238Pu α粒子诱发人支气管上皮细胞BEP2D转化的初步研究
作者：楼铁柱 项晓琼 吴德昌
单位：军事医学科学院放射医学研究所 北京，100850
关键词：238Pu；α粒子；BEP2D；细胞转化
中国肺癌杂志000608 【摘要】目的 建立氡及其子体诱发细胞转化的模型，模拟氡致肺癌的过程。方法 利用238PuO2释放的α粒子，照射体外培养的人支气管上皮细胞系BEP2D，诱发转化。结果 1.5Gy单次照射的R15H细胞在连续培养22周后获得了转化，转化细胞逐步发生生长动力学和形态学的改变，生长失去接触抑制，ConA凝集现象明显，获得对血清诱导末端分化的抗性和锚着独立性生长能力，与对照细胞相比均有统计学意义上的增强。结论 从BEP2D到α粒子转化的R15H细胞能够在一定程度上模拟体内肿瘤的发生发展过程，可以为深入了解肺支气管肿瘤发生多阶段过程中的细胞和分子机理提供研究模型。
, 百拇医药
【中图分类号】R734.2；R730.231
Transformation of human bronchial epithelial cells BEP2D induced by 238Pu α-particles
LOU Tiezhu,XIANG Xiaoqiong,WU Dechang
(Institute of Radiation Medicine,Academy of Military Medicine Science,Beijing 100850,P.R.China)
【Abstract】Objective To establish a model for the study of transformation of human cell by radon and its progeny.Methods BEP2D,a HPV18 immortalized human bronchial epithelial cell line,was irradiated with high-energy α-particles emitted by 238Pu.Results A single 1.5Gy dose of α-particles induced transformation of the cells.A series of sequential steps arose among transformed cells,including altered growth kinetics,resistance to serum-induced terminal differentiation,and anchorage-independence growth.Conclusion This cell line may provide a model to study the cellular and molecular changes at various stages in radiation carcinogenesis.
, 百拇医药
【Key words】238Pu α-particles BEP2D Cell transformation
流行病学研究表明，辐射是已知的环境致癌因子，氡及其子体则是人类本底辐射的最主要成分，天然本底辐射的50%来自氡及其子体，它广泛存在于环境与居室中，对人类健康构成威胁[1]。长期暴露于高水平的氡子体的铀矿工人是辐射诱发肺癌的高危人群， 但这种高水平辐射诱发肿瘤的细胞和分子机理尚不清楚。此外对于低水平的居室氡是否增加癌症危险的遗传负担，氡暴露致癌是否具有阈值，仍有争论[2]。因此，需要深入研究氡致肺癌的机理，以保护人类和高危人群免受或降低辐射致癌的危险。
体外细胞转化实验是研究氡及其子体α粒子致癌的有效方法，能很好地模拟体内致癌的多阶段过程。人类癌症多起源于上皮组织，用上皮细胞进行研究能更好地模拟人体癌症发生的自然过程，是辐射致癌研究的发展趋势。人支气管上皮细胞系BEP2D，1991年由Harris用克隆的全长人乳头瘤病毒(human papillomaviruses 18， HPV18)转染正常人支气管上皮细胞(NHBE)构建获得永生化，但尚未获得恶性转化特性[3]。本研究采用238Pu α粒子照射该细胞，以获得转化细胞特别是转化的早期细胞，建立理想的氡致肺癌研究模型。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 细胞及其培养 BEP2D细胞由Harris教授提供；LHC-8无血清培养液由Biofluids公司生产，部分自配，配方参考Leehner等[4]的方法。培养瓶用纤连蛋白包被，接种5×105/T25培养瓶，加4?ml培养液，37℃、5%CO2培养箱中孵育，每3天换液，每周传代1次。
1.2 α粒子体外照射 α照射装置为238PuO2电沉积源，总放射性活度200?MBq，膜过滤后能量为3.94?MeV，剂量率0.2?Gy/min。照射方式参照张欣等[5]建立的模型。首先制作α照射平皿，在无底玻璃环底边涂抹混合胶，平放于Mylar膜上，135℃烘烤3小时制成。将指数生长期的5×105细胞接种于照射皿中，培养24小时，细胞贴壁后进行α粒子照射。
, 百拇医药
1.3 细胞存活效应 BEP2D细胞经α粒子照射，剂量分别为0.3、0.6、1.0、1.5、2.0?Gy，胰酶消化，收集细胞，接种到60?mm平皿中，每皿1?000个细胞，每个剂量重复三次，37℃培养14天后，甲醇固定，吉姆萨染色，计数各平皿克隆数，再计算克隆形成率(CFE)和相对存活率。
CFE(%)＝克隆数/接种细胞数×100%
相对存活率＝该剂量下的CFE / 对照组的CFE
1.4 接种效率 正常和照射后不同代龄细胞以500～1?000细胞/皿接种到60?mm平皿中，连续培养14天，10%甲醛固定，吉姆萨染色，计数克隆数，求出接种效率即CFE。
1.5 细胞转化的鉴定
1.5.1 血清抗性试验 500～1?000个指数生长的正常和照射后细胞分别接种到60?mm平皿中，加入3.0?ml含10%胎牛血清的LHC-8培养液，14天后固定染色，计数集落数，求出CFE。血清抗性＝10%血清培养时CFE/无血清培养时CFE 。
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1.5.2 锚着独立性(AIG)试验 为检测细胞的软琼脂克隆形成能力，正常和照后细胞以2×104/皿的浓度接种于0.35%的顶层琼脂中，底层琼脂浓度为0.7%，3天换液一次，连续培养4周，计数大于50个细胞的克隆数，求出CFE。
1.5.3 刀豆球蛋白A(ConA)凝集试验 向凹孔玻璃板中加入0.1?ml 5 ×105细胞悬液，再分别加入不同体积的ConA，终浓度依次为100、50、25、12.5和0(对照)μg/ml，在微型振荡器上振荡15分钟后，确定细胞凝集程度的强弱。
1.6 统计学处理 检测结果均以
表示，采用方差分析。
2 结果
2.1 BEP2D细胞存活效应 不同剂量的α粒子致BEP2D细胞相对存活率如表1，拟合存活曲线方程式为：S＝EXP(1-D/0.78)，辐射敏感性参数D0＝0.78?Gy，Dq＝0，n＝1，呈单击单靶模型。随α粒子照射剂量增加，细胞存活呈指数下降，符合α粒子照射规律。
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2.2 受照后细胞的形态学和生长特性 BEP2D细胞在1.5?Gy α粒子照射后连续培养，观察它的形态学特性。将受照细胞命名为R15H细胞，以与BEP2D细胞相区别；在照射后第22周，第20代细胞(R15Hp20)出现形态学变化，与正常细胞相比，R15H细胞呈现异形性，核质比例增大，核仁大而多；细胞间失去接触抑制，呈复层重叠生长；细胞黏附性较差，易脱落。电镜观察可见细胞变异明显，核浆比例增大，核仁突出，常有多个核仁，细胞器丰富，细胞骨架排列紊乱不规则(图1)。
表 1 不同剂量α粒子致BEP2D细胞的存活率
Tab 1 Relative survival fractions of BEP2D
cells exposed to α-particles Dose(Gy)
CFE(%)
, http://www.100md.com
Relative survival fraction(%)
0
17.68
100
0.3
14.85
84.0
0.6
9.63
54.5
1.0
4.50
, 百拇医药 25.5
1.5
2.50
14.1
2.0
1.27
7.2
图 1 R15Hp20细胞的透射电镜观察结果(×4?500)
Fig 1 Electronograph of transformed R15H cells (×4?500)
2.3 细胞生长曲线和接种效率 对正常细胞和受照后细胞分别测定生长曲线，得到其倍增时间(population double time，PDT)，正常细胞约为65小时，R15Hp5细胞则为44～48小时，生长速率明显提高。正常细胞的接种效率在10%～15%，R15H细胞随传代逐渐提高到20%～30%。
, 百拇医药
2.4 细胞转化的鉴定
2.4.1 ConA凝集试验 用刀豆球蛋白ConA处理细胞后，发现正常细胞凝集作用较弱，而R15Hp20细胞凝集明显。
表 2 BEP2D和R15H细胞的接种效率
Tab 2 Planting efficiency of BEP2D and transformed R15H cells Cells
No.of cells
No.of clone
CFE(%)
P value
(comparing
, http://www.100md.com
with BEP2D)
BEP2D
1?000
152
15.2
-
R15Hp10
500
88
17.6
>0.05
R15Hp20
500
, http://www.100md.com
115
23.0
<0.05
R15Hp30
500
146
29.2
<0.05
表 3 BEP2D细胞和R15Hp20细胞的ConA凝集试验结果
Tab 3 Agglutination of BEP2D and R15Hp20
cells treated with ConA ConA dose(μg/ml)
, 百拇医药
0
12.5
25
50
100
BEP2D
-
-
+
+
R15Hp20
-
, 百拇医药
+
2.4.2 血清抗性试验 正常和R15H细胞分别在无血清和10%血清的LHC-8中培养，结果显示R15Hp20和R15Hp30均出现明显的对血清促分化能力的抗性(P<0.05)。表 4 BEP2D和R15H细胞对血清促分化能力的抗性
Tab 4 Resistance to serum-induced terminal differentiation of BEP2D and R15H cells Cells
No.of cells
, 百拇医药 No.of clone
CFE(%)
Relative resistance(%)
P value
(comparing with BEP2D)
Serum-free
10% serum
Serum-free
10% serum
BEP2D
1?000
, 百拇医药
152
7
15.2
0.7
4.6
-
R15Hp10
500
88
5
17.6
1
5.7
, http://www.100md.com >0.05
R15Hp20
500
115
34
23
6.8
29.6
<0.05
R15Hp30
500
146
82
, http://www.100md.com
29.2
16.4
56.2
<0.05
2.4.3 AIG特性 检测细胞在双层软琼脂中的克隆形成率，R15H细胞在第5代时克隆形成率很低，但从第20代开始，CFE明显升高，与对照组比较有显著差异(P<0.05)。表 5 R15H细胞的软琼脂克隆形成率
Tab 5 CFE in soft agar of transformed R15H cells Cells
No.of clone
CFE(%)
P Value
, 百拇医药
(comparing with BEP2D)
BEP2D
6
0.03
-
R15Hp5
10
0.05
>0.05
R15Hp20
26
0.13
<0.05
, 百拇医药
R15Hp30
70
0.35
<0.05
3 讨论
我们对HPV18永生化的人支气管上皮细胞BEP2D，进行α粒子诱导转化的研究，发现经1.5?Gy照射后的细胞R15H，在连续培养5个月之后，第20代细胞首先出现细胞形态学的改变，这是细胞受照后发生的最早可观察到的变化。为证实其转化性，首先进行ConA凝集试验，正常细胞和R15H细胞的凝集度不同，因为转化细胞表面抗原特性发生变化，ConA受体明显增加，改变了正常的细胞互相识别，细胞的凝集程度明显增强。进一步进行血清诱导分化试验，血清和促癌剂(TPA)能使正常上皮细胞鳞状分化，而转化细胞和癌细胞则具有抵抗能力，因此把对血清的分化抗性看作上皮细胞转化的一个特征。结果发现R15H细胞在第10代时还不具有血清抗性，而自20代后对血清分化产生抗性，保持增殖能力，而正常细胞出现鳞状分化逐渐死亡，表明α粒子照射使细胞向着转化方向发展。锚着独立性生长是指受致癌因素作用的细胞对细胞间通讯的依赖性降低，具有在低密度条件下在半固体琼脂中形成集落的能力，锚着独立性生长和裸鼠体内成瘤性具有很好的一致性[6]。在本试验中，R15H细胞20代转化细胞软琼脂克隆形成率为0.13%，30代时达到0.35%，与正常细胞相比，差异显著，而5代细胞不能形成软琼脂克隆，说明其尚未发生转化，表明了细胞转化特性的获得是一个渐进的过程。
, 百拇医药
从本实验结果可以看出，BEP2D细胞在α粒子照射后发生了一系列连续的变化。在照后早期的第5和10代细胞，虽然接种效率和生长曲线有所提高，但形态学没有变化，更不具有转化特性，可以认为是细胞转化之前的阶段；在第20代以后，细胞不仅发生显著的形态学改变，复层重叠生长，接种效率明显提高，而且在恶性转化鉴定实验中ConA凝集、血清抗性和AIG能力均显著增强，并随着传代细胞的恶性程度逐渐增强，表明R15H细胞开始发生转化，但在裸鼠成瘤之前仍处于转化的早期阶段。在以上观察中，形态学、血清抗性和AIG与细胞转化程度有密切关系，可以作为鉴定细胞转化的重要指标。
我们认为，BEP2D细胞体外转化与体内癌症的发生相似，是一个多阶段的连续发展过程。HPV病毒诱导的永生化是细胞转化的启动阶段，它的进一步发展需要其它因素的参与。α粒子照射则促使细胞向转化发展，在细胞照射后可观察到细胞表型如克隆形态和生长方式的明显改变，包括细胞生长、增殖异常、转化灶的形成、克隆效率增加、生长速度加快和寿命延长。进一步发展，形态改变的细胞开始具有锚着独立性生长能力，AIG能力是体外细胞转化的重要指标，对应于细胞在体内的恶性增殖，是细胞处在癌前病变并向癌变发展的关键阶段。如果转化细胞进一步能在适合的宿主(如裸鼠)体内成瘤，表明转化细胞已经获得了恶性特性，成为了肿瘤细胞。从上述细胞转化的进展过程，可以看到体外转化能够在一定程度上模拟体内肿瘤的发生，验证了致癌的“启动—促进—发展”多阶段理论。表明BEP2D以及α粒子转化的R15H细胞模型不仅有助于研究肺支气管肿瘤的发生机理，而且对于深入了解转化和癌变多阶段发生过程中的细胞和分子机理具有重要价值。
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本研究由国家重点基础研究专项经费(G1998051200)资助
参考文献
1，UNSCEAR report: sources and effects of ionizing radiation.UN,1993.1-3.
2，ICRP publication 65.Protection against radon-222: at home and at work.Annals ICRP,1993,23(1)∶1-2.
3，Willey JC,Broussoud A,Sleemi A,et al.Immortalization of normal human bronchial epithelial cells by human papillomavirus 16 or 18.Cancer Res,1991,51(6)∶5370-5377.
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4，Lechner JF,LaVeck MA.A serum-free method for culturing normal human bronchial epithelial cells at clonal density.J Tissue Culture Methods,1985,9(2)∶43-48.
5，张欣,郑文忠,龚诒芬,等.用于细胞放射生物学研究的α照射模型.辐射防护,1996,16(3)∶192-201.
6，Hei TK,Wu LJ,Piao CQ.Malignant transformation of immortalized human bronchial epithelial cells by asbestos fibers.Environ Health Perspect,1997,105(S5)∶1085.
收稿日期：1999-11-03
修回日期：2000-03-04, http://www.100md.com
单位：军事医学科学院放射医学研究所 北京，100850
关键词：238Pu；α粒子；BEP2D；细胞转化
中国肺癌杂志000608 【摘要】目的 建立氡及其子体诱发细胞转化的模型，模拟氡致肺癌的过程。方法 利用238PuO2释放的α粒子，照射体外培养的人支气管上皮细胞系BEP2D，诱发转化。结果 1.5Gy单次照射的R15H细胞在连续培养22周后获得了转化，转化细胞逐步发生生长动力学和形态学的改变，生长失去接触抑制，ConA凝集现象明显，获得对血清诱导末端分化的抗性和锚着独立性生长能力，与对照细胞相比均有统计学意义上的增强。结论 从BEP2D到α粒子转化的R15H细胞能够在一定程度上模拟体内肿瘤的发生发展过程，可以为深入了解肺支气管肿瘤发生多阶段过程中的细胞和分子机理提供研究模型。
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【中图分类号】R734.2；R730.231
Transformation of human bronchial epithelial cells BEP2D induced by 238Pu α-particles
LOU Tiezhu,XIANG Xiaoqiong,WU Dechang
(Institute of Radiation Medicine,Academy of Military Medicine Science,Beijing 100850,P.R.China)
【Abstract】Objective To establish a model for the study of transformation of human cell by radon and its progeny.Methods BEP2D,a HPV18 immortalized human bronchial epithelial cell line,was irradiated with high-energy α-particles emitted by 238Pu.Results A single 1.5Gy dose of α-particles induced transformation of the cells.A series of sequential steps arose among transformed cells,including altered growth kinetics,resistance to serum-induced terminal differentiation,and anchorage-independence growth.Conclusion This cell line may provide a model to study the cellular and molecular changes at various stages in radiation carcinogenesis.
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【Key words】238Pu α-particles BEP2D Cell transformation
流行病学研究表明，辐射是已知的环境致癌因子，氡及其子体则是人类本底辐射的最主要成分，天然本底辐射的50%来自氡及其子体，它广泛存在于环境与居室中，对人类健康构成威胁[1]。长期暴露于高水平的氡子体的铀矿工人是辐射诱发肺癌的高危人群， 但这种高水平辐射诱发肿瘤的细胞和分子机理尚不清楚。此外对于低水平的居室氡是否增加癌症危险的遗传负担，氡暴露致癌是否具有阈值，仍有争论[2]。因此，需要深入研究氡致肺癌的机理，以保护人类和高危人群免受或降低辐射致癌的危险。
体外细胞转化实验是研究氡及其子体α粒子致癌的有效方法，能很好地模拟体内致癌的多阶段过程。人类癌症多起源于上皮组织，用上皮细胞进行研究能更好地模拟人体癌症发生的自然过程，是辐射致癌研究的发展趋势。人支气管上皮细胞系BEP2D，1991年由Harris用克隆的全长人乳头瘤病毒(human papillomaviruses 18， HPV18)转染正常人支气管上皮细胞(NHBE)构建获得永生化，但尚未获得恶性转化特性[3]。本研究采用238Pu α粒子照射该细胞，以获得转化细胞特别是转化的早期细胞，建立理想的氡致肺癌研究模型。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 细胞及其培养 BEP2D细胞由Harris教授提供；LHC-8无血清培养液由Biofluids公司生产，部分自配，配方参考Leehner等[4]的方法。培养瓶用纤连蛋白包被，接种5×105/T25培养瓶，加4?ml培养液，37℃、5%CO2培养箱中孵育，每3天换液，每周传代1次。
1.2 α粒子体外照射 α照射装置为238PuO2电沉积源，总放射性活度200?MBq，膜过滤后能量为3.94?MeV，剂量率0.2?Gy/min。照射方式参照张欣等[5]建立的模型。首先制作α照射平皿，在无底玻璃环底边涂抹混合胶，平放于Mylar膜上，135℃烘烤3小时制成。将指数生长期的5×105细胞接种于照射皿中，培养24小时，细胞贴壁后进行α粒子照射。
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1.3 细胞存活效应 BEP2D细胞经α粒子照射，剂量分别为0.3、0.6、1.0、1.5、2.0?Gy，胰酶消化，收集细胞，接种到60?mm平皿中，每皿1?000个细胞，每个剂量重复三次，37℃培养14天后，甲醇固定，吉姆萨染色，计数各平皿克隆数，再计算克隆形成率(CFE)和相对存活率。
CFE(%)＝克隆数/接种细胞数×100%
相对存活率＝该剂量下的CFE / 对照组的CFE
1.4 接种效率 正常和照射后不同代龄细胞以500～1?000细胞/皿接种到60?mm平皿中，连续培养14天，10%甲醛固定，吉姆萨染色，计数克隆数，求出接种效率即CFE。
1.5 细胞转化的鉴定
1.5.1 血清抗性试验 500～1?000个指数生长的正常和照射后细胞分别接种到60?mm平皿中，加入3.0?ml含10%胎牛血清的LHC-8培养液，14天后固定染色，计数集落数，求出CFE。血清抗性＝10%血清培养时CFE/无血清培养时CFE 。
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1.5.2 锚着独立性(AIG)试验 为检测细胞的软琼脂克隆形成能力，正常和照后细胞以2×104/皿的浓度接种于0.35%的顶层琼脂中，底层琼脂浓度为0.7%，3天换液一次，连续培养4周，计数大于50个细胞的克隆数，求出CFE。
1.5.3 刀豆球蛋白A(ConA)凝集试验 向凹孔玻璃板中加入0.1?ml 5 ×105细胞悬液，再分别加入不同体积的ConA，终浓度依次为100、50、25、12.5和0(对照)μg/ml，在微型振荡器上振荡15分钟后，确定细胞凝集程度的强弱。
1.6 统计学处理 检测结果均以
表示，采用方差分析。2 结果
2.1 BEP2D细胞存活效应 不同剂量的α粒子致BEP2D细胞相对存活率如表1，拟合存活曲线方程式为：S＝EXP(1-D/0.78)，辐射敏感性参数D0＝0.78?Gy，Dq＝0，n＝1，呈单击单靶模型。随α粒子照射剂量增加，细胞存活呈指数下降，符合α粒子照射规律。
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2.2 受照后细胞的形态学和生长特性 BEP2D细胞在1.5?Gy α粒子照射后连续培养，观察它的形态学特性。将受照细胞命名为R15H细胞，以与BEP2D细胞相区别；在照射后第22周，第20代细胞(R15Hp20)出现形态学变化，与正常细胞相比，R15H细胞呈现异形性，核质比例增大，核仁大而多；细胞间失去接触抑制，呈复层重叠生长；细胞黏附性较差，易脱落。电镜观察可见细胞变异明显，核浆比例增大，核仁突出，常有多个核仁，细胞器丰富，细胞骨架排列紊乱不规则(图1)。
表 1 不同剂量α粒子致BEP2D细胞的存活率
Tab 1 Relative survival fractions of BEP2D
cells exposed to α-particles Dose(Gy)
CFE(%)
, http://www.100md.com
Relative survival fraction(%)
0
17.68
100
0.3
14.85
84.0
0.6
9.63
54.5
1.0
4.50
, 百拇医药 25.5
1.5
2.50
14.1
2.0
1.27
7.2
图 1 R15Hp20细胞的透射电镜观察结果(×4?500)
Fig 1 Electronograph of transformed R15H cells (×4?500)
2.3 细胞生长曲线和接种效率 对正常细胞和受照后细胞分别测定生长曲线，得到其倍增时间(population double time，PDT)，正常细胞约为65小时，R15Hp5细胞则为44～48小时，生长速率明显提高。正常细胞的接种效率在10%～15%，R15H细胞随传代逐渐提高到20%～30%。
, 百拇医药
2.4 细胞转化的鉴定
2.4.1 ConA凝集试验 用刀豆球蛋白ConA处理细胞后，发现正常细胞凝集作用较弱，而R15Hp20细胞凝集明显。
表 2 BEP2D和R15H细胞的接种效率
Tab 2 Planting efficiency of BEP2D and transformed R15H cells Cells
No.of cells
No.of clone
CFE(%)
P value
(comparing
, http://www.100md.com
with BEP2D)
BEP2D
1?000
152
15.2
-
R15Hp10
500
88
17.6
>0.05
R15Hp20
500
, http://www.100md.com
115
23.0
<0.05
R15Hp30
500
146
29.2
<0.05
表 3 BEP2D细胞和R15Hp20细胞的ConA凝集试验结果
Tab 3 Agglutination of BEP2D and R15Hp20
cells treated with ConA ConA dose(μg/ml)
, 百拇医药
0
12.5
25
50
100
BEP2D
-
-
+
+
R15Hp20
-
, 百拇医药
+
2.4.2 血清抗性试验 正常和R15H细胞分别在无血清和10%血清的LHC-8中培养，结果显示R15Hp20和R15Hp30均出现明显的对血清促分化能力的抗性(P<0.05)。表 4 BEP2D和R15H细胞对血清促分化能力的抗性
Tab 4 Resistance to serum-induced terminal differentiation of BEP2D and R15H cells Cells
No.of cells
, 百拇医药 No.of clone
CFE(%)
Relative resistance(%)
P value
(comparing with BEP2D)
Serum-free
10% serum
Serum-free
10% serum
BEP2D
1?000
, 百拇医药
152
7
15.2
0.7
4.6
-
R15Hp10
500
88
5
17.6
1
5.7
, http://www.100md.com >0.05
R15Hp20
500
115
34
23
6.8
29.6
<0.05
R15Hp30
500
146
82
, http://www.100md.com
29.2
16.4
56.2
<0.05
2.4.3 AIG特性 检测细胞在双层软琼脂中的克隆形成率，R15H细胞在第5代时克隆形成率很低，但从第20代开始，CFE明显升高，与对照组比较有显著差异(P<0.05)。表 5 R15H细胞的软琼脂克隆形成率
Tab 5 CFE in soft agar of transformed R15H cells Cells
No.of clone
CFE(%)
P Value
, 百拇医药
(comparing with BEP2D)
BEP2D
6
0.03
-
R15Hp5
10
0.05
>0.05
R15Hp20
26
0.13
<0.05
, 百拇医药
R15Hp30
70
0.35
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3 讨论
我们对HPV18永生化的人支气管上皮细胞BEP2D，进行α粒子诱导转化的研究，发现经1.5?Gy照射后的细胞R15H，在连续培养5个月之后，第20代细胞首先出现细胞形态学的改变，这是细胞受照后发生的最早可观察到的变化。为证实其转化性，首先进行ConA凝集试验，正常细胞和R15H细胞的凝集度不同，因为转化细胞表面抗原特性发生变化，ConA受体明显增加，改变了正常的细胞互相识别，细胞的凝集程度明显增强。进一步进行血清诱导分化试验，血清和促癌剂(TPA)能使正常上皮细胞鳞状分化，而转化细胞和癌细胞则具有抵抗能力，因此把对血清的分化抗性看作上皮细胞转化的一个特征。结果发现R15H细胞在第10代时还不具有血清抗性，而自20代后对血清分化产生抗性，保持增殖能力，而正常细胞出现鳞状分化逐渐死亡，表明α粒子照射使细胞向着转化方向发展。锚着独立性生长是指受致癌因素作用的细胞对细胞间通讯的依赖性降低，具有在低密度条件下在半固体琼脂中形成集落的能力，锚着独立性生长和裸鼠体内成瘤性具有很好的一致性[6]。在本试验中，R15H细胞20代转化细胞软琼脂克隆形成率为0.13%，30代时达到0.35%，与正常细胞相比，差异显著，而5代细胞不能形成软琼脂克隆，说明其尚未发生转化，表明了细胞转化特性的获得是一个渐进的过程。
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从本实验结果可以看出，BEP2D细胞在α粒子照射后发生了一系列连续的变化。在照后早期的第5和10代细胞，虽然接种效率和生长曲线有所提高，但形态学没有变化，更不具有转化特性，可以认为是细胞转化之前的阶段；在第20代以后，细胞不仅发生显著的形态学改变，复层重叠生长，接种效率明显提高，而且在恶性转化鉴定实验中ConA凝集、血清抗性和AIG能力均显著增强，并随着传代细胞的恶性程度逐渐增强，表明R15H细胞开始发生转化，但在裸鼠成瘤之前仍处于转化的早期阶段。在以上观察中，形态学、血清抗性和AIG与细胞转化程度有密切关系，可以作为鉴定细胞转化的重要指标。
我们认为，BEP2D细胞体外转化与体内癌症的发生相似，是一个多阶段的连续发展过程。HPV病毒诱导的永生化是细胞转化的启动阶段，它的进一步发展需要其它因素的参与。α粒子照射则促使细胞向转化发展，在细胞照射后可观察到细胞表型如克隆形态和生长方式的明显改变，包括细胞生长、增殖异常、转化灶的形成、克隆效率增加、生长速度加快和寿命延长。进一步发展，形态改变的细胞开始具有锚着独立性生长能力，AIG能力是体外细胞转化的重要指标，对应于细胞在体内的恶性增殖，是细胞处在癌前病变并向癌变发展的关键阶段。如果转化细胞进一步能在适合的宿主(如裸鼠)体内成瘤，表明转化细胞已经获得了恶性特性，成为了肿瘤细胞。从上述细胞转化的进展过程，可以看到体外转化能够在一定程度上模拟体内肿瘤的发生，验证了致癌的“启动—促进—发展”多阶段理论。表明BEP2D以及α粒子转化的R15H细胞模型不仅有助于研究肺支气管肿瘤的发生机理，而且对于深入了解转化和癌变多阶段发生过程中的细胞和分子机理具有重要价值。
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本研究由国家重点基础研究专项经费(G1998051200)资助
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收稿日期：1999-11-03
修回日期：2000-03-04, http://www.100md.com