线粒体基因突变与氨基糖甙类抗生素耳毒性
作者：柯肖枚 戚豫 顾之平 张正国 张伍玲 姜苏敏 刘洁芬
单位：100034 北京医科大学第一医院耳鼻咽喉科(柯肖枚、顾之平)，儿科(戚豫)；中国医学科学院基础所(张正国、张伍玲)；北京市儿音医院耳鼻咽喉科(姜苏敏)；北京市第一聋校(刘洁芬)
关键词：
近年来文献已报道氨基糖甙类抗生素大剂量使用普遍存在对前庭和耳蜗功能的损害 近年来文献已报道氨基糖甙类抗生素大剂量使用普遍存在对前庭和耳蜗功能的损害，小剂量呈现耳毒易感性的遗传因素[1]，并发现氨基糖甙类抗生素致聋(aminoglycoside antibiotic induce deafness，AAID) 家系成员的线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)基因上特异的突变位点[2]。为探讨该病的发病机理，我们对7个AAID家系进行了mtDNA分析。
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一、资料与方法
研究对象：易感家系组7个AAID家系中42个成员；对照A组30例健康人；对照B组30例有氨基糖甙类抗生素用药史的听力正常人。26例用药后立即发生听力下降9例，2个月内发生4例，2个月后缓慢发生或进行性加重9例，本人叙述不清2例，未感听力下降2例。受试者用药均为常规剂量。26例用药时间：<7d 16例，7～30d 9例，>30d 1例。对照B组用药时间：<30d 15例，≥30d 15例。
研究方法：①听功能和前庭功能检查：研究对象均行纯音听阈测试，9例链霉素致聋患者接受了前庭功能检查(冷水试验)；②DNA提取：按常规法提取受试者外周血DNA；③引物和多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)反应引物及反应条件：(H链)5’-CTA AAA CCC CTA CGC ATT TAT ATA G-3’，(L链)5’-GCT TTG TGT TAA GCT ACA CTC TGG-
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作者单位：100034 北京医科大学第一医院耳鼻咽喉科 (柯肖枚、顾之平)，儿科(戚豫)；中国医学科学院基础所(张正国、张伍玲)；北京市儿童医院耳鼻咽喉科(姜苏敏)；北京市第一聋校(刘洁芬)
3’，由北京赛百盛公司合成；25 μL反应体积中，1.5 mmol/L MgCl2，250 μmol/L dNTP，引物各75 pmole；94℃变性5 min后，94℃30 s、58℃30 s、72℃40 s循环35次，72℃延长10 min，产物为100 bp(1525～1624)；④ 限制酶切鉴定：Alw26I(BsmAI的同功酶)酶切PCR产物，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染显色。
二、结果
1.易感家系42例中26例为双侧对称感音神经性聋。耳聋程度：轻度5例，中度4例，中重度7例，重度及极重度10例。听力曲线：下降型17例，低频岛状1例，平坦型5例，槽型3例。9例冷水试验中双侧前庭功能正常7例，双侧低下2例。
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2. Alw26Ⅰ酶切分析：未突变产物，酶切产生80 bp和20 bp两个条带。如发生1555A→G点突变，该酶切位点消失，仅出现100 bp 1个条带。本组3个家系中9例酶切后仅见100 bp 1个条带，表明mtDNA 12S rRNA基因第1555位核苷酸A→G同质性点突变。其他4个家系30个成员，对照A、B 组60个成员均出现2个条带，即无1555突变。
三、讨论
mtDNA 1555A→G突变是在3个AAID家系中9个成员均存在的突变。3个家系均为典型母系遗传方式。对照A和B组中都不具有该位点突变。表明mtDNA 1555突变是氨基糖甙类抗生素耳毒性的病理突变，是遗传易感性的分子学基础。
氨基糖甙类抗生素耳毒性的发生是遗传因素与环境因素促使共同作用的结果。mtDNA 1555突变只造成机体对氨基糖甙类抗生素的易感性，如没有该药进入机体，该个体仅是突变基因的携带者。因此临床医师应严格掌握氨基糖甙类抗生素的用药指征，用药前开展遗传咨询，作基因诊断，严禁对易感个体及其母系成员使用该药，有效地预防AAID的发生。
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AAID的26例中，16例用药时间<7d，仅1例达1个月。而对照B组15/30例连续治疗≥1月，但均听力正常。提示家族性氨基糖甙类抗生素耳毒性应解释为基因的易感性，而不是单纯药物剂量的作用。此外易感家系组有9/26例的AAID患者听力下降为缓慢发生或进行性加重，也支持氨基糖甙类抗生素耳毒性是基因易感的看法[3]。7/9例链霉素致聋患者前庭功能正常。听力损害不伴随前庭功能异常的结果提示：AAID患者是遗传易感，和由剂量过大引起耳蜗功能丧失不同。
另外4个AAID家系mtDNA不具有1555突变，表明其他基因突变也与氨基糖甙类抗生素耳毒性遗传易感有关的可能性，提出mtDNA15555突变不是AAID的唯一机理，尚待进一步研究证实。
参考文献
1Fishel-Ghodsion N, Prezant TR,Bu XD,et al. Mitochondrial ribosomal RNA gene mutation in a patient with sporadic minoglycoside ototoxicity. Am J Otolaryngol,1993,14:399-403.
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2Prezant TR, Agapian JV, Bohlman MC, et al. Mitochondrial ribosomal RNA mutation associated with both antibiotic-induced and non-syndromic deafness. Nat Genet,1993,4:289-294.
3Fishel-Ghodsion N,Prezant TR,Chaltraw WE,et al.Mitochondrial Gene Mutation is a significant predisposing factor in aminoglycoside ototoxicity.Am J Otolaryngol,1997,18:173-178.
(收稿：1998-01-15 修回：1998-04-28)
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关键词：
近年来文献已报道氨基糖甙类抗生素大剂量使用普遍存在对前庭和耳蜗功能的损害 近年来文献已报道氨基糖甙类抗生素大剂量使用普遍存在对前庭和耳蜗功能的损害，小剂量呈现耳毒易感性的遗传因素[1]，并发现氨基糖甙类抗生素致聋(aminoglycoside antibiotic induce deafness，AAID) 家系成员的线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)基因上特异的突变位点[2]。为探讨该病的发病机理，我们对7个AAID家系进行了mtDNA分析。
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一、资料与方法
研究对象：易感家系组7个AAID家系中42个成员；对照A组30例健康人；对照B组30例有氨基糖甙类抗生素用药史的听力正常人。26例用药后立即发生听力下降9例，2个月内发生4例，2个月后缓慢发生或进行性加重9例，本人叙述不清2例，未感听力下降2例。受试者用药均为常规剂量。26例用药时间：<7d 16例，7～30d 9例，>30d 1例。对照B组用药时间：<30d 15例，≥30d 15例。
研究方法：①听功能和前庭功能检查：研究对象均行纯音听阈测试，9例链霉素致聋患者接受了前庭功能检查(冷水试验)；②DNA提取：按常规法提取受试者外周血DNA；③引物和多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)反应引物及反应条件：(H链)5’-CTA AAA CCC CTA CGC ATT TAT ATA G-3’，(L链)5’-GCT TTG TGT TAA GCT ACA CTC TGG-
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作者单位：100034 北京医科大学第一医院耳鼻咽喉科 (柯肖枚、顾之平)，儿科(戚豫)；中国医学科学院基础所(张正国、张伍玲)；北京市儿童医院耳鼻咽喉科(姜苏敏)；北京市第一聋校(刘洁芬)
3’，由北京赛百盛公司合成；25 μL反应体积中，1.5 mmol/L MgCl2，250 μmol/L dNTP，引物各75 pmole；94℃变性5 min后，94℃30 s、58℃30 s、72℃40 s循环35次，72℃延长10 min，产物为100 bp(1525～1624)；④ 限制酶切鉴定：Alw26I(BsmAI的同功酶)酶切PCR产物，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染显色。
二、结果
1.易感家系42例中26例为双侧对称感音神经性聋。耳聋程度：轻度5例，中度4例，中重度7例，重度及极重度10例。听力曲线：下降型17例，低频岛状1例，平坦型5例，槽型3例。9例冷水试验中双侧前庭功能正常7例，双侧低下2例。
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2. Alw26Ⅰ酶切分析：未突变产物，酶切产生80 bp和20 bp两个条带。如发生1555A→G点突变，该酶切位点消失，仅出现100 bp 1个条带。本组3个家系中9例酶切后仅见100 bp 1个条带，表明mtDNA 12S rRNA基因第1555位核苷酸A→G同质性点突变。其他4个家系30个成员，对照A、B 组60个成员均出现2个条带，即无1555突变。
三、讨论
mtDNA 1555A→G突变是在3个AAID家系中9个成员均存在的突变。3个家系均为典型母系遗传方式。对照A和B组中都不具有该位点突变。表明mtDNA 1555突变是氨基糖甙类抗生素耳毒性的病理突变，是遗传易感性的分子学基础。
氨基糖甙类抗生素耳毒性的发生是遗传因素与环境因素促使共同作用的结果。mtDNA 1555突变只造成机体对氨基糖甙类抗生素的易感性，如没有该药进入机体，该个体仅是突变基因的携带者。因此临床医师应严格掌握氨基糖甙类抗生素的用药指征，用药前开展遗传咨询，作基因诊断，严禁对易感个体及其母系成员使用该药，有效地预防AAID的发生。
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AAID的26例中，16例用药时间<7d，仅1例达1个月。而对照B组15/30例连续治疗≥1月，但均听力正常。提示家族性氨基糖甙类抗生素耳毒性应解释为基因的易感性，而不是单纯药物剂量的作用。此外易感家系组有9/26例的AAID患者听力下降为缓慢发生或进行性加重，也支持氨基糖甙类抗生素耳毒性是基因易感的看法[3]。7/9例链霉素致聋患者前庭功能正常。听力损害不伴随前庭功能异常的结果提示：AAID患者是遗传易感，和由剂量过大引起耳蜗功能丧失不同。
另外4个AAID家系mtDNA不具有1555突变，表明其他基因突变也与氨基糖甙类抗生素耳毒性遗传易感有关的可能性，提出mtDNA15555突变不是AAID的唯一机理，尚待进一步研究证实。
参考文献
1Fishel-Ghodsion N, Prezant TR,Bu XD,et al. Mitochondrial ribosomal RNA gene mutation in a patient with sporadic minoglycoside ototoxicity. Am J Otolaryngol,1993,14:399-403.
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2Prezant TR, Agapian JV, Bohlman MC, et al. Mitochondrial ribosomal RNA mutation associated with both antibiotic-induced and non-syndromic deafness. Nat Genet,1993,4:289-294.
3Fishel-Ghodsion N,Prezant TR,Chaltraw WE,et al.Mitochondrial Gene Mutation is a significant predisposing factor in aminoglycoside ototoxicity.Am J Otolaryngol,1997,18:173-178.
(收稿：1998-01-15 修回：1998-04-28)
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