应用荧光原位杂交技术进行人类早期胚胎性染色体嵌合型的初步研究
作者：徐艳文 庄广伦 周灿权 张敏芳 李莉琳
单位：中山医科大学附属第一医院妇产科生殖医学研究中心 510080 广州
关键词：性染色体；镶嵌现象；原位杂交；荧光；性决定(分析)
中华妇产科杂志991008 【摘要】 目的 应用双色荧光原位杂交技术对人类早期胚胎性染色体嵌合型进行初步分析，并进行单细胞种植前性别检测。方法 对体外受精与胚胎移植治疗周期中胚胎质量差，不适于胚胎移植和冷冻的18个正常受精胚胎共73个细胞和3个多精受精胚胎，进行双色荧光原位杂交。结果 有两个细胞以上的14个正常受精胚胎中9个胚胎有不同程度的性染色体嵌合，其中男性胚胎41个细胞中XO有5个，占12%；女性胚胎28个细胞中XO有4个，占14%。结论 应用荧光原位杂交技术可准确地进行单细胞种植前性别诊断，性染色体嵌合型不会影响胚胎的性别诊断。
Dual Color Fluorescent In-situ Hybridization Detects Sex Chromosome Mosaicism in Human Embryos
, 百拇医药
XU Yanwen, ZHUANG Guanglun, ZHOU Canquan, et al.
Reproductive Medical Center, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080
【Abstract】 Objective Using dual color fluorescent in-situ hybridization (FISH) to detect sex chromosome mosaicism in human embryos and perform preimplantation gender diagnosis. Methods Three abnormal fertilized embryos and 18 normal fertilized embryos which were not suitable for embryo transfer and cryopreservation were analyzed by dual color fluorescent in-situ hybridization. Results Mosaicism analysis was performed on 14 normal fertilized embryos, which had more than two cells. Nine embryos had sex chromosome mosaicism. XO in male and female embryos cells were 12% and 14% respectively. Conclusion Identification of sex by FISH analysis of a single cleavage cell is accurate, and sex chromosome mosaicism will not affect preimplantation gender diagnosis.
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【Key words】 Sex chromosomes Mosaicism In situ hybridization, fluorescence Sex determination (analysis)
人类胚胎性染色体的嵌合型，是在80年代初研究胚胎的形态和着床的关系时发现的[1]。当时所用的方法是将胚胎细胞终止于分裂相后再进行染色体核型分析。但要想得到胚胎所有细胞的染色体非常困难，而且染色体的质量一般较差，无法排除染色体流失造成结果不正常的可能[2]。而90年代兴起的荧光原位杂交(fluorescence in-situ hybridization, FISH)技术特异性高，而且可以精确定位。随着FISH技术在种植前诊断的应用，人类胚胎性染色体嵌合型的研究也更加深入。我们应用两色FISH对人类早期胚胎性染色体的嵌合型进行初步分析，并进行单细胞种植前性别检测。
资料与方法
, 百拇医药
一、研究对象
取1998年11月～1999年1月本生殖医学研究中心体外受精与胚胎移植治疗周期中胚胎质量差，评分低于2分，碎片>50%，不适于胚胎移植和冷冻的18个正常受精胚胎和3个多精受精胚胎，均在受精后第2天或第3天进行固定。
二、方法
1. 细胞固定：将胚胎置于酞若酸(acide tyro- des)内，当透明带被消化后转移到N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(Hepes)缓冲液内，用内径80μm的细管吹打，直至细胞散开。取单个细胞放在已滴有1 μl吐温-20/盐酸的玻片上，在镜下观察直至细胞溶解。玻片干后在磷酸盐缓冲液内洗5分钟，然后依次用70%、85%和100%的酒精脱水。玻片可在-20℃保存[3]。
2. 对照淋巴细胞的培养：用淋巴细胞进行FISH杂交率的对照。在无菌条件下，将染色体正常的成年男性外周血0.6ml加入5ml 淋巴细胞培养液RPMI-1640中，轻轻摇匀，置于37℃培养箱中培养66小时。在培养终止前，加入秋水仙素(2ng/ml，0.5 ml)，然后用低渗液0.075 mol 氯化钾和固定液甲醇∶冰醋酸(3∶1)处理。最后将细胞悬液滴在清洁的玻片上，镜下观察染色体的分散情况，玻片在-20℃下保存。
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3. FISH: 探针选用美国Vysis公司的染色体计数探针(chromosome enumeration probe，CEP) 。其中X染色体探针(CEP X)用橙色标记，Y染色体探针(CEP Y)用绿色标记。变性时将玻片置于73℃ 70%的甲酰氨中5分钟，然后加入73℃已变性混有杂交液的探针。盖上盖玻片后用橡皮水泥封口，37℃杂交炉内杂交2～4小时。杂交完成后切开盖玻片，将玻片置于73℃ 0.4×氯化钠/柠檬酸钠缓冲液/0.3%乙基苯基聚乙二醇(0.4×SSC/0.3% Nonidet P-40)中2分钟和室温下2×SSC/0.1% Nonidet P-40中1分钟洗脱非特异性杂交，最后加入 10μl 4′，6-diamidino-2-plenylindole(DAPI)复染剂复染后在奥林巴斯BX50荧光镜下分别用罗丹明(rhodamine)和异硫氰酸荧光素(FITC)滤片观察结果。
4. 结果的评定：当细胞同时出现红、绿信号各一个时，诊断为男性胚胎(XY)。仅当同时出现两个红色信号时，诊断为女性胚胎(XX)。如果信号有分裂，但两个信号非常接近，互相有交叉或并排排列两者之间的距离小于信号大小的一半时，判断为一个信号[2,4]。
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结果
一、淋巴细胞
在对照的500个男性淋巴细胞中，99.2%的淋巴细胞有杂交信号，93.9%显示正常男性XY，信号分裂共13个，另有XO 3个，YO 5个。
二、胚胎细胞
18个正常受精的胚胎共有73个核，但其中4个胚胎都仅有1个细胞无法用于嵌合型分析，剩余15个胚胎中男性胚胎7个共41个细胞，女性胚胎7个共28个细胞。仅有3个胚胎的所有细胞均为正常二倍体，9个有不同程度的染色体嵌合型，2个全部细胞均为染色体异常。男性胚胎41个细胞中XY有28个，占68.0%，XO 5个，占12%，还有XXY 3个，XYY 2个，XXYY 1个和双核细胞2个。女性胚胎28个细胞中XX 15个，占54.0%，XO 4个，占14.0%，还有XXX 3个，双核细胞共4个，三核细胞2个。
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多精受精胚胎共3个，染色体核型分别为(1)XX，XXY，XXY；(2)5XYY，一个双核XYY XYY；(3)4YY。
讨论
一、性染色体嵌合型的发生率及影响因素
由于胚胎细胞来源有限，关于人类胚胎性染色体嵌合型的研究报道不多。1994年，Munné等[2]选用形态正常的单精受精胚胎和发育停滞及形态不正常的胚胎，进行三色FISH，检测X、Y和18号染色体，结果形态正常的胚胎中17.1%有嵌合型，而发育停滞和形态不正常的胚胎中28.8%有嵌合型。Munné等[5]第二年再将胚胎分为发育停滞、发育缓慢和有碎片及正常双倍体胚胎3组，嵌合型分别为39.6%，25.2%和14.1%，3组比较，差异有显著性。另外也有学者分析了其他染色体，如Laverge等[6]及Delhanty等[7]分别报道用X、Y和1号染色体探针三色FISH检测，结果中正常核型的胚胎分别占39.0%和50.0%，有性染色体嵌合型的胚胎占23.0%和30.0%。而 Magli等[8]报道，用五色FISH(X，Y，13，16和18号染色体探针)分析正常形态胚胎中仅39.0%正常，染色体异常率达57.0%。
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性染色体嵌合型及其他染色体异常发生率的变化受以下因素影响：(1) 卵子培养和操作时温度的改变；(2) 母亲年龄；(3) 培养时氧浓度；(4) 超排卵方案；(5) 胚胎的形态及发育；(6) 有无多核细胞；(7) 检测染色体的数目和号数。Munné等[9]在比较了4个中心的胚胎FISH结果后发现，嵌合型的发生率波动在11.0%～52.0%，影响因素中培养系统和超排卵方案影响最大。本研究中正常二倍体胚胎仅3个，嵌合型9个，占64.0%，这可能与胚胎质量差和样本量少有关。
二、性染色体嵌合型的发生机理
一般认为，由于有丝分裂时染色体不分离或1～2个细胞极性改变可发生嵌合型。嵌合型发生的时间与卵裂有关，如果嵌合型发生于第1次卵裂，则所有细胞均不正常，嵌合型发生于第2、3次卵裂时，其不正常细胞分别为50.0%和25.0%[2]。大多数二倍体嵌合型发生于第2次卵裂以后，本实验结果也支持这一观点。在同一胚胎中嵌合型约占1/2～1/8。另有2个染色体异常的胚胎核型均为XO，其嵌合型可能发生于第1次卵裂[2]。
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在研究嵌合型的同时，逐渐发现多核细胞的存在及其对胚胎的影响。即使在形态正常的胚胎中也有部分细胞是多核细胞。Balakier等[10]报道，15.0%的质量好的胚胎有1个以上多核细胞，2细胞期多核细胞占67.0%，4细胞期占25.0%。本研究中69个细胞中有6个双核细胞，2个3核细胞。这些细胞和嵌合型细胞有可能发育较慢或停滞，并不阻碍整个胚胎的发育，但亦有作者提出这些异常细胞有可能发展为滋养内层细胞，而不发展为内细胞团，所以胎儿的染色体异常率没有胚胎的染色体异常率高[11]。
三、性染色体嵌合型对种植前性别诊断的意义
很值得注意的是，嵌合型不会对胚胎的性别诊断有影响[3]。当同时出现2个X信号时才诊断为女性胚胎，一般可得到正确的诊断。本研究中7个女性胚胎无一出现Y信号，而在7个男性胚胎中无一出现2个X信号而不出现Y信号的。Kuo等[3]报道，女性胚胎中XO或无信号占7.0%，而男性胚胎中XO占12.3%。本研究中女性胚胎中XO占14.0%，男性胚胎中XO占12.0%，如果仅出现一个XO就诊断为女性胚胎的话，这些男性胚胎就极易造成误诊，所以多位学者强调一定要同时出现2个X信号时才能诊断为女性胚胎，这也可能是在单细胞聚合酶链反应中误诊的重要原因之一。
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参考文献
1 Angell RR, Aitken RJ, van Look PFA, et al. Chromosome abnormalities in human embryos after in-vitro fertilization. Nature， 1983，303: 336-338.
2 Munné S, Weier HUG, Grifo J，et al. Chromosome mosaicism in human embryos. Biol Reprod, 1994, 51: 373-379.
3 Kuo HC, Ogilvie CM, Handyside AH. Chromosomal mosaicism in cleavage-stage human embryos and the accuracy of single-cell genetic analysis. J Assis Reprod Genet, 1998, 15: 276-280.
, 百拇医药
4 Munné S, Dailey T, Finkelstein M, et al. Reduction in signal overlap results in increased FISH efficiency: implications for preimplantation genetic diagnosis. J Assis Reprod Genet, 1996, 13: 149-156.
5 Munné S, Alikani M, Tomkin G, et al. Embryo morphology, developmental rates, and maternal age are correlated with chromosome abnormalities. Fertil Steril, 1995, 64: 382-391.
6 Laverge H, De Sutter P, Verschraegen-Spae MR， et al. Triple color fluorescent in-situ hybridization for chromosomes X,Y, and 1 on spare human embryos. Hum Reprod, 1997, 12: 809-814.
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7 Delhanty JD, Harper JC, Ao A, et al. Multicolour FISH detects frequent chromosomal mosaicism and chaotic division in normal preimplantation embryos from fertile patients. Hum Genet, 1997, 99: 755-760.
8 Magli MC, Gianaroli L, Munné S, et al. Incidence of chromosomal abnormalities from a morphologically normal cohort of embryos in poor-prognosis patients. J Assis Reprod Genet, 1998, 15: 297-301.
9 Munné S, Magli C, Adler A, et al. Treatment-related chromosome abnormalities in human embryos. Hum Reprod, 1997, 12: 780-784.
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10 Balakier H， Cadesky K. The frequency and developmental capability of human embryos containing multinucleated blastomeres. Hum Reprod, 1997,12: 800-804.
11 Edwards RG, Beard HK， Oocyte A. Polarity and cell determination in early mammalian embryos. Mol Hum Reprod, 1997, 3: 863-905.
(收稿：1999-02-19 修回：1999-07-20), 百拇医药
单位：中山医科大学附属第一医院妇产科生殖医学研究中心 510080 广州
关键词：性染色体；镶嵌现象；原位杂交；荧光；性决定(分析)
中华妇产科杂志991008 【摘要】 目的 应用双色荧光原位杂交技术对人类早期胚胎性染色体嵌合型进行初步分析，并进行单细胞种植前性别检测。方法 对体外受精与胚胎移植治疗周期中胚胎质量差，不适于胚胎移植和冷冻的18个正常受精胚胎共73个细胞和3个多精受精胚胎，进行双色荧光原位杂交。结果 有两个细胞以上的14个正常受精胚胎中9个胚胎有不同程度的性染色体嵌合，其中男性胚胎41个细胞中XO有5个，占12%；女性胚胎28个细胞中XO有4个，占14%。结论 应用荧光原位杂交技术可准确地进行单细胞种植前性别诊断，性染色体嵌合型不会影响胚胎的性别诊断。
Dual Color Fluorescent In-situ Hybridization Detects Sex Chromosome Mosaicism in Human Embryos
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XU Yanwen, ZHUANG Guanglun, ZHOU Canquan, et al.
Reproductive Medical Center, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080
【Abstract】 Objective Using dual color fluorescent in-situ hybridization (FISH) to detect sex chromosome mosaicism in human embryos and perform preimplantation gender diagnosis. Methods Three abnormal fertilized embryos and 18 normal fertilized embryos which were not suitable for embryo transfer and cryopreservation were analyzed by dual color fluorescent in-situ hybridization. Results Mosaicism analysis was performed on 14 normal fertilized embryos, which had more than two cells. Nine embryos had sex chromosome mosaicism. XO in male and female embryos cells were 12% and 14% respectively. Conclusion Identification of sex by FISH analysis of a single cleavage cell is accurate, and sex chromosome mosaicism will not affect preimplantation gender diagnosis.
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【Key words】 Sex chromosomes Mosaicism In situ hybridization, fluorescence Sex determination (analysis)
人类胚胎性染色体的嵌合型，是在80年代初研究胚胎的形态和着床的关系时发现的[1]。当时所用的方法是将胚胎细胞终止于分裂相后再进行染色体核型分析。但要想得到胚胎所有细胞的染色体非常困难，而且染色体的质量一般较差，无法排除染色体流失造成结果不正常的可能[2]。而90年代兴起的荧光原位杂交(fluorescence in-situ hybridization, FISH)技术特异性高，而且可以精确定位。随着FISH技术在种植前诊断的应用，人类胚胎性染色体嵌合型的研究也更加深入。我们应用两色FISH对人类早期胚胎性染色体的嵌合型进行初步分析，并进行单细胞种植前性别检测。
资料与方法
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一、研究对象
取1998年11月～1999年1月本生殖医学研究中心体外受精与胚胎移植治疗周期中胚胎质量差，评分低于2分，碎片>50%，不适于胚胎移植和冷冻的18个正常受精胚胎和3个多精受精胚胎，均在受精后第2天或第3天进行固定。
二、方法
1. 细胞固定：将胚胎置于酞若酸(acide tyro- des)内，当透明带被消化后转移到N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(Hepes)缓冲液内，用内径80μm的细管吹打，直至细胞散开。取单个细胞放在已滴有1 μl吐温-20/盐酸的玻片上，在镜下观察直至细胞溶解。玻片干后在磷酸盐缓冲液内洗5分钟，然后依次用70%、85%和100%的酒精脱水。玻片可在-20℃保存[3]。
2. 对照淋巴细胞的培养：用淋巴细胞进行FISH杂交率的对照。在无菌条件下，将染色体正常的成年男性外周血0.6ml加入5ml 淋巴细胞培养液RPMI-1640中，轻轻摇匀，置于37℃培养箱中培养66小时。在培养终止前，加入秋水仙素(2ng/ml，0.5 ml)，然后用低渗液0.075 mol 氯化钾和固定液甲醇∶冰醋酸(3∶1)处理。最后将细胞悬液滴在清洁的玻片上，镜下观察染色体的分散情况，玻片在-20℃下保存。
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3. FISH: 探针选用美国Vysis公司的染色体计数探针(chromosome enumeration probe，CEP) 。其中X染色体探针(CEP X)用橙色标记，Y染色体探针(CEP Y)用绿色标记。变性时将玻片置于73℃ 70%的甲酰氨中5分钟，然后加入73℃已变性混有杂交液的探针。盖上盖玻片后用橡皮水泥封口，37℃杂交炉内杂交2～4小时。杂交完成后切开盖玻片，将玻片置于73℃ 0.4×氯化钠/柠檬酸钠缓冲液/0.3%乙基苯基聚乙二醇(0.4×SSC/0.3% Nonidet P-40)中2分钟和室温下2×SSC/0.1% Nonidet P-40中1分钟洗脱非特异性杂交，最后加入 10μl 4′，6-diamidino-2-plenylindole(DAPI)复染剂复染后在奥林巴斯BX50荧光镜下分别用罗丹明(rhodamine)和异硫氰酸荧光素(FITC)滤片观察结果。
4. 结果的评定：当细胞同时出现红、绿信号各一个时，诊断为男性胚胎(XY)。仅当同时出现两个红色信号时，诊断为女性胚胎(XX)。如果信号有分裂，但两个信号非常接近，互相有交叉或并排排列两者之间的距离小于信号大小的一半时，判断为一个信号[2,4]。
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结果
一、淋巴细胞
在对照的500个男性淋巴细胞中，99.2%的淋巴细胞有杂交信号，93.9%显示正常男性XY，信号分裂共13个，另有XO 3个，YO 5个。
二、胚胎细胞
18个正常受精的胚胎共有73个核，但其中4个胚胎都仅有1个细胞无法用于嵌合型分析，剩余15个胚胎中男性胚胎7个共41个细胞，女性胚胎7个共28个细胞。仅有3个胚胎的所有细胞均为正常二倍体，9个有不同程度的染色体嵌合型，2个全部细胞均为染色体异常。男性胚胎41个细胞中XY有28个，占68.0%，XO 5个，占12%，还有XXY 3个，XYY 2个，XXYY 1个和双核细胞2个。女性胚胎28个细胞中XX 15个，占54.0%，XO 4个，占14.0%，还有XXX 3个，双核细胞共4个，三核细胞2个。
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多精受精胚胎共3个，染色体核型分别为(1)XX，XXY，XXY；(2)5XYY，一个双核XYY XYY；(3)4YY。
讨论
一、性染色体嵌合型的发生率及影响因素
由于胚胎细胞来源有限，关于人类胚胎性染色体嵌合型的研究报道不多。1994年，Munné等[2]选用形态正常的单精受精胚胎和发育停滞及形态不正常的胚胎，进行三色FISH，检测X、Y和18号染色体，结果形态正常的胚胎中17.1%有嵌合型，而发育停滞和形态不正常的胚胎中28.8%有嵌合型。Munné等[5]第二年再将胚胎分为发育停滞、发育缓慢和有碎片及正常双倍体胚胎3组，嵌合型分别为39.6%，25.2%和14.1%，3组比较，差异有显著性。另外也有学者分析了其他染色体，如Laverge等[6]及Delhanty等[7]分别报道用X、Y和1号染色体探针三色FISH检测，结果中正常核型的胚胎分别占39.0%和50.0%，有性染色体嵌合型的胚胎占23.0%和30.0%。而 Magli等[8]报道，用五色FISH(X，Y，13，16和18号染色体探针)分析正常形态胚胎中仅39.0%正常，染色体异常率达57.0%。
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性染色体嵌合型及其他染色体异常发生率的变化受以下因素影响：(1) 卵子培养和操作时温度的改变；(2) 母亲年龄；(3) 培养时氧浓度；(4) 超排卵方案；(5) 胚胎的形态及发育；(6) 有无多核细胞；(7) 检测染色体的数目和号数。Munné等[9]在比较了4个中心的胚胎FISH结果后发现，嵌合型的发生率波动在11.0%～52.0%，影响因素中培养系统和超排卵方案影响最大。本研究中正常二倍体胚胎仅3个，嵌合型9个，占64.0%，这可能与胚胎质量差和样本量少有关。
二、性染色体嵌合型的发生机理
一般认为，由于有丝分裂时染色体不分离或1～2个细胞极性改变可发生嵌合型。嵌合型发生的时间与卵裂有关，如果嵌合型发生于第1次卵裂，则所有细胞均不正常，嵌合型发生于第2、3次卵裂时，其不正常细胞分别为50.0%和25.0%[2]。大多数二倍体嵌合型发生于第2次卵裂以后，本实验结果也支持这一观点。在同一胚胎中嵌合型约占1/2～1/8。另有2个染色体异常的胚胎核型均为XO，其嵌合型可能发生于第1次卵裂[2]。
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在研究嵌合型的同时，逐渐发现多核细胞的存在及其对胚胎的影响。即使在形态正常的胚胎中也有部分细胞是多核细胞。Balakier等[10]报道，15.0%的质量好的胚胎有1个以上多核细胞，2细胞期多核细胞占67.0%，4细胞期占25.0%。本研究中69个细胞中有6个双核细胞，2个3核细胞。这些细胞和嵌合型细胞有可能发育较慢或停滞，并不阻碍整个胚胎的发育，但亦有作者提出这些异常细胞有可能发展为滋养内层细胞，而不发展为内细胞团，所以胎儿的染色体异常率没有胚胎的染色体异常率高[11]。
三、性染色体嵌合型对种植前性别诊断的意义
很值得注意的是，嵌合型不会对胚胎的性别诊断有影响[3]。当同时出现2个X信号时才诊断为女性胚胎，一般可得到正确的诊断。本研究中7个女性胚胎无一出现Y信号，而在7个男性胚胎中无一出现2个X信号而不出现Y信号的。Kuo等[3]报道，女性胚胎中XO或无信号占7.0%，而男性胚胎中XO占12.3%。本研究中女性胚胎中XO占14.0%，男性胚胎中XO占12.0%，如果仅出现一个XO就诊断为女性胚胎的话，这些男性胚胎就极易造成误诊，所以多位学者强调一定要同时出现2个X信号时才能诊断为女性胚胎，这也可能是在单细胞聚合酶链反应中误诊的重要原因之一。
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参考文献
1 Angell RR, Aitken RJ, van Look PFA, et al. Chromosome abnormalities in human embryos after in-vitro fertilization. Nature， 1983，303: 336-338.
2 Munné S, Weier HUG, Grifo J，et al. Chromosome mosaicism in human embryos. Biol Reprod, 1994, 51: 373-379.
3 Kuo HC, Ogilvie CM, Handyside AH. Chromosomal mosaicism in cleavage-stage human embryos and the accuracy of single-cell genetic analysis. J Assis Reprod Genet, 1998, 15: 276-280.
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4 Munné S, Dailey T, Finkelstein M, et al. Reduction in signal overlap results in increased FISH efficiency: implications for preimplantation genetic diagnosis. J Assis Reprod Genet, 1996, 13: 149-156.
5 Munné S, Alikani M, Tomkin G, et al. Embryo morphology, developmental rates, and maternal age are correlated with chromosome abnormalities. Fertil Steril, 1995, 64: 382-391.
6 Laverge H, De Sutter P, Verschraegen-Spae MR， et al. Triple color fluorescent in-situ hybridization for chromosomes X,Y, and 1 on spare human embryos. Hum Reprod, 1997, 12: 809-814.
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7 Delhanty JD, Harper JC, Ao A, et al. Multicolour FISH detects frequent chromosomal mosaicism and chaotic division in normal preimplantation embryos from fertile patients. Hum Genet, 1997, 99: 755-760.
8 Magli MC, Gianaroli L, Munné S, et al. Incidence of chromosomal abnormalities from a morphologically normal cohort of embryos in poor-prognosis patients. J Assis Reprod Genet, 1998, 15: 297-301.
9 Munné S, Magli C, Adler A, et al. Treatment-related chromosome abnormalities in human embryos. Hum Reprod, 1997, 12: 780-784.
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10 Balakier H， Cadesky K. The frequency and developmental capability of human embryos containing multinucleated blastomeres. Hum Reprod, 1997,12: 800-804.
11 Edwards RG, Beard HK， Oocyte A. Polarity and cell determination in early mammalian embryos. Mol Hum Reprod, 1997, 3: 863-905.
(收稿：1999-02-19 修回：1999-07-20), 百拇医药