Myc基因家族在喉癌中的异常扩增及其意义
作者：全成实 郭晓峰
单位：130021 长春 白求恩医科大学第一临床学院耳鼻咽喉-头颈外科
关键词：喉肿瘤；；基因；Myc；；肿瘤转移；；扩增
中华耳鼻咽喉科杂志980506 【摘要】 目的 探讨Myc 基因家族在喉癌中的异常扩增及其临床意义。方法 应用PCR-非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳-激光扫描技术检测了32例喉癌组织、12 例癌旁组织和6例正常组织。结果正常组织细胞Myc基因无扩增，32 例喉癌中47%(15/32)有C-myc和L-myc扩增，41%( 13/32)有N-myc基因扩增。Myc基因扩增率与年龄、性别、喉癌临床分期及分化程度无关(P>0.05)，但有淋巴结转移的患者的N-myc 扩增率明显高于无淋巴结转移者(P<0.01)。结论 Myc基因3个成员异常扩增是喉癌发生的原因之一，N-myc扩增在喉癌淋巴结转移过程中可能起正性调控作用。
, 百拇医药
Analysis of Myc gene family in laryngeal cancer Quan Chengshi, Guo Xiaofeng. Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery,First Teaching Hospital, Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021
【Abstract】 Objective To study the abnormal amplification and role of Myc gene family in the development of laryngeal cancer. Method A PCR-PAGE-Laser scanning technique was applied. Results There was no Myc gene amplification in the nomal laryngeal tissues.The abnormal L-myc and C-myc gene were positive in 47%(15/32) of laryngeal cancers and 41%(13/32) of the cancers shown the N-myc gene amplification.Myc gene amplification was not related to age,sex and differentiation (P>0.05),but the N-myc amplification was higher in patients with lymph node metastesis (P<0.05). Conclusion The N-myc amplificatin may play a role of positive regulation in the lymph metastasis of laryngeal cancer.The abnormal amplification of Myc gene family is one of the causes in development of laryngeal cancer.
, 百拇医药
【Key words】 Laryngeal neoplasms Genes, myc Neoplasm metastasis Amplification
已证明在肿瘤细胞中有Myc 基因扩增或异常表达[1,2]， 但不同肿瘤组织和癌细胞系中Myc 基因家族成员在扩增或表达方面存在差异，有些仅是单一Myc基因扩增， 而有些组织呈现2种Myc扩增，或Myc 与其它癌基因共同扩增。本实验建立了一种可同时检测Myc 基因家族3个成员的PCR-聚丙烯酰胺凝胶电泳-激光扫描技术，旨在研究Myc家族3个成员扩增与喉癌的临床分期、病理分级等关系。
材料与方法
一、材料
1.标本：32例喉癌组织及12 例癌旁组织取自我校附属第一、二及三临床学院耳鼻咽喉-头颈外科1989年以来住院患者，3 例正常喉组织取自我科同期住院的非癌症患者，3 例正常白细胞取自我院化验室非肿瘤患者血。所有标本均经病理证实。32例喉癌中男20例，女12例， 年龄42～69岁。TNM分期按UICC 1987 年分级标准：Ⅰ期4例，Ⅱ期10例，Ⅲ期14例，Ⅳ期4例。声门上型26例，声门型6例。根据组织病理分化程度分为高、中、 低分化癌。随访时间为5年以上，术后1年、2年、3年和5年的生存率分别为：91%(29/32)、80%(23/29)、61%(14/23)和57%(8/14)。其中6例失访,失访者按死亡计算。
, 百拇医药
2.PCR引物：
5'-CCCAGCGAGACATCTGGAAGAA-3'
5'-GAGAAGCCGCTCCACATGCAGTC-3'
扩增Myc基因家族的3个成员，即C-myc(244bp)、N-myc(230bp)、L-myc(227bp)，上海复旦大学遗传所合成。
3.试剂： Taq DNA 聚合酶、 dNTP(Promega公司)，蛋白酶K(Merke公司)，硝酸银(沈阳市试剂二厂)，Marker PUC 18质粒DNAHaeⅢ酶切片段(Sigma公司)。
二、方法
1.模板DNA提取:参照文献[3]进行。
, 百拇医药
2.PCR扩增：PCR扩增总反应体积50 μl 。应用模板DNA50 ng， 在 DNA 扩增仪器(Perkin Elmer Cetus) 上操作，循环周期为94℃1 min，55℃1 min，72℃2 min，30个循环后，补加72℃7 min。取5 μl PCR产物于琼脂糖凝胶上电泳，观察PCR扩增产物。
3.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤：取PCR产物5 μl加1 μl上样缓冲液(0.25% 溴酚蓝，0.25%二甲苯箐FF，40%蔗糖水溶液)后备用。制备8%非变性聚丙烯酰胺凝胶，灌注于20 cm×20 cm×0.1 cm垂直电泳槽中， 待凝胶聚合后加样，用1×TBE缓冲液作电极缓冲液，室温下电泳1W约14 h。电泳后的凝胶经硝酸银染色(硝酸银0.5 g，250 ml)后，用显色液(NaOH7.5 g，38%甲醛1.9 ml，加dH2O至 250 ml) 显出棕黑色DNA区带时，将凝胶移置停影液(冰醋酸12.5 ml，加dH2O至250 ml)中停影，最后用固定液( 乙醇12.5 ml，冰醋酸1.25 ml，加dH2O至250 ml)固定。
, 百拇医药
结果
由于中性聚丙烯酰胺电泳对DNA的分离特性，电泳带显示3条(附图)。第1条带为L-myc(227bp)，第2条带为N-myc(230bp)，第 3 条为C-myc(244bp)。将凝胶片直接在激光扫描仪上进行扫描，得出3条带的峰面积值，用各自的峰面积值除以各自的碱基数作为该基因的基因单拷贝数，将L-myc、N-myc和C-myc 3者中最小的单拷贝数设定为1，比较其它2个基因的相对倍数。正常喉组织细胞L-myc、N-myc、C-myc比例均值为1.0∶2.2∶3.8。
附图 PCR聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。1，2为正常喉组织；3～8为喉癌组织
32例喉癌中 47%( 15/32)有L-myc和C-myc基因的扩增，41%(13/32)有N-myc的扩增，喉癌旁组织L-myc、N-myc及C-myc 的扩增率分别是40%、25%及25%(表1)。癌组织中16%有L-myc和N-myc同时扩增，26%有N-myc和C-myc同时扩增，6%有L-myc和C-myc同时扩增。淋巴结转移者中75%(6/8)有C-myc扩增，100%(8/8)有N-myc扩增，50%(4/8)有L-myc扩增。 不同分化程度喉癌中Myc 基因扩增情况见表2。Myc基因扩增率与年龄、性别、临床分期及分化程度无关(P>0.05)，但有淋巴结转移的患者的N-myc 扩增率明显高于无淋巴结转移者(Fisher精确概率P=0.000122)。表1 不同喉组织中Myc基因扩增情况(例数) 组织
, 百拇医药
检查例数
L-myc
N-myc
C-myc
+
-
+
-
+
-
癌组织
32
15
, 百拇医药 17
13
19
15
17
癌旁组织
12
5
7
3
9
3
9
正常组织
, 百拇医药
6
0
6
0
6
0
6
合计
50
20
30
16
34
18
, http://www.100md.com
32
似然比
χ2
6.764
5.961
7.609
P
0.034*
0.051*
0.022*
+有扩增 -无扩增表2 喉癌病理分化程度与Myc基因扩增(例数) 分类
, 百拇医药
检查例数
L-myc
N-myc
C-myc
+
-
+
-
+
-
低分化
7
4
3
, 百拇医药
5
2
5
2
中分化
21
9
12
7
14
8
13
高分化
4
, 百拇医药
2
2
1
3
2
2
合计
32
15
17
13
19
15
17
, 百拇医药
似然比
χ2
0.448
3.6217
2.405
P
0.799
0.165
0.3004
+有扩增 -无扩增讨论
Myc 基因是较早发现的一组癌基因，包括C-myc、N-myc及L-myc。从发现Myc基因开始就认识到Myc 基因与细胞的生长发育和分化有密切的关系。Myc 基因属于编码核蛋白的癌基因，其产物是在细胞核内通过与DNA 结合而发挥作用。Myc 基因家族中的3 个成员对肿瘤形成及在肿瘤类型方面存在差异。 目前认为C-myc 的扩增与肿瘤发生与转归密切相关，N-myc的扩增对肿瘤的预后判断有意义，L-myc扩增与肿瘤的易患性和预后在不同的肿瘤中表现不一样。研究结果表明， 人类大多数恶性肿瘤中常有Myc基因的改变，而良性肿瘤或高分化的恶性肿瘤常无或很少检测到 Myc 基因的扩增。Barrios等[4]用Southern杂交研究了7 例骨肉瘤，其中4例有C-myc扩增，但在3 例良性大细胞骨瘤中没有发现C-myc扩增。Hashimoto等[5]研究了13例神经母细胞瘤和5 例神经节神经细胞瘤，11例肿瘤组织有N-myc基因扩增，其中9例发生在低分化的细胞中。我们对32例喉癌检测Myc基因的结果提示，喉癌中有N-myc 扩增患者易发生转移，预后不良，与国外对其它类型肿瘤Myc 基因的研究结果相似[5,6]。并发现有Myc基因家族2 个成员同时扩增的情况，我们将其与组织分化程度、淋巴结转移等进行分析，发现没有统计学意义。这种同时扩增在肿瘤发生发展过程中起何作用，或有何种意义目前知之甚少，有待于做更深层次的研究。
, http://www.100md.com
总之，对Myc基因家族3个成员在细胞分化和肿瘤细胞形成(包括喉癌)中各自的作用机理知道不多。本研究建立的PCR-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，简便、经济、无放射性同位素污染，可同时检测Myc 基因家族的三个成员的扩增情况，为肿瘤发生过程中分别研究其作用机理，提供了实验手段，而N-myc 扩增的检测对于预测淋巴结转移的出现趋势、临床预后评估及治疗有参考作用和一定的实用价值。
参考文献
1 Hiyama E, Hiyama K，Yokoyama F, et al. Neuroblastoma with DNA amplification and rearrangement in the N-myc gene region. Cancer Res，1991,51:1946-1951.
2 Mai S. Overexpression of C-myc precedes amplification of the gene encoding dihydrofolate reductase. Gene,1994,148:253-260.
, 百拇医药
3 郑永晨. PCR检测技术中模板DNA的简易快速提取法. 白求恩医科大学学报,1993,19:407-408.
4 Barrios C, Castresana JS, Falkmer UG, et al. C-myc oncogene amplification and cytometric DNA ploidy pattern as prognostic factors in musculoskeletal neoplasms. Int J Cancer, 1994,58:781-786 .
5 Hashimoto H, Daimaru Y, Enjoji M, et al. N-myc gene product expression in neuroblastoma. J Clin Pathol, 1989,42:52-55.
6 Yokoyama T, Tsukahara T, Nakagawa C, et al. The N-myc gene product in primary retinoblastomas. Cancer, 1989,63:2134-2138.
(收稿:1998-01-13 修回: 1998-06-07), 百拇医药
单位：130021 长春 白求恩医科大学第一临床学院耳鼻咽喉-头颈外科
关键词：喉肿瘤；；基因；Myc；；肿瘤转移；；扩增
中华耳鼻咽喉科杂志980506 【摘要】 目的 探讨Myc 基因家族在喉癌中的异常扩增及其临床意义。方法 应用PCR-非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳-激光扫描技术检测了32例喉癌组织、12 例癌旁组织和6例正常组织。结果正常组织细胞Myc基因无扩增，32 例喉癌中47%(15/32)有C-myc和L-myc扩增，41%( 13/32)有N-myc基因扩增。Myc基因扩增率与年龄、性别、喉癌临床分期及分化程度无关(P>0.05)，但有淋巴结转移的患者的N-myc 扩增率明显高于无淋巴结转移者(P<0.01)。结论 Myc基因3个成员异常扩增是喉癌发生的原因之一，N-myc扩增在喉癌淋巴结转移过程中可能起正性调控作用。
, 百拇医药
Analysis of Myc gene family in laryngeal cancer Quan Chengshi, Guo Xiaofeng. Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery,First Teaching Hospital, Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021
【Abstract】 Objective To study the abnormal amplification and role of Myc gene family in the development of laryngeal cancer. Method A PCR-PAGE-Laser scanning technique was applied. Results There was no Myc gene amplification in the nomal laryngeal tissues.The abnormal L-myc and C-myc gene were positive in 47%(15/32) of laryngeal cancers and 41%(13/32) of the cancers shown the N-myc gene amplification.Myc gene amplification was not related to age,sex and differentiation (P>0.05),but the N-myc amplification was higher in patients with lymph node metastesis (P<0.05). Conclusion The N-myc amplificatin may play a role of positive regulation in the lymph metastasis of laryngeal cancer.The abnormal amplification of Myc gene family is one of the causes in development of laryngeal cancer.
, 百拇医药
【Key words】 Laryngeal neoplasms Genes, myc Neoplasm metastasis Amplification
已证明在肿瘤细胞中有Myc 基因扩增或异常表达[1,2]， 但不同肿瘤组织和癌细胞系中Myc 基因家族成员在扩增或表达方面存在差异，有些仅是单一Myc基因扩增， 而有些组织呈现2种Myc扩增，或Myc 与其它癌基因共同扩增。本实验建立了一种可同时检测Myc 基因家族3个成员的PCR-聚丙烯酰胺凝胶电泳-激光扫描技术，旨在研究Myc家族3个成员扩增与喉癌的临床分期、病理分级等关系。
材料与方法
一、材料
1.标本：32例喉癌组织及12 例癌旁组织取自我校附属第一、二及三临床学院耳鼻咽喉-头颈外科1989年以来住院患者，3 例正常喉组织取自我科同期住院的非癌症患者，3 例正常白细胞取自我院化验室非肿瘤患者血。所有标本均经病理证实。32例喉癌中男20例，女12例， 年龄42～69岁。TNM分期按UICC 1987 年分级标准：Ⅰ期4例，Ⅱ期10例，Ⅲ期14例，Ⅳ期4例。声门上型26例，声门型6例。根据组织病理分化程度分为高、中、 低分化癌。随访时间为5年以上，术后1年、2年、3年和5年的生存率分别为：91%(29/32)、80%(23/29)、61%(14/23)和57%(8/14)。其中6例失访,失访者按死亡计算。
, 百拇医药
2.PCR引物：
5'-CCCAGCGAGACATCTGGAAGAA-3'
5'-GAGAAGCCGCTCCACATGCAGTC-3'
扩增Myc基因家族的3个成员，即C-myc(244bp)、N-myc(230bp)、L-myc(227bp)，上海复旦大学遗传所合成。
3.试剂： Taq DNA 聚合酶、 dNTP(Promega公司)，蛋白酶K(Merke公司)，硝酸银(沈阳市试剂二厂)，Marker PUC 18质粒DNAHaeⅢ酶切片段(Sigma公司)。
二、方法
1.模板DNA提取:参照文献[3]进行。
, 百拇医药
2.PCR扩增：PCR扩增总反应体积50 μl 。应用模板DNA50 ng， 在 DNA 扩增仪器(Perkin Elmer Cetus) 上操作，循环周期为94℃1 min，55℃1 min，72℃2 min，30个循环后，补加72℃7 min。取5 μl PCR产物于琼脂糖凝胶上电泳，观察PCR扩增产物。
3.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤：取PCR产物5 μl加1 μl上样缓冲液(0.25% 溴酚蓝，0.25%二甲苯箐FF，40%蔗糖水溶液)后备用。制备8%非变性聚丙烯酰胺凝胶，灌注于20 cm×20 cm×0.1 cm垂直电泳槽中， 待凝胶聚合后加样，用1×TBE缓冲液作电极缓冲液，室温下电泳1W约14 h。电泳后的凝胶经硝酸银染色(硝酸银0.5 g，250 ml)后，用显色液(NaOH7.5 g，38%甲醛1.9 ml，加dH2O至 250 ml) 显出棕黑色DNA区带时，将凝胶移置停影液(冰醋酸12.5 ml，加dH2O至250 ml)中停影，最后用固定液( 乙醇12.5 ml，冰醋酸1.25 ml，加dH2O至250 ml)固定。
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结果
由于中性聚丙烯酰胺电泳对DNA的分离特性，电泳带显示3条(附图)。第1条带为L-myc(227bp)，第2条带为N-myc(230bp)，第 3 条为C-myc(244bp)。将凝胶片直接在激光扫描仪上进行扫描，得出3条带的峰面积值，用各自的峰面积值除以各自的碱基数作为该基因的基因单拷贝数，将L-myc、N-myc和C-myc 3者中最小的单拷贝数设定为1，比较其它2个基因的相对倍数。正常喉组织细胞L-myc、N-myc、C-myc比例均值为1.0∶2.2∶3.8。
附图 PCR聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。1，2为正常喉组织；3～8为喉癌组织
32例喉癌中 47%( 15/32)有L-myc和C-myc基因的扩增，41%(13/32)有N-myc的扩增，喉癌旁组织L-myc、N-myc及C-myc 的扩增率分别是40%、25%及25%(表1)。癌组织中16%有L-myc和N-myc同时扩增，26%有N-myc和C-myc同时扩增，6%有L-myc和C-myc同时扩增。淋巴结转移者中75%(6/8)有C-myc扩增，100%(8/8)有N-myc扩增，50%(4/8)有L-myc扩增。 不同分化程度喉癌中Myc 基因扩增情况见表2。Myc基因扩增率与年龄、性别、临床分期及分化程度无关(P>0.05)，但有淋巴结转移的患者的N-myc 扩增率明显高于无淋巴结转移者(Fisher精确概率P=0.000122)。表1 不同喉组织中Myc基因扩增情况(例数) 组织
, 百拇医药
检查例数
L-myc
N-myc
C-myc
+
-
+
-
+
-
癌组织
32
15
, 百拇医药 17
13
19
15
17
癌旁组织
12
5
7
3
9
3
9
正常组织
, 百拇医药
6
0
6
0
6
0
6
合计
50
20
30
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似然比
χ2
6.764
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P
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0.051*
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+有扩增 -无扩增表2 喉癌病理分化程度与Myc基因扩增(例数) 分类
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检查例数
L-myc
N-myc
C-myc
+
-
+
-
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-
低分化
7
4
3
, 百拇医药
5
2
5
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中分化
21
9
12
7
14
8
13
高分化
4
, 百拇医药
2
2
1
3
2
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合计
32
15
17
13
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χ2
0.448
3.6217
2.405
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0.799
0.165
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+有扩增 -无扩增讨论
Myc 基因是较早发现的一组癌基因，包括C-myc、N-myc及L-myc。从发现Myc基因开始就认识到Myc 基因与细胞的生长发育和分化有密切的关系。Myc 基因属于编码核蛋白的癌基因，其产物是在细胞核内通过与DNA 结合而发挥作用。Myc 基因家族中的3 个成员对肿瘤形成及在肿瘤类型方面存在差异。 目前认为C-myc 的扩增与肿瘤发生与转归密切相关，N-myc的扩增对肿瘤的预后判断有意义，L-myc扩增与肿瘤的易患性和预后在不同的肿瘤中表现不一样。研究结果表明， 人类大多数恶性肿瘤中常有Myc基因的改变，而良性肿瘤或高分化的恶性肿瘤常无或很少检测到 Myc 基因的扩增。Barrios等[4]用Southern杂交研究了7 例骨肉瘤，其中4例有C-myc扩增，但在3 例良性大细胞骨瘤中没有发现C-myc扩增。Hashimoto等[5]研究了13例神经母细胞瘤和5 例神经节神经细胞瘤，11例肿瘤组织有N-myc基因扩增，其中9例发生在低分化的细胞中。我们对32例喉癌检测Myc基因的结果提示，喉癌中有N-myc 扩增患者易发生转移，预后不良，与国外对其它类型肿瘤Myc 基因的研究结果相似[5,6]。并发现有Myc基因家族2 个成员同时扩增的情况，我们将其与组织分化程度、淋巴结转移等进行分析，发现没有统计学意义。这种同时扩增在肿瘤发生发展过程中起何作用，或有何种意义目前知之甚少，有待于做更深层次的研究。
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总之，对Myc基因家族3个成员在细胞分化和肿瘤细胞形成(包括喉癌)中各自的作用机理知道不多。本研究建立的PCR-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，简便、经济、无放射性同位素污染，可同时检测Myc 基因家族的三个成员的扩增情况，为肿瘤发生过程中分别研究其作用机理，提供了实验手段，而N-myc 扩增的检测对于预测淋巴结转移的出现趋势、临床预后评估及治疗有参考作用和一定的实用价值。
参考文献
1 Hiyama E, Hiyama K，Yokoyama F, et al. Neuroblastoma with DNA amplification and rearrangement in the N-myc gene region. Cancer Res，1991,51:1946-1951.
2 Mai S. Overexpression of C-myc precedes amplification of the gene encoding dihydrofolate reductase. Gene,1994,148:253-260.
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3 郑永晨. PCR检测技术中模板DNA的简易快速提取法. 白求恩医科大学学报,1993,19:407-408.
4 Barrios C, Castresana JS, Falkmer UG, et al. C-myc oncogene amplification and cytometric DNA ploidy pattern as prognostic factors in musculoskeletal neoplasms. Int J Cancer, 1994,58:781-786 .
5 Hashimoto H, Daimaru Y, Enjoji M, et al. N-myc gene product expression in neuroblastoma. J Clin Pathol, 1989,42:52-55.
6 Yokoyama T, Tsukahara T, Nakagawa C, et al. The N-myc gene product in primary retinoblastomas. Cancer, 1989,63:2134-2138.
(收稿:1998-01-13 修回: 1998-06-07), 百拇医药