FMLP反应性减弱；②解聚率低则反映Neu不能灵活地进行F-actin与G-actin之间变换，细胞钢性增加，活性受限。以往作者都同意这两种情况均表明actin功能受损，这必然引起Neu趋化(chemotaxis)、化学激活(chemokinesis)、自发运动、吞噬、分泌等功能降低[2，8]。
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组织修复随着组织创伤的发生而发生。正常的炎症反应对于组织修复的顺利进行非常重要。一般认为，急性炎症反应的主干细胞——Neu在伤口局部主要的作用是吞噬外来病原体，消除坏死组织，为修复创造条件。所以放射复合伤后Neu actin功能受损，伤口局部Neu数量或功能的下降均可导致局部非特异性免疫功能减弱，影响修复进程。
康复新能有效促进单纯创伤和放射复合伤伤口的愈合[9]，其作用与增加伤口局部Neu的数量和吞噬、趋化功能有关，本实验说明，改善Neu的actin的功能状态，使Neu对刺激剂反应性增强，反应更灵活，这是康复新上述作用的基础之一。
基金项目：重庆市科委院士基金资助项目(98-5081)；国家重点基础研究973专项经费资助项目(G1999054205)
参考文献
[1]程天民，邹仲敏.放射复合伤的研究进展.中华放射医学与防护杂志，1998，18：299-304.
, 百拇医药
[2]Vindenes HA,Bjernes R.Impaired actin polymerization and depolymerization in neutrophils from patients with thermal injury.Burns,1997,23:131-136.
[3]Southwick FS,Stossel TP.Contractile proteins in leukocyte function.Semin Hematol,1983,20:305-321.
[4]Stossel TP.Actin-membrane interactions in eucaryotic cells.Curr Top Membr Transport,1990,36:97-107.
[5]舒崇湘，陈宗荣，王松宝.大鼠5 Gy照射复合15%Ⅲ度烧伤后中性粒细胞吞噬功能变化机理研究.第三军医大学学报，1995.17：24-28.
, 百拇医药
[6]Rollet labelle E,Grange MJ,Elbimc,et al.Hydroxyl radical as a potential intracellular mediator of polymorphonuclear neutrophil apoptosis.Free Radic Biol Med,1998,24:563-572.
[7]Hilmo A,Howard TH.F-actin content of neonate and adult neutrophils.Blood,1987,69:945-949.
[8]de Chalain TMB,Bracher M,Linley W,et al.Cytoskeletal actin:the influence of major burns on neutrophil structure and function.Burns,1994,20:416-421.
[9]舒崇湘，程天民.康复新对单纯皮肤创面和合并全身放射损伤时的促愈作用.第三军医大学学报，1999，21：164-168.
(收稿日期:1999-09-08), http://www.100md.com
单位：(400038 重庆，第三军医大学中国人民解放军复合伤研究所)
关键词：放射复合伤； 中性粒细胞； 肌动蛋白
中华放射医学与防护杂志00604 【摘要】 目的 从伤口早期中性粒细胞(Neu)肌动蛋白(actin)的变化方面探讨全身γ射线照射后Neu吞噬、趋化功能变化的机理及促愈药康复新(W11-a12)的作用机理。方法 以大鼠6 Gy全身照射复合皮肤切割伤为模型，收集伤口细胞。用Fluorescein-鬼笔环肽标记Neu F-actin进行测定和观察。结果 复合伤组Neu F-actin含量先高后低，对FMLP反应性减弱，FMLP刺激后解聚慢，康复新能改善Neu F-actin的功能状态。结论 电离辐射引起Neu 肌动蛋白功能异常可能是Neu趋化、吞噬活性降低的重要原因，改善Neu F-actin的功能状态是康复新提高Neu吞噬和趋化功能的作用机理。
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Effects of irradiation on actin in wound neutrophils of rats
CHEN Xiaohong,CHENG Tianmin,RAN Xinze.
(Institute of Combined Injury of PLA,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China)
【Abstract】 Objective To explore the mechanism of decreased phagocyotic and chemotactic function of neutrophils (Neu) and the mechanism of W11-a12's pharmacological action by studying the changes of actin of Neu in wound after total body irradiation of rats. Methods Cells were collected from incision wounds on back of rats after 6 Gy whole body-irradiation.F-actin in Neu was stained with Fluorescein-phalloidin. Results There were increased (3～12 h) and decreased (24 h,48 h) basal levels of F-actin,a lower responsiveness to stimulation and a reduced rate of actin depolymerization after combined radiation injury compared with simple wound group,which were important causes of Neu dysfunction. Conclusion W11-a12 could improve the functional state of Neu actin,which may contribute to the improved chemotactic and phagocytotic function of Neu after administration of this drug.
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【Key words】 Wound combined with radiation injury; Neutrophils; Actin
全身放射损伤导致伤口愈合延缓，主要与造血功能受抑制，伤口局部炎细胞减少有关[1]。我们前期的研究表明，大鼠6 Gy全身照射后，伤口中性粒细胞(neutrophils,Neu)的数量和吞噬、趋化功能在伤后24 h以前就明显降低，促愈药康复新则能显著提高伤口Neu的数量和功能。本研究将从Neu肌动蛋白(F-actin)方面探讨这些变化发生的机理。
材料和方法
1.康复新原药，主要成分为多元醇类化合物W11-a12,由云南大理医学院药理教研室李树楠教授提供。
2.实验动物与分组：Wistar大鼠144只，体重(200±20) g，雌雄兼用，由本校动物所提供。动物随机分为4个组，单纯创伤组(单创组，SW)；6 Gy放射复合创伤组(6RW)；SW用药组和6RW的用药组。
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3.致伤模型：将海绵切成0.9 cm×1\^2 cm×4 cm大小，经煮沸消毒，分别浸入无菌生理盐水或10 mg/ml的康复新生理盐水中过夜，备用。动物经麻醉后，在背部脊柱两侧1.5 cm处各切开皮肤8 cm长，切口深达皮下浅筋膜，压迫止血后，随机选择一侧埋入生理盐水海绵两个，另一侧埋入康复新海绵两个，缝合切口。复合伤各组动物在60Co γ射线照射后1 h内致创伤。
4.伤口细胞收集：致伤后3、6、12、24和48 h活杀动物，取出海绵，分离细胞。
5.F-actin含量测定：FITC-鬼笔环肽(F-432，Molecular probe)标记F-actin按产品说明书进行。荧光分光光度计测定F-actin相对含量，按公式计算[2]：
FMLP刺激30 s F-actin增加倍数=(FMLP作用30 s F-actin含量)/(未加FMLP时F-actin含量)
, 百拇医药
FMLP刺激5 min后F-actin的解聚率=(FMLP作用30 s F-actin含量-FMLP作用5 min时F-actin含量)/(FMLP作用30 s时F-actin含量)×100%
6.F-actin形态观察：Neu涂于载玻片上，F-actin荧光染色同上，激光共聚焦显微镜(Leica NTS16521)观察，照像。
7.Neu扫描电镜观察：常规方法。
8.统计处理：数据经Microsoft excel统计程序处理，t检验求出P值。
表1 6RW组伤口Neu F-actin含量变化及康复新的作用(n=6) 组别
F-actin含量
伤后3 h
, 百拇医药
伤后6 h
伤后12 h
伤后24 h
伤后48 h
单创组
37.43±6.66
38.44±5.81
40.71±4.62
47.69±8.94
49.18±12.66
单创+康复新
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, 百拇医药
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44.20±5.19
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6RW
44.25±8.92
62.76±8.84**
46.20±7.53
34.40±4.30**
30.61±5.27
6RW+康复新
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45.80±9.81＃
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注：“-”表示未测相应值；6RW与单创组比，**P<0.01;与未用药组比，#P<0.05结 果
1.F-actin含量和功能变化
表1结果显示，6RW组伤口Neu中F-actin相对含量在伤后3 h至12 h先高于单创组，24 h后又低于单创组。使用康复新后，单创组24 h时相点Neu F-actin含量无明显变化。6RW组伤后24 h相应值明显升高。经FMLP刺激后F-actin增加的倍数及解聚率，6RW组均较单创组低(表2)。由于我们以前的实验表明，康复新对Neu数量增加及Neu吞噬、趋化功能的改善，在伤后24 h、48 h差异才有显著性，故我们以24 h时相点为代表，观察该药对Neu F-actin的影响。使用康复新后，单创组、6RW组伤后24 h的Neu经FMLP刺激后F-actin增加倍数及解聚率明显提高(P<0.05)。
, 百拇医药
2.F-actin激光共聚焦显微镜观察：6RW组伤口Neu的F-actin形态与单创组无明显差异，其F-actin荧光强度变化趋势及FMLP刺激后的变化与荧光光度计测定结果相符(数据未列出)。
表2 大鼠伤口Neu F-actin
增加倍数及解聚率变化(n=6) 伤后时间(h)
F-actin增加倍数
F-actin解聚率
单创组
6RW
单创组
6RW
3
, 百拇医药
1.79±0.09
1.70±0.21
0.30±0.43
0.29±0.08
6
1.72±0.11
1.25±0.18**
0.33±0.06
0.15±0.06**
12
1.66±0.22
, 百拇医药
1.35±0.22*
0.32±0.11
0.18±0.07*
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1.70±0.29
1.18±0.30*
0.35±0.06
0.22±0.04**
用药组24
1.98±0.16#
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0.41±0.03#
0.28±0.05#
48
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1.12±0.28*
0.32±0.11
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注：与单创组比，*P<0.05;**P<0.01;与未用药组比，#P<0.05
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图1 扫描电镜观察单创组24 h伤口中性粒
细胞(见细胞表面突起较多 ×7 000)
图2 扫描电镜观察放射复合伤组24 h伤口中性粒细胞
(见细胞表面突起较少，细胞变得较为平滑 ×3 500)
3.伤口Neu扫描电镜观察：伤后24 h，单创组伤口Neu外表面有很多伪足样突起(图1)，同一时相点，6RW组Neu细胞的表面这种突起变少，表面较平滑的Neu增多(图2)，6 Gy复合伤+康复新组，细胞表面较平滑的细胞明显减少，与单创组表面形态相似的细胞增多。
讨 论
Neu向炎症部位的迁移过程包括胞内微丝系统一系列动力学变化。肌动蛋白(actin)占Neu胞浆蛋白重量的10%，是Neu细胞骨架的主要成分，一旦激活，它迅速聚集成为F-actin，产生力量，参与细胞的运动、变形、伪足形成、吞噬、分泌等[3]。伤口液中有一定水平细胞因子刺激F-actin形成，故单创组Neu表面表现为较多伪足样突起，复合伤组24 h Neu表面伪足明显少于单创组，细胞表面变平滑，说明该组细胞F-actin聚合少。维持细胞运动活性，需要不断地修饰微丝网络，包括肌动蛋白聚合(F-actin)与解聚状态(G-actin)的转换及肌动蛋白与其调节蛋白的相互作用等[4]。本研究发现，6RW组大鼠伤口Neu F-actin含量在3～12 h高于单创组，这可能与复合伤引起机体更强的应激反应，大量的细胞因子，如PAF，IL-8，LTB及内毒素等释放入血及局部伤口，激活Neu有关。舒崇湘等报道[5]，放烧复合伤1 d后，Neu的自身氧化代谢产物增加。氧化代谢产物可以破坏骨架，抑制F-actin形成[6]，所以复合伤组Neu中自身氧化增加，可能是伤后24、48 h 6RW组伤口Neu F-actin含量的降低的原因。
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F-actin基础值过高或过低均可能引起Neu吞噬、趋化等功能降低[7，8]。
FMLP刺激Neu后，Neu内F-actin迅速增多，30～60 s达到峰值，然后F-actin解聚，含量逐渐下降，用1 μmol/L FMLP刺激，10 min后F-actin含量已基本降至基础值。我们在预实验中发现6RW与单创组Neu经FMLP刺激后的反应曲线相似，峰值均在30 s，于是重点测定了1 μmol/L FMLP刺激后30 s(峰值)F-actin的增加倍数及5 min后F-actin的解聚率。结果显示，无论6 RW组伤口Neu的F-actin基础值较单创组高或是低，FMLP引起的F-actin增加倍数及解聚率均较单创组低，说明①6RW组伤口Neu对FMLP反应性减弱；②解聚率低则反映Neu不能灵活地进行F-actin与G-actin之间变换，细胞钢性增加，活性受限。以往作者都同意这两种情况均表明actin功能受损，这必然引起Neu趋化(chemotaxis)、化学激活(chemokinesis)、自发运动、吞噬、分泌等功能降低[2，8]。
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组织修复随着组织创伤的发生而发生。正常的炎症反应对于组织修复的顺利进行非常重要。一般认为，急性炎症反应的主干细胞——Neu在伤口局部主要的作用是吞噬外来病原体，消除坏死组织，为修复创造条件。所以放射复合伤后Neu actin功能受损，伤口局部Neu数量或功能的下降均可导致局部非特异性免疫功能减弱，影响修复进程。
康复新能有效促进单纯创伤和放射复合伤伤口的愈合[9]，其作用与增加伤口局部Neu的数量和吞噬、趋化功能有关，本实验说明，改善Neu的actin的功能状态，使Neu对刺激剂反应性增强，反应更灵活，这是康复新上述作用的基础之一。
基金项目：重庆市科委院士基金资助项目(98-5081)；国家重点基础研究973专项经费资助项目(G1999054205)
参考文献
[1]程天民，邹仲敏.放射复合伤的研究进展.中华放射医学与防护杂志，1998，18：299-304.
, 百拇医药
[2]Vindenes HA,Bjernes R.Impaired actin polymerization and depolymerization in neutrophils from patients with thermal injury.Burns,1997,23:131-136.
[3]Southwick FS,Stossel TP.Contractile proteins in leukocyte function.Semin Hematol,1983,20:305-321.
[4]Stossel TP.Actin-membrane interactions in eucaryotic cells.Curr Top Membr Transport,1990,36:97-107.
[5]舒崇湘，陈宗荣，王松宝.大鼠5 Gy照射复合15%Ⅲ度烧伤后中性粒细胞吞噬功能变化机理研究.第三军医大学学报，1995.17：24-28.
, 百拇医药
[6]Rollet labelle E,Grange MJ,Elbimc,et al.Hydroxyl radical as a potential intracellular mediator of polymorphonuclear neutrophil apoptosis.Free Radic Biol Med,1998,24:563-572.
[7]Hilmo A,Howard TH.F-actin content of neonate and adult neutrophils.Blood,1987,69:945-949.
[8]de Chalain TMB,Bracher M,Linley W,et al.Cytoskeletal actin:the influence of major burns on neutrophil structure and function.Burns,1994,20:416-421.
[9]舒崇湘，程天民.康复新对单纯皮肤创面和合并全身放射损伤时的促愈作用.第三军医大学学报，1999，21：164-168.
(收稿日期:1999-09-08), http://www.100md.com