豚鼠与鸡内耳膜迷路蛋白电泳图像分析
作者：胡宁 姜泗长 顾瑞 胡吟燕
单位：100853 北京 解放军总医院耳鼻咽喉科研究所 (胡宁 现在 100037 北京 海军总医院耳鼻咽喉科)
关键词：
中华耳鼻咽喉科/基础研究简报/980118 本文旨在通过对不同种属的内耳膜迷路蛋白(MPL)的电泳分布特点的分析，为以异种MLP为抗原检测人血清抗内耳抗体提供依据。
一、材料与方法
MLP的提取： 取听力正常的杂色豚鼠4只和1日龄雏鸡20只的双侧颞骨，冰浴中剥离全部膜迷路组织。提取液分别为pH7.4的含0.1% 十二烷基硫酸钠(SDS)的0.01 mol/L PBS及单纯PBS，豚鼠为8耳加至1 ml，鸡为40耳加至1 ml。经匀浆、反复冻融、离心，上清液即为豚鼠MLP样品(G-MLP)和鸡MLP样品(Ch-MLP)，蛋白浓度约2 mg/ml，包括含SDS样品(G-SDS和Ch-SDS)及不含SDS样品(G-PBS和Ch-PBS)。
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十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳与电转移：不连续垂直板胶系统，3%浓缩胶，5%～20%线性梯度分离胶。样品处理液为1 mmol/L Tris-HCl缓冲液,pH6.8，含2%SDS,1%蔗糖，5%β-巯基乙醇及0.002%溴酚蓝。每孔加样30 μl，样品与处理液1∶1混合，100℃水浴1分钟。低分子量标准蛋白与处理液1∶2混合。浓缩电泳条件120V，1小时，分离条件180V，4小时。电转移条件150V，100 mA，3小时。将硝酸纤维素膜行氨基黑10B染色，酒精醋酸脱色液脱色。
图像分析：以摄像机将硝酸纤维素膜图像输入计算机进行分析。每样品柱以0.1282 mm间隔分析采样，采样总长65.5108 mm，共采样511点，得出灰度值曲线。每一灰度峰对应一条蛋白区带，根据标准分子量蛋白数据计算出各蛋白带对应分子量。蛋白带的蛋白含量以灰度峰的面积表示。
二、结果
G-MLP和Ch-MLP分别有30和34个灰度峰，结合表观图像(附图)，可将两种MLP分为12条主要的蛋白区带，以A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L标记，对应分子量G-MLP为134 000、98 000、82 000、65 000、56 000、48 000、40 000、33 000、30 000、26 000、21 000、19 000，Ch-MLP为134 000、96 000、82 000、64 000、53 000、45 000、40 000、33 000、30 000、27 000、21 000、18 000。
, 百拇医药
Ch-MLP电泳分布偏向高分子量侧，A-G间的蛋白所占比例Ch-SDS为75%、Ch-PBS为71.9%。G-MLP在67 000以上含量甚微，D-J间的蛋白所占比例G-SDS为77.4%、G-PBS为71.8%。Ch-MLP与G-MLP的主要蛋白区带的分子量基本对应，只是含量有差别。在D-G间，两者的蛋白含量均很丰富，所占比例Ch-SDS为51.4%、Ch-PBS为42.5%、G-SDS为43.5%、G-PBS为42.7%。在D、G，E、H 区带，两者的对应分子量和蛋白含量较相近，并且在表观上很易分辩。两种MLP的含SDS的均比不含SDS的提取液获得的蛋白的含量高，并且不改变的主要蛋白区带的位置，其中G-MLP的A、D、K、L带及Ch-MLP的D带的蛋白含量保持不变。
三、讨论
本文结果显示豚鼠和鸡的MLP在电泳分布上具有许多相似特点，说明不同种属内耳组织间存在着相同的蛋白组成或认为存在着相同的蛋白抗原，表明以异种甚至禽类的MLP作为检测人血清抗内耳组织抗体的抗原是可行的。在检测结果判断时，对于两种MLP电泳分布上分子量对应或蛋白含量相近或表观图像相似的蛋白区带对应的反应，应高度重视。由于两种MLP的D带，对不同的样品处理液，均能保持蛋白含量的不变，说明D带具有一定程度稳定特性，这一特性可以为载于NC膜上的内耳抗原制备，及免疫印迹法检测抗内耳抗体的结果判断提供参照。
附图 NC膜上的MLP电泳表观图象。1、6为G-SDS，2、7为G-PBS，3、8为Ch-PBS。5为标准分子量蛋白，从上至下，五条蛋白带代表的分子量为94 000、67 000、43 000、30 000、17 500
(收稿：1997-05-23 修回：1997-11-11), http://www.100md.com
单位：100853 北京 解放军总医院耳鼻咽喉科研究所 (胡宁 现在 100037 北京 海军总医院耳鼻咽喉科)
关键词：
中华耳鼻咽喉科/基础研究简报/980118 本文旨在通过对不同种属的内耳膜迷路蛋白(MPL)的电泳分布特点的分析，为以异种MLP为抗原检测人血清抗内耳抗体提供依据。
一、材料与方法
MLP的提取： 取听力正常的杂色豚鼠4只和1日龄雏鸡20只的双侧颞骨，冰浴中剥离全部膜迷路组织。提取液分别为pH7.4的含0.1% 十二烷基硫酸钠(SDS)的0.01 mol/L PBS及单纯PBS，豚鼠为8耳加至1 ml，鸡为40耳加至1 ml。经匀浆、反复冻融、离心，上清液即为豚鼠MLP样品(G-MLP)和鸡MLP样品(Ch-MLP)，蛋白浓度约2 mg/ml，包括含SDS样品(G-SDS和Ch-SDS)及不含SDS样品(G-PBS和Ch-PBS)。
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十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳与电转移：不连续垂直板胶系统，3%浓缩胶，5%～20%线性梯度分离胶。样品处理液为1 mmol/L Tris-HCl缓冲液,pH6.8，含2%SDS,1%蔗糖，5%β-巯基乙醇及0.002%溴酚蓝。每孔加样30 μl，样品与处理液1∶1混合，100℃水浴1分钟。低分子量标准蛋白与处理液1∶2混合。浓缩电泳条件120V，1小时，分离条件180V，4小时。电转移条件150V，100 mA，3小时。将硝酸纤维素膜行氨基黑10B染色，酒精醋酸脱色液脱色。
图像分析：以摄像机将硝酸纤维素膜图像输入计算机进行分析。每样品柱以0.1282 mm间隔分析采样，采样总长65.5108 mm，共采样511点，得出灰度值曲线。每一灰度峰对应一条蛋白区带，根据标准分子量蛋白数据计算出各蛋白带对应分子量。蛋白带的蛋白含量以灰度峰的面积表示。
二、结果
G-MLP和Ch-MLP分别有30和34个灰度峰，结合表观图像(附图)，可将两种MLP分为12条主要的蛋白区带，以A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L标记，对应分子量G-MLP为134 000、98 000、82 000、65 000、56 000、48 000、40 000、33 000、30 000、26 000、21 000、19 000，Ch-MLP为134 000、96 000、82 000、64 000、53 000、45 000、40 000、33 000、30 000、27 000、21 000、18 000。
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Ch-MLP电泳分布偏向高分子量侧，A-G间的蛋白所占比例Ch-SDS为75%、Ch-PBS为71.9%。G-MLP在67 000以上含量甚微，D-J间的蛋白所占比例G-SDS为77.4%、G-PBS为71.8%。Ch-MLP与G-MLP的主要蛋白区带的分子量基本对应，只是含量有差别。在D-G间，两者的蛋白含量均很丰富，所占比例Ch-SDS为51.4%、Ch-PBS为42.5%、G-SDS为43.5%、G-PBS为42.7%。在D、G，E、H 区带，两者的对应分子量和蛋白含量较相近，并且在表观上很易分辩。两种MLP的含SDS的均比不含SDS的提取液获得的蛋白的含量高，并且不改变的主要蛋白区带的位置，其中G-MLP的A、D、K、L带及Ch-MLP的D带的蛋白含量保持不变。
三、讨论
本文结果显示豚鼠和鸡的MLP在电泳分布上具有许多相似特点，说明不同种属内耳组织间存在着相同的蛋白组成或认为存在着相同的蛋白抗原，表明以异种甚至禽类的MLP作为检测人血清抗内耳组织抗体的抗原是可行的。在检测结果判断时，对于两种MLP电泳分布上分子量对应或蛋白含量相近或表观图像相似的蛋白区带对应的反应，应高度重视。由于两种MLP的D带，对不同的样品处理液，均能保持蛋白含量的不变，说明D带具有一定程度稳定特性，这一特性可以为载于NC膜上的内耳抗原制备，及免疫印迹法检测抗内耳抗体的结果判断提供参照。
附图 NC膜上的MLP电泳表观图象。1、6为G-SDS，2、7为G-PBS，3、8为Ch-PBS。5为标准分子量蛋白，从上至下，五条蛋白带代表的分子量为94 000、67 000、43 000、30 000、17 500
(收稿：1997-05-23 修回：1997-11-11), http://www.100md.com