顺铂诱导卵巢癌COC1细胞凋亡的观察
作者：卢运萍 王世安 漆秀梅 李震中 周剑峰
单位：武汉，430030 同济医科大学附属同济医院妇产科(卢运萍，漆秀梅)，神经科(李震中)，血液科(周剑峰)；武汉长江航运总医院肿瘤科(王世安)
关键词：脱噬作用；卵巢肿瘤；顺铂
中华妇产科杂志980310 【摘要】 目的 了解化疗药物诱导细胞凋亡的规律，阐明细胞凋亡在肿瘤化疗中的作用和地位。方法 顺铂体外作用于卵巢癌细胞系COC1，通过组织细胞化学染色、荧光染色结合电镜、DNA电泳和流式细胞术等方法，观察COC1细胞凋亡的发生规律。结果 经顺铂处理的COC1细胞出现典型的细胞凋亡形态学特征，在顺铂处理的30小时内，凋亡持续存在并逐渐增强。凋亡率在一定的剂量范围内呈依赖性增强。在顺铂处理的12小时时间点上，虽然坏死率仅为12.4%，但凋亡率已达30.8%。结论 化疗药物诱导凋亡是化疗的重要治疗机理。
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Patterns of Cisplatin Induced Apoptosis in Ovarian Cancer Cell Line COC1 Lu Yunping, Wang Shian, Qi Xiumei, et al. Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
【Abstract】 Objective To elucidate the patterns of chemotherapeutic drugs induced apoptosis and its role in cancer chemotherapy.Methods Apoptosis in cultured ovarian cancer cell line COC1 induced by ciplatin was investigated in vitro by applying cytohistochemistry stain, florescence stain and electron microscopy scanning combining with DNA gel electrophoresis and flow cytometry analysis. Results After exposure to cisplatin, COC1 cells manifested typical apoptotic morphological features. Apoptosis persisted throughout 30 hours following addition of cisplatin and augmentated gradually. The rate of apoptosis was enhanced within tested dose range in a dose dependent pattern. At the point of 12 hour cisplatin exposure, the necrosis rate was only 12.4% while the apoptotic rate acounted for 30.8% already. Conclusions Chemotherapeutic drugs induced apoptosis is one of the primary mechanism of anti-cancer chemotherapy.
, 百拇医药
【Key words】 Apoptosis Ovarian neoplasms Cisplatin
术后化疗是治疗卵巢癌的主要措施，对于中、晚期卵巢癌病例尤其重要[1]。近来，较多研究表明，某些化疗药物可诱导多种肿瘤细胞凋亡，提示凋亡可能是化疗疗效机理之一[2]。为了明确化疗药物诱导凋亡的规律，评价细胞凋亡在肿瘤化疗中的作用和地位。我们观察了常规化疗药物顺铂体外诱导卵巢癌细胞系COC1凋亡的规律。
材料与方法
一、材料：卵巢癌COC1细胞系，由武汉大学细胞保藏中心提供。顺铂由山东齐鲁制药厂提供。
二、方法：
(一)细胞处理：
, 百拇医药
1.细胞培养：COC1细胞悬浮培养于含10%小牛血清(FCS)、RPMI 1640培养液中，置37℃、50% CO2、饱和湿度条件下培养。试验前，经台盼蓝鉴定细胞活性在98%以上，所有实验重复两次证实。
2.顺铂诱导COC1细胞凋亡的时间及浓度变化：将COC1细胞浓度调至2×106/ml，顺铂终浓度为3 μg/ml、6.0 μg/ml及9.9 μg/ml，此浓度大致相当于临床化疗体内药物浓度峰值[2]。向培养细胞内加顺铂后0～30小时，每隔2小时用台盼蓝鉴定活性，取300 μl细胞悬液用于吖啶橙(AO)染色。取5×106细胞提取DNA，行电泳分析，流式细胞仪(FACS)测定细胞周期分布并计算凋亡率。
(二)细胞凋亡观察：
1.组织化学染色：采用May-Grun Wald-Giemsa染色法对培养细胞进行染色，观察细胞形态的变化。
, 百拇医药
2.荧光染色：用1∶10 000的AO染色培养细胞，荧光显微镜下观察细胞核的变化[3]。
3.电镜：将5×106/ml细胞10 ml离心，去上清，以2%戊二醛固定，行透射电镜(EM10C/CR)观察[3]。
4.DNA电泳：取5×106 COC1细胞，用-20℃预冷70%乙醇10 ml固定24小时以上，离心收集细胞，用PBS洗3次。加80 μl柠檬酸缓冲液(0.2 mol/L Na2HPO4∶0.1 mol/L柠檬酸=192∶8, pH 7.8), 37℃温育1小时， 1 500 r/min离心5分钟。取上清液(沉淀细胞用PBS重新悬浮，用于FACS分析)，加1/10体积3 mol/L乙酸钠(pH 5.2)，88 μl无水乙醇，0℃下沉淀15分钟后，4℃下12 000 r/min离心15分钟；弃上清，空气中干燥。加3 μl 0.25% NP-40，3 μl RNA酶(2 mg/ml), 37℃水浴30分钟，加10 μl加样缓冲液，1.5%琼脂糖凝胶电泳在0.8 V/cm电压下电泳10小时后，用0.5 μg/ml溴化乙锭染色25分钟，紫外分析仪下拍照，DNA分子量标准为λ/HindⅢ+EcoRI。
, 百拇医药
5.流式细胞仪：上述沉淀细胞用0.1 mmol/L PBS重新悬浮两次，经FACS常规预处理后，上机检测细胞周期分布及凋亡率(BC公司FACS420型)，在流式细胞仪分析DNA组方图中，亚DNA二倍峰即代表凋亡率(AP峰)。每份标准测10 000个细胞[3]。
结果
一、顺铂诱导COC1细胞凋亡的形态学表现
1.光镜下可见经组织化学染色的凋亡细胞体积缩小，胞膜完整，内含高浓度染色质的胞核。染色质浓缩至核膜下，呈环状，或凝集成块。亦可见细胞皱缩形成突起并起泡(blobbing)，有的小泡脱落形成凋亡小体(图1，2)。
2.AO染色可见凋亡的COC1细胞表现为典型的核碎裂和凋亡小体形成，部分细胞的染色质浓缩至核膜下，呈环状(图3)。
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3.电镜下可见凋亡细胞膜完整，核染色质浓缩至核膜下呈新月状或环状。胞浆电子密度增加(图4)。
二、顺铂诱导COC1细胞凋亡的规律
如附表所示，在3.0～9.9 μg/ml的顺铂剂量范围内。FACS定量分析显示顺铂随着处理时间的延长，凋亡率逐步升高，呈现均一的时间依赖性增强。3 μg/ml顺铂处理培养细胞后两小时，凋亡率的峰(AP峰)即开始上升，随着时间的推移，AP峰逐步高耸，反映凋亡率随着顺铂剂量的增加，呈明显剂量依赖性增强时相规律，顺铂作用12小时，凋亡率已达30.80%，而坏死率仅为12.40%。DNA电泳呈现较典型的DNA规律降解的“梯形”图形。
附表 顺铂浓度和作用时间对诱导COC1细胞凋亡的影响 顺铂
(μg/ml)
, 百拇医药
凋亡率(%)
0小时
12小时
18小时
24小时
30小时
3.0
0.20
8.10
10.50
25.30
35.17
6.0
, 百拇医药
0.15
30.80
39.90
46.10
67.30
9.9
0.12
68.40
-
-
-
讨论
细胞凋亡是细胞主动参与的基因介导下的自杀性死亡，具有不同于坏死的典型形态学和生物化学特征[4]。本实验证实卵巢癌的常规化疗药物顺铂可诱导卵巢癌细胞COC1凋亡，其证据为：(1)细胞化学染色、荧光染色及电镜观察显示处理后的COC1细胞呈现细胞皱缩、核染色体边集、核碎裂、凋亡小体形成等典型凋亡形态学特征。(2)流式细胞仪检测显示处理后的COC1细胞DNA组方图上出现亚二倍体的AP峰。(3)DNA电泳显示COC1细胞内，有200 bp倍数的寡核苷酸片断形成的DNA梯形电泳图形，反映COC1细胞凋亡时，由于核酸内切酶的激活，导致了不同于坏死的DNA规律性降解。因此，诱导凋亡是化疗药物杀灭肿瘤细胞的基本机制之一。
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DNA电泳及FACS分析显示，在顺铂处理30小时全过程中，凋亡持续存在，随着时间的延长，凋亡率逐步上升。这与Lotem等[5]的结论有差异，在他们的研究中，通过对形态学的观察，得出诱导凋亡只是化疗早期事件的结论，我们认为这种结论上的矛盾与所用的不同研究方法有关，体外观察中由于无巨噬细胞吞噬作用，随着处理时间的延长，凋亡细胞的继发性坏死不可避免，此时用形态学方法已无法精确区分凋亡和坏死细胞，而FACS分析则更为精确。顺铂作用COC1细胞12小时，坏死率仅12.4%，而凋亡率已达30.80%，进一步说明诱导凋亡是化疗的主要疗效机理之一[6]。
大剂量化疗是临床克服耐药的常用策略之一，从我们的实验结果来看，凋亡诱导效率呈剂量依赖性增强，这可能是大剂量化疗常有较好疗效的内在基础。同时也提示细胞凋亡作为细胞自杀性死亡的一种方式，其强度是可调节的。近来研究提示[7]，不同药理作用机制的化疗药物最终均可通过共同的通路诱导细胞凋亡。因此，今后通过非细胞毒类药物选择性调节肿瘤细胞的凋亡敏感性，可最大限度提高肿瘤疗效。本研究建立的卵巢癌化疗凋亡模型将为今后的深入研究提供较好的基础。
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图1 可见细胞起泡，有凋亡小体形成。Mar-Griunn Wald-Giemsa染色×200 图2 染色质浓缩至核膜下，成环状。Mary-Griunn Wald-Giemsa染色×400 图3 可见细胞核碎裂、浓缩。AO染色荧光×400 图4 细胞核染色质至核膜下成新月状或环状。透射电镜×500
参考文献
1 连利娟.卵巢癌化疗的现况与趋向.中华妇产科杂志，1996，31：67-70.
2 Ormerod MG, O′Neill CF, Robertson D, et al. Cisplatin induces apoptosis in a human ovarian carcinoma cell line without concomitant internucleosomal degradation of DNA. Exp Cell Res, 1994, 211:231-237.
, 百拇医药
3 李震中，阮旭中，白欣立，等.癫痫痛持续状态鼠海马神经凋亡的形态学证据及意义.脑与神经疾病杂志，1996，4：207-210.
4 Sachs L, Lofem J. Control of programmed cell death in the normal and leukemic cells: new implications for therapy. Blood, 1993, 83:15-20.
5 Lotem SW, Sachs L. Hematopoietic cytokines inhibit apoptosis induced by TGF-β and chemotherapy compounds in myeloid leukemic cells. Blood, 1992, 80:1750-1757.
6 Zhou Jianfeng, Chen Yan, Li Chougyu, et al. Ara-c induced apoptosis in human myeloid leukemia cell line HL-60: inducing apoptosis is the primary mechanism of chemotherapy. Chin J Cancer Research, 1997, 3:183-187.
7 Darzynkiewiez Z. Apoptosis in anti-tumor strategies: moduulation of cell cycle or differentiation. J Cell Biochem, 1995, 58:151-159.
(收稿：1997-03-04 修回：1997-12-20), http://www.100md.com
单位：武汉，430030 同济医科大学附属同济医院妇产科(卢运萍，漆秀梅)，神经科(李震中)，血液科(周剑峰)；武汉长江航运总医院肿瘤科(王世安)
关键词：脱噬作用；卵巢肿瘤；顺铂
中华妇产科杂志980310 【摘要】 目的 了解化疗药物诱导细胞凋亡的规律，阐明细胞凋亡在肿瘤化疗中的作用和地位。方法 顺铂体外作用于卵巢癌细胞系COC1，通过组织细胞化学染色、荧光染色结合电镜、DNA电泳和流式细胞术等方法，观察COC1细胞凋亡的发生规律。结果 经顺铂处理的COC1细胞出现典型的细胞凋亡形态学特征，在顺铂处理的30小时内，凋亡持续存在并逐渐增强。凋亡率在一定的剂量范围内呈依赖性增强。在顺铂处理的12小时时间点上，虽然坏死率仅为12.4%，但凋亡率已达30.8%。结论 化疗药物诱导凋亡是化疗的重要治疗机理。
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Patterns of Cisplatin Induced Apoptosis in Ovarian Cancer Cell Line COC1 Lu Yunping, Wang Shian, Qi Xiumei, et al. Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
【Abstract】 Objective To elucidate the patterns of chemotherapeutic drugs induced apoptosis and its role in cancer chemotherapy.Methods Apoptosis in cultured ovarian cancer cell line COC1 induced by ciplatin was investigated in vitro by applying cytohistochemistry stain, florescence stain and electron microscopy scanning combining with DNA gel electrophoresis and flow cytometry analysis. Results After exposure to cisplatin, COC1 cells manifested typical apoptotic morphological features. Apoptosis persisted throughout 30 hours following addition of cisplatin and augmentated gradually. The rate of apoptosis was enhanced within tested dose range in a dose dependent pattern. At the point of 12 hour cisplatin exposure, the necrosis rate was only 12.4% while the apoptotic rate acounted for 30.8% already. Conclusions Chemotherapeutic drugs induced apoptosis is one of the primary mechanism of anti-cancer chemotherapy.
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【Key words】 Apoptosis Ovarian neoplasms Cisplatin
术后化疗是治疗卵巢癌的主要措施，对于中、晚期卵巢癌病例尤其重要[1]。近来，较多研究表明，某些化疗药物可诱导多种肿瘤细胞凋亡，提示凋亡可能是化疗疗效机理之一[2]。为了明确化疗药物诱导凋亡的规律，评价细胞凋亡在肿瘤化疗中的作用和地位。我们观察了常规化疗药物顺铂体外诱导卵巢癌细胞系COC1凋亡的规律。
材料与方法
一、材料：卵巢癌COC1细胞系，由武汉大学细胞保藏中心提供。顺铂由山东齐鲁制药厂提供。
二、方法：
(一)细胞处理：
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1.细胞培养：COC1细胞悬浮培养于含10%小牛血清(FCS)、RPMI 1640培养液中，置37℃、50% CO2、饱和湿度条件下培养。试验前，经台盼蓝鉴定细胞活性在98%以上，所有实验重复两次证实。
2.顺铂诱导COC1细胞凋亡的时间及浓度变化：将COC1细胞浓度调至2×106/ml，顺铂终浓度为3 μg/ml、6.0 μg/ml及9.9 μg/ml，此浓度大致相当于临床化疗体内药物浓度峰值[2]。向培养细胞内加顺铂后0～30小时，每隔2小时用台盼蓝鉴定活性，取300 μl细胞悬液用于吖啶橙(AO)染色。取5×106细胞提取DNA，行电泳分析，流式细胞仪(FACS)测定细胞周期分布并计算凋亡率。
(二)细胞凋亡观察：
1.组织化学染色：采用May-Grun Wald-Giemsa染色法对培养细胞进行染色，观察细胞形态的变化。
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2.荧光染色：用1∶10 000的AO染色培养细胞，荧光显微镜下观察细胞核的变化[3]。
3.电镜：将5×106/ml细胞10 ml离心，去上清，以2%戊二醛固定，行透射电镜(EM10C/CR)观察[3]。
4.DNA电泳：取5×106 COC1细胞，用-20℃预冷70%乙醇10 ml固定24小时以上，离心收集细胞，用PBS洗3次。加80 μl柠檬酸缓冲液(0.2 mol/L Na2HPO4∶0.1 mol/L柠檬酸=192∶8, pH 7.8), 37℃温育1小时， 1 500 r/min离心5分钟。取上清液(沉淀细胞用PBS重新悬浮，用于FACS分析)，加1/10体积3 mol/L乙酸钠(pH 5.2)，88 μl无水乙醇，0℃下沉淀15分钟后，4℃下12 000 r/min离心15分钟；弃上清，空气中干燥。加3 μl 0.25% NP-40，3 μl RNA酶(2 mg/ml), 37℃水浴30分钟，加10 μl加样缓冲液，1.5%琼脂糖凝胶电泳在0.8 V/cm电压下电泳10小时后，用0.5 μg/ml溴化乙锭染色25分钟，紫外分析仪下拍照，DNA分子量标准为λ/HindⅢ+EcoRI。
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5.流式细胞仪：上述沉淀细胞用0.1 mmol/L PBS重新悬浮两次，经FACS常规预处理后，上机检测细胞周期分布及凋亡率(BC公司FACS420型)，在流式细胞仪分析DNA组方图中，亚DNA二倍峰即代表凋亡率(AP峰)。每份标准测10 000个细胞[3]。
结果
一、顺铂诱导COC1细胞凋亡的形态学表现
1.光镜下可见经组织化学染色的凋亡细胞体积缩小，胞膜完整，内含高浓度染色质的胞核。染色质浓缩至核膜下，呈环状，或凝集成块。亦可见细胞皱缩形成突起并起泡(blobbing)，有的小泡脱落形成凋亡小体(图1，2)。
2.AO染色可见凋亡的COC1细胞表现为典型的核碎裂和凋亡小体形成，部分细胞的染色质浓缩至核膜下，呈环状(图3)。
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3.电镜下可见凋亡细胞膜完整，核染色质浓缩至核膜下呈新月状或环状。胞浆电子密度增加(图4)。
二、顺铂诱导COC1细胞凋亡的规律
如附表所示，在3.0～9.9 μg/ml的顺铂剂量范围内。FACS定量分析显示顺铂随着处理时间的延长，凋亡率逐步升高，呈现均一的时间依赖性增强。3 μg/ml顺铂处理培养细胞后两小时，凋亡率的峰(AP峰)即开始上升，随着时间的推移，AP峰逐步高耸，反映凋亡率随着顺铂剂量的增加，呈明显剂量依赖性增强时相规律，顺铂作用12小时，凋亡率已达30.80%，而坏死率仅为12.40%。DNA电泳呈现较典型的DNA规律降解的“梯形”图形。
附表 顺铂浓度和作用时间对诱导COC1细胞凋亡的影响 顺铂
(μg/ml)
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凋亡率(%)
0小时
12小时
18小时
24小时
30小时
3.0
0.20
8.10
10.50
25.30
35.17
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30.80
39.90
46.10
67.30
9.9
0.12
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讨论
细胞凋亡是细胞主动参与的基因介导下的自杀性死亡，具有不同于坏死的典型形态学和生物化学特征[4]。本实验证实卵巢癌的常规化疗药物顺铂可诱导卵巢癌细胞COC1凋亡，其证据为：(1)细胞化学染色、荧光染色及电镜观察显示处理后的COC1细胞呈现细胞皱缩、核染色体边集、核碎裂、凋亡小体形成等典型凋亡形态学特征。(2)流式细胞仪检测显示处理后的COC1细胞DNA组方图上出现亚二倍体的AP峰。(3)DNA电泳显示COC1细胞内，有200 bp倍数的寡核苷酸片断形成的DNA梯形电泳图形，反映COC1细胞凋亡时，由于核酸内切酶的激活，导致了不同于坏死的DNA规律性降解。因此，诱导凋亡是化疗药物杀灭肿瘤细胞的基本机制之一。
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DNA电泳及FACS分析显示，在顺铂处理30小时全过程中，凋亡持续存在，随着时间的延长，凋亡率逐步上升。这与Lotem等[5]的结论有差异，在他们的研究中，通过对形态学的观察，得出诱导凋亡只是化疗早期事件的结论，我们认为这种结论上的矛盾与所用的不同研究方法有关，体外观察中由于无巨噬细胞吞噬作用，随着处理时间的延长，凋亡细胞的继发性坏死不可避免，此时用形态学方法已无法精确区分凋亡和坏死细胞，而FACS分析则更为精确。顺铂作用COC1细胞12小时，坏死率仅12.4%，而凋亡率已达30.80%，进一步说明诱导凋亡是化疗的主要疗效机理之一[6]。
大剂量化疗是临床克服耐药的常用策略之一，从我们的实验结果来看，凋亡诱导效率呈剂量依赖性增强，这可能是大剂量化疗常有较好疗效的内在基础。同时也提示细胞凋亡作为细胞自杀性死亡的一种方式，其强度是可调节的。近来研究提示[7]，不同药理作用机制的化疗药物最终均可通过共同的通路诱导细胞凋亡。因此，今后通过非细胞毒类药物选择性调节肿瘤细胞的凋亡敏感性，可最大限度提高肿瘤疗效。本研究建立的卵巢癌化疗凋亡模型将为今后的深入研究提供较好的基础。
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图1 可见细胞起泡，有凋亡小体形成。Mar-Griunn Wald-Giemsa染色×200 图2 染色质浓缩至核膜下，成环状。Mary-Griunn Wald-Giemsa染色×400 图3 可见细胞核碎裂、浓缩。AO染色荧光×400 图4 细胞核染色质至核膜下成新月状或环状。透射电镜×500
参考文献
1 连利娟.卵巢癌化疗的现况与趋向.中华妇产科杂志，1996，31：67-70.
2 Ormerod MG, O′Neill CF, Robertson D, et al. Cisplatin induces apoptosis in a human ovarian carcinoma cell line without concomitant internucleosomal degradation of DNA. Exp Cell Res, 1994, 211:231-237.
, 百拇医药
3 李震中，阮旭中，白欣立，等.癫痫痛持续状态鼠海马神经凋亡的形态学证据及意义.脑与神经疾病杂志，1996，4：207-210.
4 Sachs L, Lofem J. Control of programmed cell death in the normal and leukemic cells: new implications for therapy. Blood, 1993, 83:15-20.
5 Lotem SW, Sachs L. Hematopoietic cytokines inhibit apoptosis induced by TGF-β and chemotherapy compounds in myeloid leukemic cells. Blood, 1992, 80:1750-1757.
6 Zhou Jianfeng, Chen Yan, Li Chougyu, et al. Ara-c induced apoptosis in human myeloid leukemia cell line HL-60: inducing apoptosis is the primary mechanism of chemotherapy. Chin J Cancer Research, 1997, 3:183-187.
7 Darzynkiewiez Z. Apoptosis in anti-tumor strategies: moduulation of cell cycle or differentiation. J Cell Biochem, 1995, 58:151-159.
(收稿：1997-03-04 修回：1997-12-20), http://www.100md.com