卵巢老化与卵巢线粒体DNA缺失的关系
作者：闫琳丽 邝健全 邓庆丽
单位：510120 广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院妇产科(闫琳丽，邝健全)，分子生物学实验室(邓庆丽)
关键词：
中华妇产科杂志980616 DNA损伤学说认为，DNA损伤和修复的错误是产生衰老的原因。线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)可编码线粒体能量产生系统(氧化磷酸化系统)的13条多肽链，所以mtDNA的突变在衰老中的意义近几年来受到关注。已发现正常人的大脑、心肌、肝脏和肌肉等组织mtDNA的缺失随年龄增加发生率升高[1，2]，卵巢mtDNA缺失的发生率也增加[3，4]。
一、资料与方法
1.研究对象：在我院1995年7月至1996年10月因子宫或附件的良、恶性疾病进行剖腹或腹腔镜手术的病人，共99例，按年龄分组：20～岁组12例、30～岁组17例、40～岁组16例、45～岁组17例、50～岁组15例、55～岁组9例，60～70岁组13例，其中卵巢老化，即已绝经22例，尚有规律月经者63例。所有病例均于术中大体及病理检查证实取标本侧卵巢无病理性改变，术中取少许正常卵巢皮质。
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2.方法：常规方法提取卵巢组织的DNA。设计3条引物，上游引物L820 (8 200 bp～8 220 bp)，下游引物H890(8 925 bp～8 904 bp)和H1361(13 639 bp～13 618 bp)，均由中国科学院上海细胞生物学研究所合成。L820+H890反映正常mtDNA的含量，L820和H1361反映缺失后的情况。聚合酶链反应(PCR)参照文献[5]。回收1例64岁患者的卵巢组织L820+H1361的PCR产物，克隆至质粒载体PUC19中，以作测序和灵敏度分析。限制性内切酶Hinf I酶切L820+H890的产物，Alu I酶切L820+H1361的产物，以鉴定PCR扩增产物是否为目的片段。采用瑞典Pharmacia公司的T7 DNA测序试剂盒进行克隆序列分析。紫外分光光度计测定重组质粒DNA的浓度为2 μg/μl，再依次稀释为2×10-1～2×10-10 μg/μl，用L820+H1361扩增，进行PCR灵敏度测定。
3.统计分析：计数资料采用χ2分析。相关分析采用直线相关分析，相关系数(r)用t检验。
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二、结果
1.卵巢mtDNA缺失的分析：99例卵巢标本均有726 bp的扩增带，并能被Hinf I 酶切为583 bp、143 bp，见图1。提示所有的标本中都有未缺失的mtDNA。回收1例卵巢组织的L820+H1361产物后，克隆并测序，克隆片段共463 bp，即mtDNA缺失了4 977 bp，缺失部位为第8 469～13 447 bp或第8 482～13 460 bp之间的碱基，在mtDNA缺失部位附近的序列，有13个碱基的重复序列：ACCTCCCTCACCA，见图2。
1. PCR Markers
2.4.6. L820+H890的PCR产物(726bp)
3.5.7. 相应的Hinf I酶切结果(583bp, 143bp)
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8. PBR322 DNA/HaeIII Markers
图1 L820+H890的PCR产物/Hinf I 鉴定结果
图2 mtDNA缺失连接部位序列分析结果
2.卵巢组织mtDNA缺失与年龄、月经的关系：99例卵巢标本用引物L820+H1361扩增，35例有阳性扩增带，均能被Alu I酶切。年龄与mtDNA缺失的发生率呈正相关，r＝0.92(P<0.01)，见附表。本研究同时还分析了月经与卵巢mtDNA缺失的关系，63例有规律月经的卵巢9例有mtDNA缺失(14.3%)，而22例绝经后的卵巢中有19例(86.4%)有mtDNA缺失(P< 0.01)。
3.PCR方法的灵敏度：各稀释度各取1 μl，进行PCR扩增，2×10-8 μg 有阳性带，2×10-9 μg 无阳性带。PCR方法的灵敏度为2×10-8 μg ，大约104个拷贝，按1 μg模板中约105个细胞，而每个细胞大约有103个mtDNA估算[6] ，大约108个拷贝的mtDNA模板中，至少有104个拷贝的mtDNA缺失，即mtDNA缺失至少0.01%以上。
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附表 年龄与卵巢组织mtDNA缺失的关系 组别
例数
mtDNA缺失
例数
发生率(%)
20～岁组
12
0
0
30～岁组
17
1*
, http://www.100md.com 5.9
40～岁组
16
2*
12.5
45～岁组
17
4*
23.5
50～岁组
15
8*
53.3
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55～岁组
9
8*
88.9
60～70岁组
13
12*
92.3
合计
99
35
35.3
* 组间比较， P<0.0001 三、讨论
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mtDNA损伤缺失学说是细胞衰老和死亡的分子基础，是近几年国际上研究衰老机理的热点。本研究显示，随年龄的增加，mtDNA缺失的发生率升高。与Kitagawa等[3，4]的结果一致。同时还发现，卵巢mtDNA 的缺失与反映卵巢功能的月经情况密切相关。有规律月经，即卵巢功能正常的卵巢mtDNA缺失的发生率为14.3%，而绝经后的卵巢mtDNA缺失则为86.4%(P<0.01)。提示，卵巢mtDNA突变与卵巢因老化而致功能不全关系密切。可能为mtDNA缺失的累积和mtDNA编码的蛋白质合成产物的减少，影响了卵巢功能。第8 469～13 447位或第8 482～13 460位之间的碱基缺失，即缺失了ATPase8、ATPase6、COIII、ND3、ND4L、ND4和ND5的基因。这些基因的缺失，使线粒体呼吸链上主要的酶不能转录和表达，引起呼吸复合物在分子装配上的损害，使细胞内能量的产生减少。已知随年龄的增加，线粒体的氧化磷酸化作用减弱，呼吸链功能降低。mtDNA缺失部位附近的序列，有13个碱基的重复序列：ACCTCCCTCACCA，这可能是mtDNA较易缺失的“热点”(hot spots)部位。本研究还发现，5.9%的30～岁组已有mtDN A的缺失，说明在生育年龄卵巢mtDNA已开始有突变，但这些卵巢的mtDNA缺失可能与老年卵巢的mtDNA缺失存在量上的差别。因为平均每个细胞内约有1 000个mtDNA[6]，所以mtDNA突变的量或突变mtDNA在整个mtDNA分子中所占的比例，可能要累积到某一个阈值水平时才会影响细胞的结构与功能。而在围绝经期，mtDNA的这种突变增加累积超过阈值，使卵巢功能下降。本研究中35例(35.3%)mtDNA的缺失至少在1万个拷贝以上，即缺失的mtDNA占总mtDNA的比例是至少0.01%以上。
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参考文献
1Arnheim N, Cortopassi G.Deleterious mitochondrial DNA mutation accumulate in aging human tissues. Mutation Res, 1992， 275:157-167.
2Lee HC, Pang CY, Hsu HS, et al.Differential accumulations of 4 977 bp deletion in mitochondral DNA of various tissues in human ageing. Biochim Biophys Acta, 1994，1226:37-43.
3Kitagawa T, Suganuma N, Nawa A, et al.Rapid accumulation of deleted mitochondrial deoxyribonucleic acid in postmenopausal ovaries. Biol Reprod, 1993， 49:730-736.
, 百拇医药
4Suganuma N, Kitagawa T, Nawa A, et al.Human ovarian aging and mitochondrial DNA deletion. Horm Res , 1993，39(Supple 1):16-21.
5萨姆布鲁克 J，弗里奇 EF，曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南.第2版.金冬雁，黎孟枫译.北京：科学出版社，1995.672-683.
6Cortopassi GA , Arnheim N.Detection of a specific mitochondrial DNA deletion in tissues of older humans. Nucleic Acid Research, 1990， 18:6927-6933.
(收稿：1997-08-15 修回：1998-03-17), 百拇医药
单位：510120 广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院妇产科(闫琳丽，邝健全)，分子生物学实验室(邓庆丽)
关键词：
中华妇产科杂志980616 DNA损伤学说认为，DNA损伤和修复的错误是产生衰老的原因。线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)可编码线粒体能量产生系统(氧化磷酸化系统)的13条多肽链，所以mtDNA的突变在衰老中的意义近几年来受到关注。已发现正常人的大脑、心肌、肝脏和肌肉等组织mtDNA的缺失随年龄增加发生率升高[1，2]，卵巢mtDNA缺失的发生率也增加[3，4]。
一、资料与方法
1.研究对象：在我院1995年7月至1996年10月因子宫或附件的良、恶性疾病进行剖腹或腹腔镜手术的病人，共99例，按年龄分组：20～岁组12例、30～岁组17例、40～岁组16例、45～岁组17例、50～岁组15例、55～岁组9例，60～70岁组13例，其中卵巢老化，即已绝经22例，尚有规律月经者63例。所有病例均于术中大体及病理检查证实取标本侧卵巢无病理性改变，术中取少许正常卵巢皮质。
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2.方法：常规方法提取卵巢组织的DNA。设计3条引物，上游引物L820 (8 200 bp～8 220 bp)，下游引物H890(8 925 bp～8 904 bp)和H1361(13 639 bp～13 618 bp)，均由中国科学院上海细胞生物学研究所合成。L820+H890反映正常mtDNA的含量，L820和H1361反映缺失后的情况。聚合酶链反应(PCR)参照文献[5]。回收1例64岁患者的卵巢组织L820+H1361的PCR产物，克隆至质粒载体PUC19中，以作测序和灵敏度分析。限制性内切酶Hinf I酶切L820+H890的产物，Alu I酶切L820+H1361的产物，以鉴定PCR扩增产物是否为目的片段。采用瑞典Pharmacia公司的T7 DNA测序试剂盒进行克隆序列分析。紫外分光光度计测定重组质粒DNA的浓度为2 μg/μl，再依次稀释为2×10-1～2×10-10 μg/μl，用L820+H1361扩增，进行PCR灵敏度测定。
3.统计分析：计数资料采用χ2分析。相关分析采用直线相关分析，相关系数(r)用t检验。
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二、结果
1.卵巢mtDNA缺失的分析：99例卵巢标本均有726 bp的扩增带，并能被Hinf I 酶切为583 bp、143 bp，见图1。提示所有的标本中都有未缺失的mtDNA。回收1例卵巢组织的L820+H1361产物后，克隆并测序，克隆片段共463 bp，即mtDNA缺失了4 977 bp，缺失部位为第8 469～13 447 bp或第8 482～13 460 bp之间的碱基，在mtDNA缺失部位附近的序列，有13个碱基的重复序列：ACCTCCCTCACCA，见图2。
1. PCR Markers
2.4.6. L820+H890的PCR产物(726bp)
3.5.7. 相应的Hinf I酶切结果(583bp, 143bp)
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8. PBR322 DNA/HaeIII Markers
图1 L820+H890的PCR产物/Hinf I 鉴定结果
图2 mtDNA缺失连接部位序列分析结果
2.卵巢组织mtDNA缺失与年龄、月经的关系：99例卵巢标本用引物L820+H1361扩增，35例有阳性扩增带，均能被Alu I酶切。年龄与mtDNA缺失的发生率呈正相关，r＝0.92(P<0.01)，见附表。本研究同时还分析了月经与卵巢mtDNA缺失的关系，63例有规律月经的卵巢9例有mtDNA缺失(14.3%)，而22例绝经后的卵巢中有19例(86.4%)有mtDNA缺失(P< 0.01)。
3.PCR方法的灵敏度：各稀释度各取1 μl，进行PCR扩增，2×10-8 μg 有阳性带，2×10-9 μg 无阳性带。PCR方法的灵敏度为2×10-8 μg ，大约104个拷贝，按1 μg模板中约105个细胞，而每个细胞大约有103个mtDNA估算[6] ，大约108个拷贝的mtDNA模板中，至少有104个拷贝的mtDNA缺失，即mtDNA缺失至少0.01%以上。
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附表 年龄与卵巢组织mtDNA缺失的关系 组别
例数
mtDNA缺失
例数
发生率(%)
20～岁组
12
0
0
30～岁组
17
1*
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40～岁组
16
2*
12.5
45～岁组
17
4*
23.5
50～岁组
15
8*
53.3
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55～岁组
9
8*
88.9
60～70岁组
13
12*
92.3
合计
99
35
35.3
* 组间比较， P<0.0001 三、讨论
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mtDNA损伤缺失学说是细胞衰老和死亡的分子基础，是近几年国际上研究衰老机理的热点。本研究显示，随年龄的增加，mtDNA缺失的发生率升高。与Kitagawa等[3，4]的结果一致。同时还发现，卵巢mtDNA 的缺失与反映卵巢功能的月经情况密切相关。有规律月经，即卵巢功能正常的卵巢mtDNA缺失的发生率为14.3%，而绝经后的卵巢mtDNA缺失则为86.4%(P<0.01)。提示，卵巢mtDNA突变与卵巢因老化而致功能不全关系密切。可能为mtDNA缺失的累积和mtDNA编码的蛋白质合成产物的减少，影响了卵巢功能。第8 469～13 447位或第8 482～13 460位之间的碱基缺失，即缺失了ATPase8、ATPase6、COIII、ND3、ND4L、ND4和ND5的基因。这些基因的缺失，使线粒体呼吸链上主要的酶不能转录和表达，引起呼吸复合物在分子装配上的损害，使细胞内能量的产生减少。已知随年龄的增加，线粒体的氧化磷酸化作用减弱，呼吸链功能降低。mtDNA缺失部位附近的序列，有13个碱基的重复序列：ACCTCCCTCACCA，这可能是mtDNA较易缺失的“热点”(hot spots)部位。本研究还发现，5.9%的30～岁组已有mtDN A的缺失，说明在生育年龄卵巢mtDNA已开始有突变，但这些卵巢的mtDNA缺失可能与老年卵巢的mtDNA缺失存在量上的差别。因为平均每个细胞内约有1 000个mtDNA[6]，所以mtDNA突变的量或突变mtDNA在整个mtDNA分子中所占的比例，可能要累积到某一个阈值水平时才会影响细胞的结构与功能。而在围绝经期，mtDNA的这种突变增加累积超过阈值，使卵巢功能下降。本研究中35例(35.3%)mtDNA的缺失至少在1万个拷贝以上，即缺失的mtDNA占总mtDNA的比例是至少0.01%以上。
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参考文献
1Arnheim N, Cortopassi G.Deleterious mitochondrial DNA mutation accumulate in aging human tissues. Mutation Res, 1992， 275:157-167.
2Lee HC, Pang CY, Hsu HS, et al.Differential accumulations of 4 977 bp deletion in mitochondral DNA of various tissues in human ageing. Biochim Biophys Acta, 1994，1226:37-43.
3Kitagawa T, Suganuma N, Nawa A, et al.Rapid accumulation of deleted mitochondrial deoxyribonucleic acid in postmenopausal ovaries. Biol Reprod, 1993， 49:730-736.
, 百拇医药
4Suganuma N, Kitagawa T, Nawa A, et al.Human ovarian aging and mitochondrial DNA deletion. Horm Res , 1993，39(Supple 1):16-21.
5萨姆布鲁克 J，弗里奇 EF，曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南.第2版.金冬雁，黎孟枫译.北京：科学出版社，1995.672-683.
6Cortopassi GA , Arnheim N.Detection of a specific mitochondrial DNA deletion in tissues of older humans. Nucleic Acid Research, 1990， 18:6927-6933.
(收稿：1997-08-15 修回：1998-03-17), 百拇医药