妊高征患者外周血B细胞体外分泌抗体能力的研究
作者：郑英如 陈竹钦 章容 颜建华
单位：400042 重庆，第三军医大学第三附属医院野战外科研究所妇产科
关键词：妊娠并发症；心血管；高血压；B淋巴细胞；IgG；IgM
中华妇产科杂志981204 【摘要】 目的 研究妊高征患者B细胞的功能变化,从免疫学的角度探讨妊高征的发病机理。方法 采用密度梯度离心法分离妊高征组(15例)和正常妊娠组(15例)的外周血B淋巴细胞，并在有或无美洲商陆有丝分裂原(PWM)存在的情况下培养10天后,收集上清液, 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定每1×106个B淋巴细胞所分泌的IgG和IgM的量。结果 在无PWM存在的情况下,妊高征组B淋巴细胞IgG和IgM的自发分泌量(120±68 ng, 337±119 ng)分别与正常妊娠组IgG和IgM的自发分泌量(154±89 ng, 371±135 ng)无显著差异；而在PWM的刺激下,妊高征组B淋巴细胞分泌IgG(947±518 ng)和IgM(2 023±879 ng) 的量分别显著低于正常妊娠组分泌的IgG (1 367±598 ng)和IgM (2 840±1 057 ng)的量(P<0.05)。结论 妊高征患者B淋巴细胞针对有丝分裂原的刺激信号而产生应答反应的能力下降,提示妊高征患者B淋巴细胞免疫功能低下。
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The Study on in Vitro Antibody Secretion of B Lymphocyte in Patient with Pregnancy Induced Hypertention Zheng Yingru, Chen Zhuqin, Zhang Rong, et al. Third Affiliated Hospital, Third Millitary Medical University，Chongqing 400042
【Abstract】 Objective To study the immunologic etiopathology of pregnancy induced hypertention (PIH) in some extent by analyzing the antibody secretion of B lymphocytes of PIH patients. Methods The subjects were divided into two groups: PIH group (n= 15) and normotensive control group (n=15). Peripheral lymphocytes of the subjucts were separated by Ficoll-Hypaque density centrifugation. The lymphocytes were cultured in RPMI-1640 medium with or without pokeweed mitogen (PWM) for ten days.Then the supernatant was collected and the IgG and IgM were measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).The results of the two groups were analyzed by using student test. Results Both IgG and IgM secretion of B lymphocytes between PIH group and normtensive control group showed no difference in the absence of PWM(per 1×106 lymphocytes, for IgG ,120±68 ng vs 154±89 ng, P>0.05;for IgM, 337±119 ng vs 371±135 ng , P>0.05. Whereas the level of the two antibodies in PIH group was significantly decreased than that of the normotensive group in presence of PWM (for IgG,947±518 ng vs 1 367±598 ng,P<0.05; for IgM, 2 023±879 ng vs 2 840±1 057 ng, P<0.05). Conclusion B lymphocyte of PIH patient has a decreased capacity of antibodies secreting in response to stimulation of PWM, which suggests that B lymphocyte of PIH patient may have functional deficiency.
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【Key words】 Pregnancy complications, cardisvascular Hypertension B lymphocyte IgG
IgM
妊高征至今仍为严重威胁母胎健康的疾病之一。诸多研究表明，免疫失衡是妊高征发病的一个重要原因[1]。B淋巴细胞作为参与免疫应答的主体之一, 在妊高征时的功能变化尚不明了。由于影响血清中免疫球蛋白水平的因素较多,B细胞的功能变化难以从血清中免疫球蛋白总量的变化反应出来。为使影响因素便于控制，本研究将妊高征患者外周血淋巴细胞分离出来，于体外观察B细胞自发分泌和在美洲商陆有丝分裂原(PWM)刺激下抗体分泌水平的变化,从免疫学的一个侧面探讨妊高征的B细胞功能状态。
资料和方法
一、资料来源
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1.研究对象:妊高征组15例,均为中度和重度患者,诊断标准为全国统一标准[2]；正常妊娠组15例。以上两组均来自1996年12月～1997年10月我院住院者，年龄为21～34岁,排除了心、肝、肾及甲状腺疾病, 无糖尿病、慢性高血压、风湿、类风湿及红斑狼疮等自身免疫相关疾病史。
2.主要试剂： (1)淋巴细胞分离液:购自华美生物工程公司; (2)RPMI-1640培养基:购自Gibico公司; (3)PWM:购自Sigma公司; (4)兔抗人IgG(Fab)2、兔抗人IgM μ链、辣根过氧化酶标记兔抗人IgG γ链及辣根过氧化酶标记兔抗人IgM μ链:均购自Dako公司; (5)人IgG标准品:购自北京中山生物技术有限公司; (6)人IgM标准品:为Dako公司产品; (7)24孔细胞培养板及96孔酶联板:均为Corning公司产品。
二、方法
, 百拇医药 1.外周血淋巴细胞的分离和培养：取妊高征患者和正常孕妇外周血, 按常规方法分离淋巴细胞,置于无血清的RPMI-1640培养基中,37℃振摇45分钟,用上述培养基洗涤3次,用含10%新生小牛血清的1640培养基将细胞浓度调整为1×106细胞/ml,接种于24 孔培养板中,每孔1 ml,在无和有2.5 μg/ml PWM的情况下培养10天,收集上清液,测定其IgG及IgM量。实验设两个平行孔。
2.双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)测定培养上清液中IgG和IgM： 参照Volkman等的方法[3]加以改进。(1)IgG的测定:用pH9.4碳酸盐缓冲液将兔抗人IgG(Fab)2稀释为1. 0 μg/ml, 按每孔150 μl加入96孔酶标板中,于4℃包被18小时后,洗涤3次,加入含 1% 小牛血清白蛋白的PBS 200 μl, 37℃孵育40分钟,同上洗涤;加入待检上清液或不同浓度的人IgG标准品100 μl,37℃孵育60分钟,同上洗涤;加入1∶4 000稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG γ链100 μl,37℃孵育1.5小时,同上洗涤;加入邻苯二胺底物溶液100 μl,37℃避光孵育20分钟,490 nm 下测定吸光度(?)值。(2)IgM的测定:方法同IgG。其中兔抗人IgM μ链的包被浓度为1.5 μg/ml,辣根过氧化物酶标记兔抗人IgM μ链以1∶1 000稀释。(3)结果计算：取IgG和IgM标准品含量与?值呈线性关系的部分分别作标准曲线。用待测上清液?值查相应标准曲线, 可得IgG和IgM的水平,乘以10再乘以相应的稀释倍数,即得1×106个淋巴细胞所分泌的IgG及IgM的量。
, 百拇医药
三、统计学处理
实验结果采用t检验。
结果
在无或有PWM 刺激的情况下，妊高征组和正常妊娠组每1×106个外周血淋巴细胞体外所分泌IgG和IgM的量参见附表。
附表 两组B细胞IgG和IgM分泌量(ng，
) 组别
例
数
自发分泌
PWM刺激分泌
IgG
, 百拇医药
IgM
IgG
IgM
妊高征组
15
120±68
337±119
947±518
2 023± 879
正常妊娠组
15
154±89
371±135
, 百拇医药
1 367±598
2 840±1 057
妊高征组和正常妊娠组比较，B细胞体外自发分泌IgG和IgM 的水平差异均无显著性(P>0.05);而当有PWM刺激时,妊高征组B细胞体外分泌IgG和IgM的水平均分别显著低于正常妊娠组(P<0.05)。
讨论
一、妊高征患者B细胞的功能变化
自本世纪初，有人提出妊高征发病与免疫状态有关以来, 免疫功能变化一直被认为是妊高征发病的一个重要因素[1]。而且认为妊高征的血管内皮细胞损伤也与免疫有关[4，5]。B细胞作为免疫应答的主体之一, 其在妊高征时的功能变化一直是人们研究的一个热点。已有的研究表明,重度妊高征患者体内循环 IgG及IgM水平下降[6，7]，但其测定的结果报道不一[8]。由于影响血清中免疫球蛋白水平的因素较多,致使B细胞的功能难以从血清中免疫球蛋白总量的变化反应出来。另外，由于阻断了抗体识别抗原。因此，在妊娠期检测B细胞特定抗体的分泌也非易事。由此可见，妊高征的B细胞功能变化的研究虽亟待深入，但目前又没有行之有效的方法。因此，本研究检测了妊高征患者B细胞在体外自发分泌和在PWM刺激下产生IgG和IgM能力的变化,从而在影响因素较为单一的情况下,在一定程度上探讨了妊高征的B细胞功能变化。检测结果表明:中、重度妊高征患者的B细胞在体外自发分泌IgG和IgM的水平均无显著差别，而在PWM刺激下,中、重度妊高征患者的B细胞体外分泌IgG和IgM的水平分别显著低于正常孕妇。
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二、妊高征患者B细胞对PWM刺激应答能力下降的可能原因
目前，关于妊高征患者B细胞体外分泌抗体能力下降的原因，尚不十分清楚。但据已有研究结果，不妨作如下推测，即可能是因CD4+细胞,特别是Th细胞的功能低下所致。我们知道，B细胞分泌抗体依赖于CD4+T细胞的辅助和调节,若CD4+T细胞相对数量减少或功能低下,势必导致B细胞产生抗体能力的下降。目前,关于CD4+T细胞相对数量变化的研究报道不一。有些研究表明，妊高征患者的Th细胞的百分比或CD4+/CD8+比值下降[6]，而有些研究则认为该比值较正常孕妇升高或无变化[7，9]。 因此，很难用CD4+T细胞相对数量和比值的变化来解释B细胞产生抗体能力下降的原因。故用CD4+T细胞功能低下来解释可能相对较为合理。当然,要真正弄清妊高征患者B细胞体外分泌抗体能力下降的机理，还需进行深入的工作。
, 百拇医药
参考文献
1 Sibai BM. Immunologic aspects of preeclampsia. Clin Obstet Gynecol，1991，34:27-34.
2 乐杰 主编.妇产科学.第4版. 北京：人民卫生出版社. 1997，115.
3 Volkman DJ, Lane HC, Fauci AS. Antigen- induced in vitro antibody production in human: a model for B cell activation and immunoregulation.Proc Ntal Acad Sci USA， 1981，78:2528-2531.
4 郑英如,陈竹钦,颜建华，等.妊高征补体活化与血管内皮细胞损伤关系的初步研究.中华妇产科杂志, 1996，31:152-154.
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5 Rappaport VJ, Hirata G, Yap HK, et al.Anti-vascular endothelial cell antibodies in severe preeclampsia. Am J Obstet Gynecol，1990，162:138-146.
6 Bardeguez AD, Mc Nemey R, Freieri M, et al. Cellular immunity in preeclampsia alterations in T-lymphocyte subpopulation during early pregnancy. Obstet Gynecol， 1991, 77:859-862.
7 Bettin S, Halle H, Wenzkowski BM, et al. Immunologic paremeters in wowen normal pregnancy and preeclampsia. Aentrable Gynakol， 1994，116:260-262.
, 百拇医药
8 el Roeiy A,Myers SA, Gleicher M. The relationship between anto antibodies and intrauterine growth retardation in hypertensive disorder of pregnancy. Am J Obstet Gynecol，1991，164:1253-1261.
9 Malinowski A, Szpakowski M, Tchorzewski H, et al. T lymphocyte subpopulations and lymphocyte proliferative activity in normal and pre-eclamptic pregnancy. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol， 1994， 53:27-31.
本课题受国家自然科学基金资助
(收稿：1998-05-06 修回：1998-07-20), 百拇医药
单位：400042 重庆，第三军医大学第三附属医院野战外科研究所妇产科
关键词：妊娠并发症；心血管；高血压；B淋巴细胞；IgG；IgM
中华妇产科杂志981204 【摘要】 目的 研究妊高征患者B细胞的功能变化,从免疫学的角度探讨妊高征的发病机理。方法 采用密度梯度离心法分离妊高征组(15例)和正常妊娠组(15例)的外周血B淋巴细胞，并在有或无美洲商陆有丝分裂原(PWM)存在的情况下培养10天后,收集上清液, 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定每1×106个B淋巴细胞所分泌的IgG和IgM的量。结果 在无PWM存在的情况下,妊高征组B淋巴细胞IgG和IgM的自发分泌量(120±68 ng, 337±119 ng)分别与正常妊娠组IgG和IgM的自发分泌量(154±89 ng, 371±135 ng)无显著差异；而在PWM的刺激下,妊高征组B淋巴细胞分泌IgG(947±518 ng)和IgM(2 023±879 ng) 的量分别显著低于正常妊娠组分泌的IgG (1 367±598 ng)和IgM (2 840±1 057 ng)的量(P<0.05)。结论 妊高征患者B淋巴细胞针对有丝分裂原的刺激信号而产生应答反应的能力下降,提示妊高征患者B淋巴细胞免疫功能低下。
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The Study on in Vitro Antibody Secretion of B Lymphocyte in Patient with Pregnancy Induced Hypertention Zheng Yingru, Chen Zhuqin, Zhang Rong, et al. Third Affiliated Hospital, Third Millitary Medical University，Chongqing 400042
【Abstract】 Objective To study the immunologic etiopathology of pregnancy induced hypertention (PIH) in some extent by analyzing the antibody secretion of B lymphocytes of PIH patients. Methods The subjects were divided into two groups: PIH group (n= 15) and normotensive control group (n=15). Peripheral lymphocytes of the subjucts were separated by Ficoll-Hypaque density centrifugation. The lymphocytes were cultured in RPMI-1640 medium with or without pokeweed mitogen (PWM) for ten days.Then the supernatant was collected and the IgG and IgM were measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).The results of the two groups were analyzed by using student test. Results Both IgG and IgM secretion of B lymphocytes between PIH group and normtensive control group showed no difference in the absence of PWM(per 1×106 lymphocytes, for IgG ,120±68 ng vs 154±89 ng, P>0.05;for IgM, 337±119 ng vs 371±135 ng , P>0.05. Whereas the level of the two antibodies in PIH group was significantly decreased than that of the normotensive group in presence of PWM (for IgG,947±518 ng vs 1 367±598 ng,P<0.05; for IgM, 2 023±879 ng vs 2 840±1 057 ng, P<0.05). Conclusion B lymphocyte of PIH patient has a decreased capacity of antibodies secreting in response to stimulation of PWM, which suggests that B lymphocyte of PIH patient may have functional deficiency.
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【Key words】 Pregnancy complications, cardisvascular Hypertension B lymphocyte IgG
IgM
妊高征至今仍为严重威胁母胎健康的疾病之一。诸多研究表明，免疫失衡是妊高征发病的一个重要原因[1]。B淋巴细胞作为参与免疫应答的主体之一, 在妊高征时的功能变化尚不明了。由于影响血清中免疫球蛋白水平的因素较多,B细胞的功能变化难以从血清中免疫球蛋白总量的变化反应出来。为使影响因素便于控制，本研究将妊高征患者外周血淋巴细胞分离出来，于体外观察B细胞自发分泌和在美洲商陆有丝分裂原(PWM)刺激下抗体分泌水平的变化,从免疫学的一个侧面探讨妊高征的B细胞功能状态。
资料和方法
一、资料来源
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1.研究对象:妊高征组15例,均为中度和重度患者,诊断标准为全国统一标准[2]；正常妊娠组15例。以上两组均来自1996年12月～1997年10月我院住院者，年龄为21～34岁,排除了心、肝、肾及甲状腺疾病, 无糖尿病、慢性高血压、风湿、类风湿及红斑狼疮等自身免疫相关疾病史。
2.主要试剂： (1)淋巴细胞分离液:购自华美生物工程公司; (2)RPMI-1640培养基:购自Gibico公司; (3)PWM:购自Sigma公司; (4)兔抗人IgG(Fab)2、兔抗人IgM μ链、辣根过氧化酶标记兔抗人IgG γ链及辣根过氧化酶标记兔抗人IgM μ链:均购自Dako公司; (5)人IgG标准品:购自北京中山生物技术有限公司; (6)人IgM标准品:为Dako公司产品; (7)24孔细胞培养板及96孔酶联板:均为Corning公司产品。
二、方法
, 百拇医药 1.外周血淋巴细胞的分离和培养：取妊高征患者和正常孕妇外周血, 按常规方法分离淋巴细胞,置于无血清的RPMI-1640培养基中,37℃振摇45分钟,用上述培养基洗涤3次,用含10%新生小牛血清的1640培养基将细胞浓度调整为1×106细胞/ml,接种于24 孔培养板中,每孔1 ml,在无和有2.5 μg/ml PWM的情况下培养10天,收集上清液,测定其IgG及IgM量。实验设两个平行孔。
2.双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)测定培养上清液中IgG和IgM： 参照Volkman等的方法[3]加以改进。(1)IgG的测定:用pH9.4碳酸盐缓冲液将兔抗人IgG(Fab)2稀释为1. 0 μg/ml, 按每孔150 μl加入96孔酶标板中,于4℃包被18小时后,洗涤3次,加入含 1% 小牛血清白蛋白的PBS 200 μl, 37℃孵育40分钟,同上洗涤;加入待检上清液或不同浓度的人IgG标准品100 μl,37℃孵育60分钟,同上洗涤;加入1∶4 000稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG γ链100 μl,37℃孵育1.5小时,同上洗涤;加入邻苯二胺底物溶液100 μl,37℃避光孵育20分钟,490 nm 下测定吸光度(?)值。(2)IgM的测定:方法同IgG。其中兔抗人IgM μ链的包被浓度为1.5 μg/ml,辣根过氧化物酶标记兔抗人IgM μ链以1∶1 000稀释。(3)结果计算：取IgG和IgM标准品含量与?值呈线性关系的部分分别作标准曲线。用待测上清液?值查相应标准曲线, 可得IgG和IgM的水平,乘以10再乘以相应的稀释倍数,即得1×106个淋巴细胞所分泌的IgG及IgM的量。
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三、统计学处理
实验结果采用t检验。
结果
在无或有PWM 刺激的情况下，妊高征组和正常妊娠组每1×106个外周血淋巴细胞体外所分泌IgG和IgM的量参见附表。
附表 两组B细胞IgG和IgM分泌量(ng，
) 组别例
数
自发分泌
PWM刺激分泌
IgG
, 百拇医药
IgM
IgG
IgM
妊高征组
15
120±68
337±119
947±518
2 023± 879
正常妊娠组
15
154±89
371±135
, 百拇医药
1 367±598
2 840±1 057
妊高征组和正常妊娠组比较，B细胞体外自发分泌IgG和IgM 的水平差异均无显著性(P>0.05);而当有PWM刺激时,妊高征组B细胞体外分泌IgG和IgM的水平均分别显著低于正常妊娠组(P<0.05)。
讨论
一、妊高征患者B细胞的功能变化
自本世纪初，有人提出妊高征发病与免疫状态有关以来, 免疫功能变化一直被认为是妊高征发病的一个重要因素[1]。而且认为妊高征的血管内皮细胞损伤也与免疫有关[4，5]。B细胞作为免疫应答的主体之一, 其在妊高征时的功能变化一直是人们研究的一个热点。已有的研究表明,重度妊高征患者体内循环 IgG及IgM水平下降[6，7]，但其测定的结果报道不一[8]。由于影响血清中免疫球蛋白水平的因素较多,致使B细胞的功能难以从血清中免疫球蛋白总量的变化反应出来。另外，由于阻断了抗体识别抗原。因此，在妊娠期检测B细胞特定抗体的分泌也非易事。由此可见，妊高征的B细胞功能变化的研究虽亟待深入，但目前又没有行之有效的方法。因此，本研究检测了妊高征患者B细胞在体外自发分泌和在PWM刺激下产生IgG和IgM能力的变化,从而在影响因素较为单一的情况下,在一定程度上探讨了妊高征的B细胞功能变化。检测结果表明:中、重度妊高征患者的B细胞在体外自发分泌IgG和IgM的水平均无显著差别，而在PWM刺激下,中、重度妊高征患者的B细胞体外分泌IgG和IgM的水平分别显著低于正常孕妇。
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二、妊高征患者B细胞对PWM刺激应答能力下降的可能原因
目前，关于妊高征患者B细胞体外分泌抗体能力下降的原因，尚不十分清楚。但据已有研究结果，不妨作如下推测，即可能是因CD4+细胞,特别是Th细胞的功能低下所致。我们知道，B细胞分泌抗体依赖于CD4+T细胞的辅助和调节,若CD4+T细胞相对数量减少或功能低下,势必导致B细胞产生抗体能力的下降。目前,关于CD4+T细胞相对数量变化的研究报道不一。有些研究表明，妊高征患者的Th细胞的百分比或CD4+/CD8+比值下降[6]，而有些研究则认为该比值较正常孕妇升高或无变化[7，9]。 因此，很难用CD4+T细胞相对数量和比值的变化来解释B细胞产生抗体能力下降的原因。故用CD4+T细胞功能低下来解释可能相对较为合理。当然,要真正弄清妊高征患者B细胞体外分泌抗体能力下降的机理，还需进行深入的工作。
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参考文献
1 Sibai BM. Immunologic aspects of preeclampsia. Clin Obstet Gynecol，1991，34:27-34.
2 乐杰 主编.妇产科学.第4版. 北京：人民卫生出版社. 1997，115.
3 Volkman DJ, Lane HC, Fauci AS. Antigen- induced in vitro antibody production in human: a model for B cell activation and immunoregulation.Proc Ntal Acad Sci USA， 1981，78:2528-2531.
4 郑英如,陈竹钦,颜建华，等.妊高征补体活化与血管内皮细胞损伤关系的初步研究.中华妇产科杂志, 1996，31:152-154.
, http://www.100md.com
5 Rappaport VJ, Hirata G, Yap HK, et al.Anti-vascular endothelial cell antibodies in severe preeclampsia. Am J Obstet Gynecol，1990，162:138-146.
6 Bardeguez AD, Mc Nemey R, Freieri M, et al. Cellular immunity in preeclampsia alterations in T-lymphocyte subpopulation during early pregnancy. Obstet Gynecol， 1991, 77:859-862.
7 Bettin S, Halle H, Wenzkowski BM, et al. Immunologic paremeters in wowen normal pregnancy and preeclampsia. Aentrable Gynakol， 1994，116:260-262.
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8 el Roeiy A,Myers SA, Gleicher M. The relationship between anto antibodies and intrauterine growth retardation in hypertensive disorder of pregnancy. Am J Obstet Gynecol，1991，164:1253-1261.
9 Malinowski A, Szpakowski M, Tchorzewski H, et al. T lymphocyte subpopulations and lymphocyte proliferative activity in normal and pre-eclamptic pregnancy. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol， 1994， 53:27-31.
本课题受国家自然科学基金资助
(收稿：1998-05-06 修回：1998-07-20), 百拇医药