小白鼠前庭毛细胞再生研究
作者：敖华飞 王正敏 穆美云
单位：200031 上海医科大学附属眼耳鼻喉科医院
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志980521 本实验以小白鼠为对象，利用组织培养的方法，观测新霉素对前庭毛细胞破坏的超微结构特征及毛细胞数定量分析，探讨培养条件下毛细胞破坏后能否再生及再生细胞的形态特征及时间过程。
一、材料和方法
1. 取材：生后15 d的昆明鼠60只，雌雄兼用，上海医科大学实验动物中心提供。动物断头，75%乙醇中浸5 min，置冷Hank液的培养皿中，于解剖显微镜下，分离耳蜗，打开前庭，取出椭圆囊，打开顶部，移去耳石膜。
2. 组织培养：培养皿底涂鼠尾胶，培养液2 ml(Medium-199+10%胎牛血清)，每皿3个培养物，置37℃ 5% CO2培养箱中培养。实验组使用含1 mmol/L新霉素培养液2 ml，24 h后弃原培养液，用无新霉素的Medium-199液漂洗后用含10%胎牛血清的Medium-199培养液2 ml，置培养箱中培养，48 h更换一半培养液。100个标本分别培养1、2、3、4(各15个标本)和5、20 d(各20个标本)。对照组不使用新霉素，20个标本培养20 d。
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3. 电镜观察：分别按常规制作标本，在S-520型扫描电镜和JEM1200EX透射电镜下观察、摄片。
4. 统计学方法： 实验组5、20 d组微纹区的毛细胞数比较采用t检验。
二、结果
1. 形态学的变化：扫描电镜见正常毛细胞呈有序排列，由支持细胞分隔，I型毛细胞表面积大，静纤毛多而长，II型毛细胞表面积较小，静纤毛少、短；微纹区为穿越椭圆囊中央的毛细胞条带区，多为I型毛细胞，外周为I型与II型毛细胞相间排列。新霉素对毛细胞破坏以微纹区最严重，并向外扩展，24 h后见损伤毛细胞静纤毛紊乱、融合、倒伏、脱落，2 d的表皮板尚存留(图1)，5 d表皮板完全消失，由支持细胞所替代(图2)；细胞顶面扩大，布满微绒毛，该区毛细胞基本消失。20 d后毛细胞破坏区域，出现了丛状、表面积小的细短静纤毛或伴较长动纤毛的不成熟毛细胞(图3)，类似于发育期间的静纤毛束及鸟类毛细胞再生时静纤毛的表现，与II型毛细胞相似，该区I型毛细胞几乎不存在。透射电镜检查可见正常微纹区毛细胞静纤毛粗、长，微丝密度较高，表皮板厚，小根明显；再生毛细胞静纤毛细、短，微丝密度低，表皮板及小根不明显(图4)。
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2. 定量分析：正常培养20 d微纹区平均2000μm2毛细胞数为(59.3±2.7)个(
±s，下同)，大部分为I型毛细胞，平均(52.8±1.9)个，200 μm2 II型毛细胞为(6.5±1.1)个。实验组5 d与20 d微纹区毛细胞数分别为0.9±0.16(统计18个标本)和4.3±0.48(统计18个标本)，t检验，P<0.001。
三、讨论
本组实验对新霉素致椭圆囊微纹区静纤毛束的损伤及恢复进行观察。体外培养发现微纹区毛细胞在耳毒性药物作用后开始破坏、消失，5 d时损伤达到最大程度，该区毛细胞基本消失，20 d时，该区有新的不成熟静纤毛出现。新增的不成熟静纤毛的毛细胞是否为表面结构损伤的毛细胞经修复所致，而非再生结果？本组实验显示：耳毒药引起的损害表现退变的毛细胞体内有大量空泡形成，细胞间的紧密连接扩大，该过程先于静纤毛消失，提示毛细胞在静纤毛消失前已严重破坏，且只有在发育阶段的毛细胞才有修复静纤毛的能力。因此，新出现的呈现不成熟静纤毛的毛细胞非损伤毛细胞的修复所致，而是毛细胞再生。
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本组结果显示毛细胞破坏后为支持细胞所代替，以后出现新的毛细胞，提示支持细胞可能是再生毛细胞的前体细胞。有研究发现部分不成熟的毛细胞无3H标记，推测这些毛细胞是直接经支持细胞转化而来，而未经有丝分裂。本组实验显示毛细胞破坏区域由支持细胞占据，这些支持细胞是分裂增生或原有的无法证实。
图1 新霉素作用后2d组织培养的小白鼠椭圆囊微纹区扫描电镜相。紊乱、倒伏的静纤毛；↑融合的静纤毛；△存留表皮板。×4 000 图2 新霉素作用后5d组织培养的小白鼠椭圆囊微纹区扫描电镜相。表皮板消失，支持细胞顶面扩大(S)，毛细胞消失。×4 000 图3 新霉素作用后组织培养20d的小白鼠椭圆囊微纹区扫描电镜相。再生毛细胞(△)有不成熟的静纤毛。×2 000 图4 透射电镜观察。a正常细胞微丝密度高，表皮板厚，有小根(↑)；b再生毛细胞微丝密度低，表皮板及小根不明显(▲)×5 000 (收稿：1998-02-25 修回1998-07-17), 百拇医药
单位：200031 上海医科大学附属眼耳鼻喉科医院
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志980521 本实验以小白鼠为对象，利用组织培养的方法，观测新霉素对前庭毛细胞破坏的超微结构特征及毛细胞数定量分析，探讨培养条件下毛细胞破坏后能否再生及再生细胞的形态特征及时间过程。
一、材料和方法
1. 取材：生后15 d的昆明鼠60只，雌雄兼用，上海医科大学实验动物中心提供。动物断头，75%乙醇中浸5 min，置冷Hank液的培养皿中，于解剖显微镜下，分离耳蜗，打开前庭，取出椭圆囊，打开顶部，移去耳石膜。
2. 组织培养：培养皿底涂鼠尾胶，培养液2 ml(Medium-199+10%胎牛血清)，每皿3个培养物，置37℃ 5% CO2培养箱中培养。实验组使用含1 mmol/L新霉素培养液2 ml，24 h后弃原培养液，用无新霉素的Medium-199液漂洗后用含10%胎牛血清的Medium-199培养液2 ml，置培养箱中培养，48 h更换一半培养液。100个标本分别培养1、2、3、4(各15个标本)和5、20 d(各20个标本)。对照组不使用新霉素，20个标本培养20 d。
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3. 电镜观察：分别按常规制作标本，在S-520型扫描电镜和JEM1200EX透射电镜下观察、摄片。
4. 统计学方法： 实验组5、20 d组微纹区的毛细胞数比较采用t检验。
二、结果
1. 形态学的变化：扫描电镜见正常毛细胞呈有序排列，由支持细胞分隔，I型毛细胞表面积大，静纤毛多而长，II型毛细胞表面积较小，静纤毛少、短；微纹区为穿越椭圆囊中央的毛细胞条带区，多为I型毛细胞，外周为I型与II型毛细胞相间排列。新霉素对毛细胞破坏以微纹区最严重，并向外扩展，24 h后见损伤毛细胞静纤毛紊乱、融合、倒伏、脱落，2 d的表皮板尚存留(图1)，5 d表皮板完全消失，由支持细胞所替代(图2)；细胞顶面扩大，布满微绒毛，该区毛细胞基本消失。20 d后毛细胞破坏区域，出现了丛状、表面积小的细短静纤毛或伴较长动纤毛的不成熟毛细胞(图3)，类似于发育期间的静纤毛束及鸟类毛细胞再生时静纤毛的表现，与II型毛细胞相似，该区I型毛细胞几乎不存在。透射电镜检查可见正常微纹区毛细胞静纤毛粗、长，微丝密度较高，表皮板厚，小根明显；再生毛细胞静纤毛细、短，微丝密度低，表皮板及小根不明显(图4)。
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2. 定量分析：正常培养20 d微纹区平均2000μm2毛细胞数为(59.3±2.7)个(
±s，下同)，大部分为I型毛细胞，平均(52.8±1.9)个，200 μm2 II型毛细胞为(6.5±1.1)个。实验组5 d与20 d微纹区毛细胞数分别为0.9±0.16(统计18个标本)和4.3±0.48(统计18个标本)，t检验，P<0.001。三、讨论
本组实验对新霉素致椭圆囊微纹区静纤毛束的损伤及恢复进行观察。体外培养发现微纹区毛细胞在耳毒性药物作用后开始破坏、消失，5 d时损伤达到最大程度，该区毛细胞基本消失，20 d时，该区有新的不成熟静纤毛出现。新增的不成熟静纤毛的毛细胞是否为表面结构损伤的毛细胞经修复所致，而非再生结果？本组实验显示：耳毒药引起的损害表现退变的毛细胞体内有大量空泡形成，细胞间的紧密连接扩大，该过程先于静纤毛消失，提示毛细胞在静纤毛消失前已严重破坏，且只有在发育阶段的毛细胞才有修复静纤毛的能力。因此，新出现的呈现不成熟静纤毛的毛细胞非损伤毛细胞的修复所致，而是毛细胞再生。
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本组结果显示毛细胞破坏后为支持细胞所代替，以后出现新的毛细胞，提示支持细胞可能是再生毛细胞的前体细胞。有研究发现部分不成熟的毛细胞无3H标记，推测这些毛细胞是直接经支持细胞转化而来，而未经有丝分裂。本组实验显示毛细胞破坏区域由支持细胞占据，这些支持细胞是分裂增生或原有的无法证实。
图1 新霉素作用后2d组织培养的小白鼠椭圆囊微纹区扫描电镜相。紊乱、倒伏的静纤毛；↑融合的静纤毛；△存留表皮板。×4 000 图2 新霉素作用后5d组织培养的小白鼠椭圆囊微纹区扫描电镜相。表皮板消失，支持细胞顶面扩大(S)，毛细胞消失。×4 000 图3 新霉素作用后组织培养20d的小白鼠椭圆囊微纹区扫描电镜相。再生毛细胞(△)有不成熟的静纤毛。×2 000 图4 透射电镜观察。a正常细胞微丝密度高，表皮板厚，有小根(↑)；b再生毛细胞微丝密度低，表皮板及小根不明显(▲)×5 000 (收稿：1998-02-25 修回1998-07-17), 百拇医药