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编号:10268285
脂质体-C-erbB2反义脱氧寡核苷酸对卵巢癌细胞的作用
http://www.100md.com 《中华妇产科杂志》 1999年第8期
     作者:沈梅 丰有吉 葛柏青 吴直江 朱铭伟

    单位:沈梅,丰有吉,葛柏青,朱铭伟 上海医科大学妇产科医院 200011;吴直江 中国科学院上海细胞生物学研究所

    关键词:卵巢肿瘤;DNA;反义;基因;erbB-2;脂质体

    中华妇产科杂志990812 【摘要】 目的 探讨脂质体-C-erbB2反义脱氧寡核苷酸(脂质体-C-erbB2 S-ODNs)对卵巢癌细胞系C-erbB2癌基因表达及细胞增殖的影响。方法 应用流式细胞仪技术,3H-胸腺嘧啶核苷掺入方法,观察脂质体-C-erbB2 S-ODNs对卵巢癌细胞系SKOV3 C-erbB2癌基因表达及细胞生长、细胞周期的作用。结果 脂质体-C-erbB2 S-ODNs能够降低C-erbB2的表达,并抑制细胞生长;脂质体-C-erbB2 S-ODNs降低细胞C-erbB2癌基因表达的作用效率较单用C-erbB2反义脱氧寡核苷酸(C-erbB2 S-ODNs)增强约40倍。结论 C-erbB2癌基因的反义调控在卵巢癌基因治疗中有一定作用;脂质体可有效增强C-erbB2 S-ODNs调控细胞C-erbB2癌基因表达的作用。
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    Effect of Liposome-C-erbB2 Antisense Oligodeoxynucleotides on Human Ovarian Cancer Cells

    SHEN Mei,FENG Youji,GE Baiqing,et al.

    Gynecology and Obstetrics Hospital,Shanghai Medical University,Shanghai 200011

    【Abstract】 Objective To explore the effects of liposome-C-erbB2 antisense phosphorothioate oligo deoxynucleotides(S-ODNs)on C-erbB2 protooncogene expression and cell proliferation in human ovarian cancer cells. Methods The effects on C-erbB2 protooncogene expression, cell proliferation and cell cycle in human ovarian cancer cells were studied by flow cytometry and 3H-thymidine incorporation. Results Liposome-C-erbB2 S-ODNs could reduce C-erbB2 expression and inhibit cell proliferation in human ovarian cancer cells; the effectiveness of liposome-C-erbB2 S-ODNs on the expression of C-erbB2 was much higher than that of C-erbB2 S-ODNs, about 40 times. Conclusions The data in this study suggest that antisense therapy is an useful method of gene therapy in ovarian cancer. The effectiveness of C-erbB2 S-ODNs could be greatly increased by C-erbB2S-ODNs encapsulated in liposomes.
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    【Key words】 Ovarian neoplasms DNA, antisense Genes, erbB-2 Liposomes

    癌基因反义核酸调控,是一种较为有效的基因治疗[1,2]。目前,这方面的研究虽不断增多,但如何将反义核酸有效地导入癌细胞仍是亟待解决的问题。本研究应用脂质体-C-erbB2反义脱氧寡核苷酸(脂质体C-erbB2 S-ODNs),对人卵巢癌细胞SKOV3进行作用,探讨脂质体-C-erbB2 S-ODNs对卵巢癌细胞系C-erbB2癌基因表达及细胞增殖的影响。

    材料及方法

    一、材料

    本研究所用卵巢癌细胞SKOV3由美国标准菌库提供。C-erbB2反义脱氧寡核苷酸(C-erbB2 S-ODNs)由中国科学院上海细胞生物学研究所合成,序列为5′-CAGCTCCATGGTGCT-3′,并经硫代磷酸修饰。脂质体由中国科学院上海生物化学研究所提供。C - erbB2单克隆抗体由美国Zymed Laboratories公司提供。RPMI 1640培养基为日本制药株式会社产品。流式细胞仪为FACS tar PLUS型,美国Becton Dickinson公司产品。β-液体闪烁计数仪(FJ-2107G型)为国营二六二厂产品。
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    二、方法

    1. 脂质体-C - erbB2 S-ODNs的制备:将脂质体与C - erbB2 S-ODNs(质量比为10∶1)分别溶解于等体积无菌去离子双蒸水中,然后将两者混合,配成C-erbB2 S-ODNs浓度分别为0.125mg/L,0.25mg/L,0.5mg/L的溶液,于4℃中静置半小时以上[3]待用。

    2. SKOV3细胞培养:将细胞浓度为5×107/L的SKOV3细胞,在37℃、5%二氧化碳条件下,于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中培养。24小时后,设对照组和实验组,对照组不予特殊处理。实验组又分为3种情况,SKOV3细胞分别用1.25 mg/L,2.5 mg/L、5 mg/L脂质体处理;SKOV3细胞分别用5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L C-erbB2 S-ODNs处理;SKOV3细胞分别用0.125 mg/L、0.25 mg/L、0.5 mg/L脂质体-C-erbB2 S-ODNs处理。培养72小时后进行C - erbB2蛋白表达测定、细胞周期检测和3H-胸腺嘧啶核苷(3H -TdR)掺入实验。
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    3. C-erbB2蛋白表达测定:收集细胞约106个,加入C - erbB2鼠抗人单克隆抗体(1∶10稀释),4℃振荡45分钟后用磷酸缓冲液清洗,加入异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠抗体,4℃振荡45分钟后再清洗。应用流式细胞仪分析C - erbB2蛋白表达强度。

    4. 细胞周期测定:收集对照组细胞,将经20 mg/L C-erbB2 S-ODNs处理的细胞和经0.5 mg/L脂质体-C-erbB2 S-ODNs处理的细胞,置于柠檬酸缓冲液1小时以上,调整细胞浓度为1×109个/L左右,离心后去掉上清液,加入1 800 μl胰酶消化液充分作用后,加入1 500 μl胰酶抑制液数分钟,再加入1 500 μl 碘化丙锭作用15分钟以上。应用流式细胞仪,进行DNA细胞周期分析。

    5.3H -TdR掺入实验:细胞培养于96孔板,24小时后,对照组SKOV3细胞用1.25 mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L脂质体处理;实验组SKOV3细胞用0.125 mg/L、0.25 mg/L、0.5 mg/L脂质体-C-erbB2 S-ODNs处理,72小时后,每孔加入0.5 μCr3 H-TdR培养18小时。最后,用细胞收集器收集细胞于玻璃纤维滤纸上,用β-液体闪烁计数仪测定放射性强度。
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    三、统计学方法

    本研究采用t检验方法。

    结果

    一、脂质体-C - erbB2 S-ODNs对SKOV3细胞C-erbB2蛋白表达的作用

    实验组SKOV3细胞经不同浓度脂质体-C-erbB2 S-ODNs,C - erbB2 S-ODNs作用72小时后,C - erbB2表达均明显下降。与C - erbB2 S-ODNs的作用相比,脂质体-C - erbB2 S-ODNs的用量仅为C-erbB2 S-ODNs用量的1/40,而降低C - erbB2表达的作用也可增加。经不同浓度脂质体作用72小时后,C - erbB2表达与对照组比较,无明显改变。

    二、脂质体-C-erbB2 S-ODNs对SKOV3细胞周期的影响
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    SKOV3细胞分别经0.5 mg/L脂质体-C - erbB2 S-ODNs,20 mg/L C-erbB2 S-ODNs 作用72小时后,与对照组细胞周期比较,差异无显著性(P>0.05)(表1)。

    表1 不同细胞周期两组SKOV3细胞的改变*(%, ±s) 细胞周期

    对照组

    实验组

    C-erbB2 S-ODNs

    (20mg/L)

    脂质体-C-erbB2
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    S-ODNs

    (0.5mg/L)

    G0、G1

    66.11±3.56

    64.97±3.20

    64.28±2.30

    G2、M

    16.94±3.34

    17.97±2.49

    20.39±5.53

    S

    16.95±2.80
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    17.10±2.74

    15.32±5.03

    *各细胞周期细胞占总细胞数百分比,两组比较,P>0.05

    三、脂质体-C-erbB2 S-ODNs对SKOV3细胞生长的抑制作用

    SKOV3细胞经不同浓度脂质体-C-erbB2 S-ODNs作用后,3H-TdR掺入率较单用脂质体均有下降(表2)。当浓度为0.25 mg/L时,两组比较,差异有显著性(P<0.05)。

    表2 不同浓度脂质体-C-erbB2 S-ODNs 对SKOV3 细胞

    生长的影响*(±s) 脂质体浓度
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    (mg/L)

    每分钟脉冲数(cpm)

    细胞生长

    抑制率(%)

    对照组

    实验组

    1.25

    1 938.2±273.7

    1 844.0±484.9

    95.1±25.0

    2.5

    1 750.2±244.6
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    1 304.8± 27.6

    74.6± 1.6

    5

    1 409.4±324.2

    1 023.6±276.8

    72.6±19.6

    *3H-TdR掺入量表示,两组比较,P<0.05

    讨论

    随着分子生物学在卵巢癌领域研究的深入,已发现多种癌基因的异常表达与卵巢癌的生物学行为密切相关,有的与细胞转化有关,有的与细胞增殖有关,有的两者兼而有之,其中又以C - erbB2较为重要。不少研究表明,在20%~40%的卵巢癌细胞中存在C - erbB2基因的扩增和高表达,而且可能与卵巢癌的不良预后密切相关[4,5]。如何人为降低C-erbB2的高表达,从而改变卵巢癌的某些生物学表现,近年来,国内外学者都进行了一些有意义的探索[6,7]
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    一、脂质体-C - erbB2 S-ODNs的反义调控作用及机理

    反义调控,作为一种特异性封闭有害基因,使其不表达或低表达的手段,目前在肿瘤治疗研究中颇受重视,已有文献报道了癌基因的反义核酸对肿瘤细胞的抑制作用[1,7]。本研究选用C - erbB2高表达的人卵巢癌SKOV3细胞系[8],设计并人工合成了作用于C - erbB2 cmRNA 5′端编码区的反义脱氧寡核苷酸[9],用硫代磷酸修饰后再用脂质体包裹。本研究结果表明,脂质体-C - erbB2 S-ODNs和C - erbB2 S-ODNs均能抑制SKOV3细胞C - erbB2 癌基因的表达,而前者的作用效率约为后者的40倍。

    关于反义调控的机理,目前还不明确。根据反义寡核苷酸设计的不同,可能作用于蛋白表达过程中的不同环节。本研究所选用的C-erbB2 S-ODNs是与C - erbB2 cmRNA 5′端编码区互补的,是否通过反义寡核苷酸与癌基因DNA形成三螺旋结构而抑制了转录过程的进行,从而抑制了癌基因蛋白的表达[10,11],还有待进一步的研究证明。
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    3H-TdR掺入实验选用脂质体组为对照组,是为了消除脂质体对细胞3H-TdR掺入率的影响,因为脂质体能够增加细胞对3H-TdR的吸收。本研究结果表明,脂质体-C - erbB2 S-ODNs可抑制SKOV3细胞生长,其抑制率约为30%,这与吴令英等[6]报道的结果相符。

    二、脂质体对C - erbB2反义调控的增强作用及意义

    目前,选择合适的导入系统仍是基因治疗中的一个难题。本研究所选用的脂质体,其表面带有正电荷,它能够与反义寡核苷酸通过静电引力结合,使反义寡核苷酸的包裹率达100%[3]。脂质体通过与细胞的融合和内吞作用,将C - erbB2 S-ODNs导入细胞中,这就增加了细胞的吸收。而且,因为有脂质体的包裹,而使C - erbB2 S-ODNs避免了与血清中核酸酶的直接接触,又可使C - erbB2 S-ODNs的稳定性提高。因此,降低细胞C - erbB2癌基因表达的作用效率较单纯用C - erbB2 S-ODNs增强了约40倍,大大减少了反义寡核苷酸的用量,有利于反义寡核苷酸的应用研究。
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    本课题受国家自然科学基金资助(基金编号:39470724)

    参考文献

    1 Reed JC, Stein C, Subasinghe C, et al. Antisense-mediated inhibition of BCL2 protooncogene expression and leukemic cell growth and survival: comparisons of phosphodiester and phosphorothioate oligo-deoxy- nucleotides. Cancer Res, 1990, 50: 6565-6570.

    2 Colomer R, Lupu R, Bacus SS, et al. erbB2 antisense oligonucleotides inhibit the proliferation of breast carcinoma cells with erbB2 oncogene amplification. Br J Cancer, 1994, 70: 819-825.
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    3 杨静平,孔玉英,林其谁. SA脂质体:高效介导DNA转染的新试剂. 生物化学与生物物理学学报,1993,25:231-237.

    4 Slamon DJ, Godolphin W, Jones LA, et al. Studies of the HER-2/neu proto-oncogeng in human breast and ovarian cancer. Science, 1989, 244: 707-712.

    5 Berchuck A, Kamel A, Whitaker R, et al. Overexpression of HER-2/neu is associated with poor survival in advanced epithelial ovarian cancer. Cancer Res, 1990, 50: 4087-4091.

    6 吴令英,吴爱如,姜琨,等. C - erbB2 反义核酸对卵巢癌细胞系生物学行为及药物敏感性的影响. 中华妇产科杂志,1996,31:169-172.
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    7 Wiechen K, Dietel M. C-erbB2 antisense phosphorothioate oligo- deoxynucleotides inhibit growth and serum-induced cell spreading of P185-overexpression ovarian carcinoma cells. Int J Cancer, 1995, 63: 604-608.

    8 King BL, Carter D, Foellmer HG, et al. Neu proto-oncogene ampli- fication and expression in ovarian adenocarcinoma cell lines. Am J Pathol, 1992, 140: 23-31.

    9 金志军,张惜阴,丰有吉,等. 卵巢癌细胞C - erbB2基因表达与细胞免疫的关系. 中华妇产科杂志,1995,30:222-224.
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    10 Helm CW, Shrestha K, Thomas S, et al. An unique C-myc-targeted triplex-forming oligonucleotide inhibits the growth of ovarian and cervical carcinomas in vitro. Gynecol Oncol, 1993, 49: 339-343.

    11 Postel EH, Flint SJ, Kessler DJ, et al. Evidence that a triplex-forming oligodeoxyribonucleotide binds to the C-myc promoter in hela cells, thereby reducing C-myc mRNA levels. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88: 8227-8231.

    (收稿:1998-08-30 修回:1999-05-12), 百拇医药