豚鼠耳蜗微动脉自律运动的连续观察及分析
作者：史晓瑞 董明敏 姜泗长 董民声 修瑞娟
单位：450052 郑州 河南医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科[史晓瑞(现在100039 北京 武警总医院耳鼻咽喉科)、董明敏、董民声]；解放军总医院耳鼻咽喉科(姜泗长)；中国医学科学院微循环研究所(修瑞娟)
关键词：耳蜗；；小动脉；；精氨酸；；图像处理；计算机辅助
中华耳鼻咽喉科杂志980510 【摘要】 目的 探讨耳蜗微动脉自律运动的频率特性、收缩特性的特征参数。 方法 采用微循环数字图像检测和分析方法，根据微动脉管径动态变化的跟踪测量结果，利用快速富里叶频谱转换进行定量分析。结果 正常状态下耳蜗微动脉存在运动幅度较小的自律运动， 自律运动的频率为(0.021±0.002) Hz，振幅为(0.37±0.11) μm，管径变化范围为(12.29±1.90) μm～(10.41±3.03) μm，平均管径为(11.20±2.70) μm，收缩指数为0.42±0.17。静脉注入L-精氨酸后，耳蜗微动脉的血管运动被激活，在给药10 min时振幅达(0.84±0.01) μm，频率增加为(0.068±0.002) Hz，与用药前相比有显著的统计学意义。结论 正常耳蜗微动脉存在运动幅度较小的自律运动，L-精氨酸能显著增加微动脉自律运动的频率及振幅，增强了耳蜗微循环的功能，使耳蜗血流量增加。
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A specific property of microvasomotion in the guinea pig cochlea Shi Xiaorui*, Dong Mingmin, Jiang Sichang, et al.*First Affiliated Hospital of Henan Medical University, Zhengzhou 450052
【Abstract】 Objective To investigate specific property of vasomotion in cochlear microvessels and its response to the endothelium-derived relaxation factor (EDRF). Methods The dynamic changes of cochlea microvessels were observed using intravital microscopy and measured by the microcirculatory image processing system. The frequency and amplitude of vasomotion were analyzed with fast Fourier transform (FFT) according to the diameter changes. Results the vasomotion of cochlear arteriole with a small amplitude existed in normal condition. The diameter changed from (10.41±3.03)μm to (12.29±1.9)μm with a mean value of (11.2±2.7)μm. The specific property of vasomotion was characterized by a frequency (0.021±0.002)Hz and amplitude of (0.37±0.11)μm. The contraction index was determined as 0.42±0.17. The vasomotion was significantly enhanced after the administration of EDRF. Conclusion The vasomotion existed in the cochlea and EDRF can increase the cochlear blood flow by improving the vasomotion.
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【Key Words】 Cochlea Arterioles Arginine Image processing,computer-assisted
近年来的研究表明：微动脉的自动节律运动具有固有的频率，与心脏的搏动节律无相关关系[1]。微动脉具有的自组织特性(vasomotion)，以独特的方式，驱动着微动脉内的血流灌注末梢的组织细胞，这种“海涛式(wavelike)”灌注对末梢组织具有极为重要的生理意义[1]。以往人们对身体其它部位微循环的运动了解较多，但对内耳微循环的自身特点、变化规律和动态过程的研究较少涉足。本研究利用耳蜗微循环数字图像检测和分析方法，根据微动脉管径动态变化的自动跟踪测量结果，对其自律运动的频率特性及收缩特性的特征参数进行了定量分析，并从生物流体力学的原理出发，探讨了耳蜗微动脉运动的基本特征及L-精氨酸的合成产物内皮依赖性舒张因子(endothelium-derived relaxation factor，EDRF)对微动脉自律运动的影响。
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材料和方法
一、实验步骤
实验选用雌、雄豚鼠7只，体重350～400 g。 豚鼠腹腔注射安定5 mg/kg， 15 min后肌肉注射枸缘酸芬太尼0.32 mg/kg。待动物麻醉后行气管切开、插管，以保持呼吸道通畅。保持体温(38.1±2.0)℃，头固定，暴露一侧颈内静脉以备注药，分离一侧颈总动脉行动脉插管，监测试验过程中血压的变化。腹侧进路，暴露耳蜗，采用胡博华等[2]建立的改良耳蜗开窗法，在耳蜗第3回小心、细致地划沟，使成0.3 mm×0.5 mm的方形观察窗口。在正常状态下，对窗口区域录像2 min，作为正常对照组，然后静脉注入浓度230 mmol/L的L-精氨酸(L-arginine，北京化学试剂商店提供，批号:940902) 100 mg/kg (速度120 μL/min)，分别在给药后5、10、20和30 min时录像2 min，用于分析L-精氨酸对微动脉自律运动的影响。
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二、血液动力学各指标监测与数据分析
1.应用微循环数字图像测量系统(Olympas BH2,日本)，对管径进行自动跟踪检测。首先沿微动脉的垂直面，设置一条测量线，横跨血管两侧壁。然后同步自动跟踪测量两点的管径，数据采集频率为1Hz，得到管径变化的波形曲线。根据管径变化的测量结果，采用快速富里叶频谱转换法，统计2 min录像中自律运动的平均频率、振幅[1]，由此反应自律运动的频率特性。
2.红细胞流速采用“飞点法”(flying spot method)[2]进行测试。
3.根据管径测量结果，计算血管收缩指数(CI)，反应微动脉的舒缩活性幅度变化程度，其计算方法如下：CI＝(b2-c2)/b2，其中b为最大舒张管径，c为收缩管径。
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4.用公式Q=V(D2P)/4，计算容积血流速度(Q)，其中V为红细胞流速，D为血管半径，P为脉压差。实验结果采用自身对照配对t检验，对用药前后所测数据进行统计分析。
结果
一、豚鼠正常耳蜗外侧壁微动脉自律运动的特征
耳蜗外侧壁由不同类型的血管组成，本实验主要测量从前庭阶到血管纹的放射状微动脉。用药前该动脉的最大管径为(12.29±1.90)μm(
±s，n=7，下同)，最小管径为(10.41±3.03)μm，平均管径为(11.20±2.70)μm ；自律运动的频率为(0.021±0.002)Hz，振幅为(0.37±0.11)μm， 收缩指数平均为0.42±0.17。
二、用药前后微动脉自律运动
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在静脉注入L-精氨酸前，由于麻醉药对微动脉自律运动的抑制作用及耳蜗独特的弹簧线圈样结构，血管的自律运动非常小。注药5 min后，微动脉的自律运动被激活，10 min时血管运动的振幅平均达(0.84±0.01)μm，频率为(0.068±0.002)Hz，大约30 min恢复正常。图1示3号动物自律运动的变化图谱。a为注入药前微动脉的自律运动。b为L-精氨酸注入后10～12 min时微动脉测试点的自律运动的动态变化。7只动物在注药后10～12 min时间段自律运动的振幅与频率的平均值与注药前相比差异有显著性(t1=3.11，t2=3.09，P<0.05)。
图1 注药前后耳蜗外侧壁微动脉自律运动的动态变化及频谱分析
二、血管收缩指数的变化
正常状态下耳蜗微动脉收缩指数比较小(0.42±0.17)。在用药5～7 min收缩指数增加至0.57±0.08；用药10～12 min为0.77±0.12，与用药前相比差异有显著性(t=2.98，P<0.05)；用药20～22 min为0.67±0.12，30～33 min为0.48±0.14。
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三、红细胞流速的变化
用药前红细胞流速为(162.0±7.6)μm/min，注射L-精氨酸后红细胞流速明显增加，并在观察时间内保持快速水平。注药10～12 min的增加最为显著，达(237.6±40.3)μm/min，与用药前相比差异有极显著性(t=4.01，P<0.01)。用药后5～7 min 红细胞流速为(177.1±12.4)μm/min, 20～22 min为(230.0±41.9)μm/min，与注药前相比差异也有显著性(t=3.01，P<0.05)。用药后30～33 min流速为(199.8±23.5)μm/min。
四、血流量的变化
注射L-精氨酸5 min后血流量即增加，并在10和20 min时保持较高水平。以注药前血流量为100%，10～12 min和20～22 min血流量分别增加了45%和29%(图2)，与注药前比较，差异有显著性意义(t=3.02，P<0.05)。
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图2 注药前后血流量的变化
讨论
一、耳蜗外侧壁微动脉自律运动的特点
一般认为血流经过极度弯曲的耳蜗血管后，血流变得缓慢而平稳，对保持耳蜗敏感度有独特的生理意义[3]。1994年Ren等[4]利用激光多普勒测试耳蜗血流时发现，当血压降底到一定幅度时，激光多普勒测试信号出现单摆样运动，推测血压下降到一定程度时，可能会引起血管壁的肌源性收缩与松弛，起到调节内耳血流灌注的作用。但是，由于激光多普勒测试反映的是耳蜗外侧壁血管一定范围内的血流变化，而不能准确地测定特定血管血流及管径的直接变化，因此，该方法有一定的局限性。鉴于此，本实验采用计算机图像血管管径自动跟踪测量分析技术，直接对耳蜗微动脉管径微小幅度变化进行测量。实验结果表明，在正常状态下耳蜗末梢微动脉存在幅度较小的自动节律运动。一些学者认为这种运动可能源于微动脉管壁平滑肌细胞的自动周期性的电活动[1]。
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二、L-精氨酸对耳蜗外侧壁自律运动的影响
在体内血管壁平滑肌细胞能利用L-精氨酸快速的合成EDRF， 调节和改善局部微循环的灌注状态[5]。L-精氨酸所合成的EDRF是否也作用于耳蜗微动脉的自律运动？本实验结果表明：L-精氨酸能明显激活处于抑制状态的耳蜗微动脉自律运动，并且显著的加强微动脉血管的功能。用药前耳蜗微动脉的自律运动处于低频、低幅状态，用药5 min后微动脉的自律运动被激活，平均振幅、频率、收缩指数均增加，尤以用药10～12 min时微动脉的自律运动增强最为明显。随着自律运动的增强，微动脉的血液流速增快，单位截面积血流量也增加，用药10 min后与用药前相比两者差异均有极显著性(P<0.01)。分析L-精氨酸激活耳蜗血管运动的机制：可能是由于给予外源性L-精氨酸后，使体内的EDRF合成量增加，而EDRF能使cGMP(cyclic 3'，5'-guanosine monophosphate，环磷酸鸟苷)依赖性蛋白激酶激活，发挥其扩张血管的生物效应。血管的扩张使得血流对管壁的作用力发生变化，内皮细胞感知局部张力及剪切应力的变化，可能导致平滑肌细胞的放电频率增加及周期性血管的运动增强[1]。这种频率、振幅增加的血管运动，相当于微泵，加速了血液的流动，流速的增加也使单位面积通过的血液量增加；使血液冲向末稍，灌注、滋养组织。
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单纯靠心脏的泵压力可能很难将血液输送耳蜗迂曲而致密的末梢微循环网，耳蜗微动脉的自律运动起到第二心脏的作用，它以独特的频率驱动着微动脉的血流去灌注末梢的组织。L-精氨酸作为内源性硝基血管扩张剂，不仅使微动脉扩张，而且显著的激活微动脉的自律运动而增加局部血流的灌注。以上实验是我们对耳蜗微动脉自律运动特性的初步探讨，有关其它改善耳蜗微循环的药物在调节耳蜗血流时，是否也是直接增强耳蜗微动脉的这种自律运动，有待于进一步探讨。
参考文献
1 修瑞娟，Intaglietta M. 微血管自律运动的研究.中华医学杂志，1985,65:129-135.
2 胡博华，姜泗长，顾瑞. 爆震后不同时间豚鼠微循环的变化.中华创伤杂志, 1991，26：6-9.
3 Quirk WS, Dengernk HA, Coleman JK,et al. Cochlear blood flow autoregulaton in Wistar-Kyoto eats. Hear Res, 1989,41:53-60.
, 百拇医药
4 Ren TY, Nuttall AL, Miller JM. Provoked flux motion of cochlear blood flow measured with laser Doppler flowmetry in guinea pig. Acta Otolaryngol， 1993,113: 609-614.
5 Kelm M,Feelisch M,Deussen A,et al. Release of endothelium derived nitric oxide in relation to pressure and flow.Cardiovasc Res,1991,25:831-836.
(收稿：1998-01-14 修回：1998-06-20), 百拇医药
单位：450052 郑州 河南医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科[史晓瑞(现在100039 北京 武警总医院耳鼻咽喉科)、董明敏、董民声]；解放军总医院耳鼻咽喉科(姜泗长)；中国医学科学院微循环研究所(修瑞娟)
关键词：耳蜗；；小动脉；；精氨酸；；图像处理；计算机辅助
中华耳鼻咽喉科杂志980510 【摘要】 目的 探讨耳蜗微动脉自律运动的频率特性、收缩特性的特征参数。 方法 采用微循环数字图像检测和分析方法，根据微动脉管径动态变化的跟踪测量结果，利用快速富里叶频谱转换进行定量分析。结果 正常状态下耳蜗微动脉存在运动幅度较小的自律运动， 自律运动的频率为(0.021±0.002) Hz，振幅为(0.37±0.11) μm，管径变化范围为(12.29±1.90) μm～(10.41±3.03) μm，平均管径为(11.20±2.70) μm，收缩指数为0.42±0.17。静脉注入L-精氨酸后，耳蜗微动脉的血管运动被激活，在给药10 min时振幅达(0.84±0.01) μm，频率增加为(0.068±0.002) Hz，与用药前相比有显著的统计学意义。结论 正常耳蜗微动脉存在运动幅度较小的自律运动，L-精氨酸能显著增加微动脉自律运动的频率及振幅，增强了耳蜗微循环的功能，使耳蜗血流量增加。
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A specific property of microvasomotion in the guinea pig cochlea Shi Xiaorui*, Dong Mingmin, Jiang Sichang, et al.*First Affiliated Hospital of Henan Medical University, Zhengzhou 450052
【Abstract】 Objective To investigate specific property of vasomotion in cochlear microvessels and its response to the endothelium-derived relaxation factor (EDRF). Methods The dynamic changes of cochlea microvessels were observed using intravital microscopy and measured by the microcirculatory image processing system. The frequency and amplitude of vasomotion were analyzed with fast Fourier transform (FFT) according to the diameter changes. Results the vasomotion of cochlear arteriole with a small amplitude existed in normal condition. The diameter changed from (10.41±3.03)μm to (12.29±1.9)μm with a mean value of (11.2±2.7)μm. The specific property of vasomotion was characterized by a frequency (0.021±0.002)Hz and amplitude of (0.37±0.11)μm. The contraction index was determined as 0.42±0.17. The vasomotion was significantly enhanced after the administration of EDRF. Conclusion The vasomotion existed in the cochlea and EDRF can increase the cochlear blood flow by improving the vasomotion.
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【Key Words】 Cochlea Arterioles Arginine Image processing,computer-assisted
近年来的研究表明：微动脉的自动节律运动具有固有的频率，与心脏的搏动节律无相关关系[1]。微动脉具有的自组织特性(vasomotion)，以独特的方式，驱动着微动脉内的血流灌注末梢的组织细胞，这种“海涛式(wavelike)”灌注对末梢组织具有极为重要的生理意义[1]。以往人们对身体其它部位微循环的运动了解较多，但对内耳微循环的自身特点、变化规律和动态过程的研究较少涉足。本研究利用耳蜗微循环数字图像检测和分析方法，根据微动脉管径动态变化的自动跟踪测量结果，对其自律运动的频率特性及收缩特性的特征参数进行了定量分析，并从生物流体力学的原理出发，探讨了耳蜗微动脉运动的基本特征及L-精氨酸的合成产物内皮依赖性舒张因子(endothelium-derived relaxation factor，EDRF)对微动脉自律运动的影响。
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材料和方法
一、实验步骤
实验选用雌、雄豚鼠7只，体重350～400 g。 豚鼠腹腔注射安定5 mg/kg， 15 min后肌肉注射枸缘酸芬太尼0.32 mg/kg。待动物麻醉后行气管切开、插管，以保持呼吸道通畅。保持体温(38.1±2.0)℃，头固定，暴露一侧颈内静脉以备注药，分离一侧颈总动脉行动脉插管，监测试验过程中血压的变化。腹侧进路，暴露耳蜗，采用胡博华等[2]建立的改良耳蜗开窗法，在耳蜗第3回小心、细致地划沟，使成0.3 mm×0.5 mm的方形观察窗口。在正常状态下，对窗口区域录像2 min，作为正常对照组，然后静脉注入浓度230 mmol/L的L-精氨酸(L-arginine，北京化学试剂商店提供，批号:940902) 100 mg/kg (速度120 μL/min)，分别在给药后5、10、20和30 min时录像2 min，用于分析L-精氨酸对微动脉自律运动的影响。
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二、血液动力学各指标监测与数据分析
1.应用微循环数字图像测量系统(Olympas BH2,日本)，对管径进行自动跟踪检测。首先沿微动脉的垂直面，设置一条测量线，横跨血管两侧壁。然后同步自动跟踪测量两点的管径，数据采集频率为1Hz，得到管径变化的波形曲线。根据管径变化的测量结果，采用快速富里叶频谱转换法，统计2 min录像中自律运动的平均频率、振幅[1]，由此反应自律运动的频率特性。
2.红细胞流速采用“飞点法”(flying spot method)[2]进行测试。
3.根据管径测量结果，计算血管收缩指数(CI)，反应微动脉的舒缩活性幅度变化程度，其计算方法如下：CI＝(b2-c2)/b2，其中b为最大舒张管径，c为收缩管径。
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4.用公式Q=V(D2P)/4，计算容积血流速度(Q)，其中V为红细胞流速，D为血管半径，P为脉压差。实验结果采用自身对照配对t检验，对用药前后所测数据进行统计分析。
结果
一、豚鼠正常耳蜗外侧壁微动脉自律运动的特征
耳蜗外侧壁由不同类型的血管组成，本实验主要测量从前庭阶到血管纹的放射状微动脉。用药前该动脉的最大管径为(12.29±1.90)μm(
±s，n=7，下同)，最小管径为(10.41±3.03)μm，平均管径为(11.20±2.70)μm ；自律运动的频率为(0.021±0.002)Hz，振幅为(0.37±0.11)μm， 收缩指数平均为0.42±0.17。二、用药前后微动脉自律运动
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在静脉注入L-精氨酸前，由于麻醉药对微动脉自律运动的抑制作用及耳蜗独特的弹簧线圈样结构，血管的自律运动非常小。注药5 min后，微动脉的自律运动被激活，10 min时血管运动的振幅平均达(0.84±0.01)μm，频率为(0.068±0.002)Hz，大约30 min恢复正常。图1示3号动物自律运动的变化图谱。a为注入药前微动脉的自律运动。b为L-精氨酸注入后10～12 min时微动脉测试点的自律运动的动态变化。7只动物在注药后10～12 min时间段自律运动的振幅与频率的平均值与注药前相比差异有显著性(t1=3.11，t2=3.09，P<0.05)。
图1 注药前后耳蜗外侧壁微动脉自律运动的动态变化及频谱分析
二、血管收缩指数的变化
正常状态下耳蜗微动脉收缩指数比较小(0.42±0.17)。在用药5～7 min收缩指数增加至0.57±0.08；用药10～12 min为0.77±0.12，与用药前相比差异有显著性(t=2.98，P<0.05)；用药20～22 min为0.67±0.12，30～33 min为0.48±0.14。
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三、红细胞流速的变化
用药前红细胞流速为(162.0±7.6)μm/min，注射L-精氨酸后红细胞流速明显增加，并在观察时间内保持快速水平。注药10～12 min的增加最为显著，达(237.6±40.3)μm/min，与用药前相比差异有极显著性(t=4.01，P<0.01)。用药后5～7 min 红细胞流速为(177.1±12.4)μm/min, 20～22 min为(230.0±41.9)μm/min，与注药前相比差异也有显著性(t=3.01，P<0.05)。用药后30～33 min流速为(199.8±23.5)μm/min。
四、血流量的变化
注射L-精氨酸5 min后血流量即增加，并在10和20 min时保持较高水平。以注药前血流量为100%，10～12 min和20～22 min血流量分别增加了45%和29%(图2)，与注药前比较，差异有显著性意义(t=3.02，P<0.05)。
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图2 注药前后血流量的变化
讨论
一、耳蜗外侧壁微动脉自律运动的特点
一般认为血流经过极度弯曲的耳蜗血管后，血流变得缓慢而平稳，对保持耳蜗敏感度有独特的生理意义[3]。1994年Ren等[4]利用激光多普勒测试耳蜗血流时发现，当血压降底到一定幅度时，激光多普勒测试信号出现单摆样运动，推测血压下降到一定程度时，可能会引起血管壁的肌源性收缩与松弛，起到调节内耳血流灌注的作用。但是，由于激光多普勒测试反映的是耳蜗外侧壁血管一定范围内的血流变化，而不能准确地测定特定血管血流及管径的直接变化，因此，该方法有一定的局限性。鉴于此，本实验采用计算机图像血管管径自动跟踪测量分析技术，直接对耳蜗微动脉管径微小幅度变化进行测量。实验结果表明，在正常状态下耳蜗末梢微动脉存在幅度较小的自动节律运动。一些学者认为这种运动可能源于微动脉管壁平滑肌细胞的自动周期性的电活动[1]。
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二、L-精氨酸对耳蜗外侧壁自律运动的影响
在体内血管壁平滑肌细胞能利用L-精氨酸快速的合成EDRF， 调节和改善局部微循环的灌注状态[5]。L-精氨酸所合成的EDRF是否也作用于耳蜗微动脉的自律运动？本实验结果表明：L-精氨酸能明显激活处于抑制状态的耳蜗微动脉自律运动，并且显著的加强微动脉血管的功能。用药前耳蜗微动脉的自律运动处于低频、低幅状态，用药5 min后微动脉的自律运动被激活，平均振幅、频率、收缩指数均增加，尤以用药10～12 min时微动脉的自律运动增强最为明显。随着自律运动的增强，微动脉的血液流速增快，单位截面积血流量也增加，用药10 min后与用药前相比两者差异均有极显著性(P<0.01)。分析L-精氨酸激活耳蜗血管运动的机制：可能是由于给予外源性L-精氨酸后，使体内的EDRF合成量增加，而EDRF能使cGMP(cyclic 3'，5'-guanosine monophosphate，环磷酸鸟苷)依赖性蛋白激酶激活，发挥其扩张血管的生物效应。血管的扩张使得血流对管壁的作用力发生变化，内皮细胞感知局部张力及剪切应力的变化，可能导致平滑肌细胞的放电频率增加及周期性血管的运动增强[1]。这种频率、振幅增加的血管运动，相当于微泵，加速了血液的流动，流速的增加也使单位面积通过的血液量增加；使血液冲向末稍，灌注、滋养组织。
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单纯靠心脏的泵压力可能很难将血液输送耳蜗迂曲而致密的末梢微循环网，耳蜗微动脉的自律运动起到第二心脏的作用，它以独特的频率驱动着微动脉的血流去灌注末梢的组织。L-精氨酸作为内源性硝基血管扩张剂，不仅使微动脉扩张，而且显著的激活微动脉的自律运动而增加局部血流的灌注。以上实验是我们对耳蜗微动脉自律运动特性的初步探讨，有关其它改善耳蜗微循环的药物在调节耳蜗血流时，是否也是直接增强耳蜗微动脉的这种自律运动，有待于进一步探讨。
参考文献
1 修瑞娟，Intaglietta M. 微血管自律运动的研究.中华医学杂志，1985,65:129-135.
2 胡博华，姜泗长，顾瑞. 爆震后不同时间豚鼠微循环的变化.中华创伤杂志, 1991，26：6-9.
3 Quirk WS, Dengernk HA, Coleman JK,et al. Cochlear blood flow autoregulaton in Wistar-Kyoto eats. Hear Res, 1989,41:53-60.
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4 Ren TY, Nuttall AL, Miller JM. Provoked flux motion of cochlear blood flow measured with laser Doppler flowmetry in guinea pig. Acta Otolaryngol， 1993,113: 609-614.
5 Kelm M,Feelisch M,Deussen A,et al. Release of endothelium derived nitric oxide in relation to pressure and flow.Cardiovasc Res,1991,25:831-836.
(收稿：1998-01-14 修回：1998-06-20), 百拇医药