晚期喉癌边缘DNA含量和增殖细胞核抗原表达
作者：王斌全 夏立军 石秋英
单位：030001 太原 山西医科大学第一医院耳鼻咽喉科
关键词：喉肿瘤；DNA；增殖细胞核抗原；切缘
中华耳鼻咽喉科杂志980614 【摘要】 目的 探讨晚期喉癌边缘DNA含量和增殖细胞核抗原(PCNA)表达与喉癌手术预后的关系。方法 通过PCNA表达和DNA含量检测，对34例晚期喉癌边缘进行观察。结果 肿瘤边缘1.0、0.5、0 cm处粘膜，PCNA指数分别为8.62%、17.76%和50.32%。DNA指数分别为0.98、1.082和1.436。统计学分析，1.0、0.5 cm处粘膜与0 cm处粘膜差异有显著性(P<0.01)。结论 中、重度非典型增生的上皮在分裂，增殖等生物学行为方面已与轻度非典型增生和单纯性增生的上皮细胞不同，手术切缘应在中度非典型性增生的粘膜上皮以外，即0.5 cm以外。
, 百拇医药
DNA content，expression of proliferating cell nuclear antigen and surgical margins in locally advanced laryngeal cancer
Wang Binquan, Xia Lijun, Shi Qiuying. First Affiliated Hospital, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001
【Abstract】 Objective To probe into the relationship between DNA content,PCNA and prognosis. Methods Surgical margins in 34 patients with locally advanced laryngeal cancers were observed by means of antibody to PCNA and DNA content measurements. Results The results demonstrated that at neoplasm margins of 1.0,0.5,and 0cm, PCNA indices were 8.62%, 17.76% and 50.32% and DNA indices were 0.98 , 1.082 and 1.436 respectively. There is a significant difference between 1.0, 0.5 and 0cm. Conclusion Moderate and severe atypical hyperplasia of epithelium (AHE) was different from mild AHE and simple hyperplasia of epitheliun in the biologic behavior of fission,proliferation and so on and surgical margins should be kept outside the area of moderate AHE.
, 百拇医药
【Key words】 Laryngeal neoplasms DNA Proliferating cell nuclear antigen Surgical margins
晚期喉癌手术局部复发是部分患者治疗失败以致死亡的主要原因。手术切缘阳性局部复发率达到20～80%[1]，怎样才能既获得阴性手术切缘，又尽可能保留正常粘膜，以利于重建喉的生理功能，一直是头颈外科医师探讨的问题之一。通过检测晚期喉癌边缘的增殖细胞核抗原(PCNA)和DNA含量，希望为今后确定晚期喉癌手术治疗的切缘提供客观依据。
材料和方法
一、临床资料
患者来源1990年元月～1995年元月我科收治的晚期喉癌，共34例，其中男性31例，女性3例，平均年龄61.9岁(范围42～81岁)。术前常规行纤维喉镜、CT检查。术前病理诊断：鳞状上皮细胞癌，TNM分期按UICC1987年标准，T3 23例(N0M0 7例，N1 M0 11例，N2 M0 4例，N3 M0 1例)，T4期11例(N0M03例，N1M07例，N2M0 1例)，肿瘤位置：声门上型14例，声门型19例，声门下型1例。手术类型：3/4喉切除术14例、喉大部切除术9例、喉全切除术11例。颈淋巴结清扫术27例。病理组织学分级：Ⅰ级7例、Ⅱ级19例、Ⅲ级8例。手术中我们按照常规0.5 cm手术切缘切除，并经病理证实为阴性切缘。术后随访：第1年每3个月1次，第2年每6个月1次，以后每年1次。
, 百拇医药
二、实验标本的采集及处理
标本均在手术后立即取材并固定于10%福尔马林液中，石蜡包埋。取材部位：A:肿瘤与粘膜交界处(即0 cm处); B:距离肿瘤0.5 cm处; C: 距离肿瘤1.0 cm、1.5 cm处。 每个部位不同位置取2～3块，将每个部位蜡块各切取40～50 μm厚切片数片用于DNA含量测定，切取5 μm厚片数片供HE染色及免疫组化染色。
三、DNA含量测定
取40～50 um厚石蜡切片脱蜡，经梯度乙醇至蒸镏水，0.5%胃蛋白酶消化30 min，过滤，离心。加入荧光素吡啶碘(PI)染色10 min，采用FACS流式细胞仪(B.D公司)测定，美国BECTON DICKINSON公司提供DNA专用软件分析处理，并制出DNA直方图，以正常淋巴细胞作为二倍体确定其倍体，计算DNA指数(DI)。
DI＝样品的G0 、G1峰平均道/正常细胞G0、G1 峰道数
, 百拇医药
DI＝1.0±0.1为DNA二倍体，其余均为异倍体。
四、免疫组化法
PCNA染色ABC法按文献常规操作[2]。
第一抗体鼠抗人PCNA单克隆抗体PL-10(Dako公司产品。互作稀释度1∶50)，鼠系ABC药盒为Vector Lab产品，DAB为Sinma公司产品。结果判断及统计细胞核染成棕黄色者PCNA阳性细胞，胞核染成蓝色者为PCNA阴性细胞。用盲法选取有代表性的区域高倍视野计数1 000个细胞，PCNA阳性细胞数，即PCNA指数(PI)：
PI＝(PCNA阳性细胞数/1000个细胞)×100%
PCNA高表达非典型增生在肿瘤边缘0.2 cm之内。
, 百拇医药 五、统计学处理
用SAS统计分析软件，对所测得的数据进行分析。作t检验比较差异的显著性。
结果
一、随访情况
34例患者，完成3年以上随访31例。随访患者中1年内局部复发6例，第二年内局部复发2例，死亡6例，失访2例，失访者按死亡计算。1例62岁伴有冠心病，1年后因心肌梗塞死亡。本组晚期喉癌3年生存率71.0%(22/31)。
二、DNA含量(DI)测定
喉癌边缘不同部位DNA指数如下(
±s): 0 cm处为1.436±0.145, 0.5 cm处为 1.082±0.09, 1.0 cm处为 0.98±0.03。
, 百拇医药
对0.5 cm处DNA含量大于1.10的9例患者，经随访证实，术后4例出现复发，其余22例患者术后4例出现肿瘤复发。7例中4例病理组织学分级为3级，3例2级。
统计学处理：喉癌边缘0.5 cm、1.0 cm处粘膜与0 cm处粘膜DNA指数差异有显著性(P<0.01)，0.5 cm处粘膜与1.0 cm处粘膜，DNA指数差异无显著性(P>0.05)。
三、PCNA阳性细胞分布特征
PCNA主要为棕黄色颗粒，定位于细胞核及核仁，胞浆无色。
在肿瘤边缘1.5 cm处，粘膜上皮从单纯增生过渡到基本正常结构，PCNA阳性细胞数量较少，散在分布于上皮基底细胞层。
在肿瘤边缘1.0 cm处粘膜上皮层次增多，排列极向稍乱，核轻中度异常，可见棘细胞层，和角质层增厚的单纯增生改变，PCNA阳性细胞稍增多，可见棘细胞层，有PCNA阳性细胞分布, PCNA指数为8.62±0.78(±s, %下同)。
, 百拇医药
在肿瘤边缘0.5 cm处粘膜上皮，细胞增大，层次增多，排列极向稍乱，核中度异常少见病理核分裂，呈中度非典型增生改变，无间质浸润，PCNA阳性细胞数目增多，层次增加，可见棘细胞层和角质层出现PCNA阳性分布, PCNA指数为17.76±0.23。
在肿瘤边缘0～0.2 cm处，粘膜上皮表现为癌组织，重度非典型增生阶级，PCNA阳性细胞，呈明显阳性表达，全层可见，数目明显增多, PCNA指数为50.32±2.25。
我们对0.5 cm处PCNA指数≥26%的11例患者进行随访，11例患者5例局部复发(45.45%),其余20例有3例(15.00%)。
统计学处理：喉癌边缘1.0 cm、0.5 cm处粘膜与0 cm处粘膜，其PCNA指数差异有显著性(P<0.01)。
讨论
, 百拇医药
传统观点认为：单纯性增生及轻度非典型增生在反复损伤，慢性炎症过程中常可见到，这种变化是可逆的，其恶变率很低，中度非典型增生可发展为重度非典型增生，重度非典型增生则有高度恶变的危险。因此，只有重度非典型才视为癌前病变。本实验从光镜观察，认为肿瘤边缘0.5 cm以内粘膜呈重度、或中度非典型增生，0.5～1 cm呈轻度非典型增生或单纯性增生，大于1.0 cm呈单纯性增生或正常粘膜。
喉癌边缘PCNA、DNA检测表明，1.0 cm、0.5 cm处粘膜与0 cm处粘膜之间细胞的增殖活性存在显著性差异，这证明中、重度非典型增生的上皮细胞在分裂，增殖等生物学行为方面已与轻度非典型增生和单纯性增生不同。我们认为中度非典型增生粘膜应在切除范围之内。单纯依靠形态学很难早期确定交界性病变及非典型病变中的恶性潜能。此外，形态学所采用的非典型增生的分界不能充分反映病变的发展阶级，应用流式细胞术(FCM)可以对这类疾病的诊断提供帮助。有研究表明，在组织形态确定为恶性病变前2年，即可测到DNA的异倍体。研究还显示[3,4]，在喉、食管、口腔等粘膜上皮发生非典型增生病变时，FCM具有预测病变发展及确定早期恶变的意义。我们的观察符合上述研究观点，随着肿瘤边缘靠近癌组织，DI逐渐增加。
, 百拇医药
通过对肿瘤边缘PCNA观察及DNA含量测定我们认为手术切缘应在中度非典型增生的粘膜上皮以外，即0.5 cm以外。0.5 cm处PCNA≥26%和/或DI值大于1.10患者，有局部复发可能，应引起注意。
今后可以对不同类型、分期的喉癌进行探讨。
本课题为山西省自然科学基金项目(941049)
参考文献
1 王运钟.喉癌手术切缘的研究.国外医学耳鼻咽喉学分册，1993,17:13-16.
2 Hsu SM, Raine L, Farger H. Use of Avidin-Biotin peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlablled antibody (PAP) procedure. J Histochem Cytochem , 1981, 29:577-580.
, http://www.100md.com
3 Auffermann W ,Bocking A.Early detection of precancerous lesions in dysplasias , of the lung by , rapid DNA image cytometry. Anal Quant Cytol Histol,1985,7:218-223.
4 Bocking A. DNA measurements.In: GL Wied,ed. Comendium on qualiby assarance proficiency testing and work lod limitation in dinical cytology. Chicago: Tutorids of cytology,1985.170-175.
(收稿:1997-12-14 修回:1998-09-01), 百拇医药
单位：030001 太原 山西医科大学第一医院耳鼻咽喉科
关键词：喉肿瘤；DNA；增殖细胞核抗原；切缘
中华耳鼻咽喉科杂志980614 【摘要】 目的 探讨晚期喉癌边缘DNA含量和增殖细胞核抗原(PCNA)表达与喉癌手术预后的关系。方法 通过PCNA表达和DNA含量检测，对34例晚期喉癌边缘进行观察。结果 肿瘤边缘1.0、0.5、0 cm处粘膜，PCNA指数分别为8.62%、17.76%和50.32%。DNA指数分别为0.98、1.082和1.436。统计学分析，1.0、0.5 cm处粘膜与0 cm处粘膜差异有显著性(P<0.01)。结论 中、重度非典型增生的上皮在分裂，增殖等生物学行为方面已与轻度非典型增生和单纯性增生的上皮细胞不同，手术切缘应在中度非典型性增生的粘膜上皮以外，即0.5 cm以外。
, 百拇医药
DNA content，expression of proliferating cell nuclear antigen and surgical margins in locally advanced laryngeal cancer
Wang Binquan, Xia Lijun, Shi Qiuying. First Affiliated Hospital, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001
【Abstract】 Objective To probe into the relationship between DNA content,PCNA and prognosis. Methods Surgical margins in 34 patients with locally advanced laryngeal cancers were observed by means of antibody to PCNA and DNA content measurements. Results The results demonstrated that at neoplasm margins of 1.0,0.5,and 0cm, PCNA indices were 8.62%, 17.76% and 50.32% and DNA indices were 0.98 , 1.082 and 1.436 respectively. There is a significant difference between 1.0, 0.5 and 0cm. Conclusion Moderate and severe atypical hyperplasia of epithelium (AHE) was different from mild AHE and simple hyperplasia of epitheliun in the biologic behavior of fission,proliferation and so on and surgical margins should be kept outside the area of moderate AHE.
, 百拇医药
【Key words】 Laryngeal neoplasms DNA Proliferating cell nuclear antigen Surgical margins
晚期喉癌手术局部复发是部分患者治疗失败以致死亡的主要原因。手术切缘阳性局部复发率达到20～80%[1]，怎样才能既获得阴性手术切缘，又尽可能保留正常粘膜，以利于重建喉的生理功能，一直是头颈外科医师探讨的问题之一。通过检测晚期喉癌边缘的增殖细胞核抗原(PCNA)和DNA含量，希望为今后确定晚期喉癌手术治疗的切缘提供客观依据。
材料和方法
一、临床资料
患者来源1990年元月～1995年元月我科收治的晚期喉癌，共34例，其中男性31例，女性3例，平均年龄61.9岁(范围42～81岁)。术前常规行纤维喉镜、CT检查。术前病理诊断：鳞状上皮细胞癌，TNM分期按UICC1987年标准，T3 23例(N0M0 7例，N1 M0 11例，N2 M0 4例，N3 M0 1例)，T4期11例(N0M03例，N1M07例，N2M0 1例)，肿瘤位置：声门上型14例，声门型19例，声门下型1例。手术类型：3/4喉切除术14例、喉大部切除术9例、喉全切除术11例。颈淋巴结清扫术27例。病理组织学分级：Ⅰ级7例、Ⅱ级19例、Ⅲ级8例。手术中我们按照常规0.5 cm手术切缘切除，并经病理证实为阴性切缘。术后随访：第1年每3个月1次，第2年每6个月1次，以后每年1次。
, 百拇医药
二、实验标本的采集及处理
标本均在手术后立即取材并固定于10%福尔马林液中，石蜡包埋。取材部位：A:肿瘤与粘膜交界处(即0 cm处); B:距离肿瘤0.5 cm处; C: 距离肿瘤1.0 cm、1.5 cm处。 每个部位不同位置取2～3块，将每个部位蜡块各切取40～50 μm厚切片数片用于DNA含量测定，切取5 μm厚片数片供HE染色及免疫组化染色。
三、DNA含量测定
取40～50 um厚石蜡切片脱蜡，经梯度乙醇至蒸镏水，0.5%胃蛋白酶消化30 min，过滤，离心。加入荧光素吡啶碘(PI)染色10 min，采用FACS流式细胞仪(B.D公司)测定，美国BECTON DICKINSON公司提供DNA专用软件分析处理，并制出DNA直方图，以正常淋巴细胞作为二倍体确定其倍体，计算DNA指数(DI)。
DI＝样品的G0 、G1峰平均道/正常细胞G0、G1 峰道数
, 百拇医药
DI＝1.0±0.1为DNA二倍体，其余均为异倍体。
四、免疫组化法
PCNA染色ABC法按文献常规操作[2]。
第一抗体鼠抗人PCNA单克隆抗体PL-10(Dako公司产品。互作稀释度1∶50)，鼠系ABC药盒为Vector Lab产品，DAB为Sinma公司产品。结果判断及统计细胞核染成棕黄色者PCNA阳性细胞，胞核染成蓝色者为PCNA阴性细胞。用盲法选取有代表性的区域高倍视野计数1 000个细胞，PCNA阳性细胞数，即PCNA指数(PI)：
PI＝(PCNA阳性细胞数/1000个细胞)×100%
PCNA高表达非典型增生在肿瘤边缘0.2 cm之内。
, 百拇医药 五、统计学处理
用SAS统计分析软件，对所测得的数据进行分析。作t检验比较差异的显著性。
结果
一、随访情况
34例患者，完成3年以上随访31例。随访患者中1年内局部复发6例，第二年内局部复发2例，死亡6例，失访2例，失访者按死亡计算。1例62岁伴有冠心病，1年后因心肌梗塞死亡。本组晚期喉癌3年生存率71.0%(22/31)。
二、DNA含量(DI)测定
喉癌边缘不同部位DNA指数如下(
±s): 0 cm处为1.436±0.145, 0.5 cm处为 1.082±0.09, 1.0 cm处为 0.98±0.03。, 百拇医药
对0.5 cm处DNA含量大于1.10的9例患者，经随访证实，术后4例出现复发，其余22例患者术后4例出现肿瘤复发。7例中4例病理组织学分级为3级，3例2级。
统计学处理：喉癌边缘0.5 cm、1.0 cm处粘膜与0 cm处粘膜DNA指数差异有显著性(P<0.01)，0.5 cm处粘膜与1.0 cm处粘膜，DNA指数差异无显著性(P>0.05)。
三、PCNA阳性细胞分布特征
PCNA主要为棕黄色颗粒，定位于细胞核及核仁，胞浆无色。
在肿瘤边缘1.5 cm处，粘膜上皮从单纯增生过渡到基本正常结构，PCNA阳性细胞数量较少，散在分布于上皮基底细胞层。
在肿瘤边缘1.0 cm处粘膜上皮层次增多，排列极向稍乱，核轻中度异常，可见棘细胞层，和角质层增厚的单纯增生改变，PCNA阳性细胞稍增多，可见棘细胞层，有PCNA阳性细胞分布, PCNA指数为8.62±0.78(
±s, %下同)。, 百拇医药
在肿瘤边缘0.5 cm处粘膜上皮，细胞增大，层次增多，排列极向稍乱，核中度异常少见病理核分裂，呈中度非典型增生改变，无间质浸润，PCNA阳性细胞数目增多，层次增加，可见棘细胞层和角质层出现PCNA阳性分布, PCNA指数为17.76±0.23。
在肿瘤边缘0～0.2 cm处，粘膜上皮表现为癌组织，重度非典型增生阶级，PCNA阳性细胞，呈明显阳性表达，全层可见，数目明显增多, PCNA指数为50.32±2.25。
我们对0.5 cm处PCNA指数≥26%的11例患者进行随访，11例患者5例局部复发(45.45%),其余20例有3例(15.00%)。
统计学处理：喉癌边缘1.0 cm、0.5 cm处粘膜与0 cm处粘膜，其PCNA指数差异有显著性(P<0.01)。
讨论
, 百拇医药
传统观点认为：单纯性增生及轻度非典型增生在反复损伤，慢性炎症过程中常可见到，这种变化是可逆的，其恶变率很低，中度非典型增生可发展为重度非典型增生，重度非典型增生则有高度恶变的危险。因此，只有重度非典型才视为癌前病变。本实验从光镜观察，认为肿瘤边缘0.5 cm以内粘膜呈重度、或中度非典型增生，0.5～1 cm呈轻度非典型增生或单纯性增生，大于1.0 cm呈单纯性增生或正常粘膜。
喉癌边缘PCNA、DNA检测表明，1.0 cm、0.5 cm处粘膜与0 cm处粘膜之间细胞的增殖活性存在显著性差异，这证明中、重度非典型增生的上皮细胞在分裂，增殖等生物学行为方面已与轻度非典型增生和单纯性增生不同。我们认为中度非典型增生粘膜应在切除范围之内。单纯依靠形态学很难早期确定交界性病变及非典型病变中的恶性潜能。此外，形态学所采用的非典型增生的分界不能充分反映病变的发展阶级，应用流式细胞术(FCM)可以对这类疾病的诊断提供帮助。有研究表明，在组织形态确定为恶性病变前2年，即可测到DNA的异倍体。研究还显示[3,4]，在喉、食管、口腔等粘膜上皮发生非典型增生病变时，FCM具有预测病变发展及确定早期恶变的意义。我们的观察符合上述研究观点，随着肿瘤边缘靠近癌组织，DI逐渐增加。
, 百拇医药
通过对肿瘤边缘PCNA观察及DNA含量测定我们认为手术切缘应在中度非典型增生的粘膜上皮以外，即0.5 cm以外。0.5 cm处PCNA≥26%和/或DI值大于1.10患者，有局部复发可能，应引起注意。
今后可以对不同类型、分期的喉癌进行探讨。
本课题为山西省自然科学基金项目(941049)
参考文献
1 王运钟.喉癌手术切缘的研究.国外医学耳鼻咽喉学分册，1993,17:13-16.
2 Hsu SM, Raine L, Farger H. Use of Avidin-Biotin peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlablled antibody (PAP) procedure. J Histochem Cytochem , 1981, 29:577-580.
, http://www.100md.com
3 Auffermann W ,Bocking A.Early detection of precancerous lesions in dysplasias , of the lung by , rapid DNA image cytometry. Anal Quant Cytol Histol,1985,7:218-223.
4 Bocking A. DNA measurements.In: GL Wied,ed. Comendium on qualiby assarance proficiency testing and work lod limitation in dinical cytology. Chicago: Tutorids of cytology,1985.170-175.
(收稿:1997-12-14 修回:1998-09-01), 百拇医药